專利名稱：以兩相酶生物傳感器實時監(jiān)測葡萄糖氧化酶活力的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測氧化還原酶催化活性的方法。具體涉及到采用溶液中的葡萄糖氧化酶(GOx)和固定化的辣根過氧化物酶(HRP)所構成的雙相酶生物傳感器對GOx酶的活力進行不間斷監(jiān)測的工藝方法。
背景技術：
GOx酶多是從黑曲霉、青霉素、米曲霉等中提取，已廣泛用于食品加工和血糖的醫(yī)學測量。在食品工業(yè)中，GOx酶已普遍在牛奶、啤酒、水果、肉類等的去氧保鮮，以及蛋類和油炸食品的脫糖等領域得到了應用。在血糖檢測中，葡萄糖傳感器就是將難以直接測定的葡萄糖進行氧化，生成易于測定的02或!1202。O2可利用瓦勃呼吸儀進行測量(第一代傳感器)，而H2O2可以通過在625nm下檢測H2O2與鄰聯甲苯胺的藍色生成物進行測定。后來，用二茂鐵等電子媒介體代替了 O2 (第二代傳感器)，這不僅解決了溶液中溶解氧缺乏的問 題，也使其他電極代替鉬電極成為了可能。有學者將GOx酶和HRP酶同時固定在電極上設計出雙酶傳感器[劉海鷹，鄧家祺·分析化學1995，23 :154-158 ;Lomillo MAA et al.，Anal. Chim. Acta2005,547 :209-214 ；Delvauxa M et al. , Biosens.Bioelec. 2005, 20 1587-1594 ;李春香，曾云龍.分析科學學報 2006，22 :339-341 ;Vanesa Sanz V et al.，Biosens. Bioelec. 2007，22 :2876-2883 ;郭小麗等·物理化學學報 2007，23 :585-589 ;李于善等·化學世界2009，11 :657-664 ;林潔華等·中國科學B輯化學2008，38 :1011-1017 ;李峰等.中國科學B輯化學2009，39 :640-645]。將GOx酶催化產生的H2O2再經HRP酶的催化進一步還原成H2O,同時測量電信號。再后，有人嘗試采用直接電子傳遞法進行測量(第三代傳感器)。作為一類重要的氧化還原酶，對GOx酶的活力測定和反應動力學研究是生物化學、醫(yī)學和食品工業(yè)等領域必不可少的手段。現有的GOx酶活性測定可分為氣壓法、化學滴定法和電極法。其中，氣壓法依據的是以瓦勃呼吸儀測量GOx酶催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸時的耗氧量。化學滴定法是用過量的氫氧化鈉滴定中和生成的葡萄糖酸，然后用鹽酸進行反滴定。氧電極法則是用鉬電極的電化學信號測量H2O2的生成。檢測方法通常分為終態(tài)測量和連續(xù)測量。前者包括氣壓法、顯色法、液相色譜法、傳感器法等，在對糖尿病人的血糖檢測方面，當前普遍使用的血糖儀亦是一種終態(tài)測量方法。這些檢測多是在催化反應進行一段時間后，通過蛋白質變性、冷卻、稀釋等方法停止反應，在反應的終態(tài)對底物或產物進行測量。它們不能對酶活性的實時變化進行連續(xù)跟蹤；而后者包括紫外光譜、熒光光譜、動力學分析等方法，它們可以對酶活性進行連續(xù)跟蹤。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是設計一種兩相雙酶傳感器。本發(fā)明的目的之二是為連續(xù)監(jiān)測葡萄糖氧化酶的活力提供一種實驗方法。
傳統(tǒng)的雙酶傳感器是GOx酶與HRP酶一同固定在電極上，目的是測定葡萄糖的濃度，而不是酶的活力。本發(fā)明所檢測的目標則是溶液中的游離酶。為了達到上述目的，本發(fā)明將GOx酶溶解于電解液中；只將HRP酶固定在電極表面上，形成兩相酶體系。在該體系中，β -D-吡喃葡萄糖分子在GOx酶的催化下被溶液中的溶解氧氧化生成葡萄糖酸和Η202。H2O2進一步被固定在電極上的HRP還原成H2O,而HRP則被氧化成兩種HRP中間體。氫醌分子將HRP氧化中間體重新還原 成HRP，自身氧化成苯醌。苯醌分子在負電極上得到電子重新還原為氫醌，而電極失去電子產生電流。這一連串的反應的總體結果是，GOx酶催化葡萄糖分子氧化為葡萄糖酸，同時產生電流。電流能夠敏感地反映出氧化反應的相對速率，并能夠通過反應速率來計算酶催化活力。具體工藝如下電化學傳感器采用酶生物傳感器三電極系統(tǒng)將玻碳電極作為工作電極，鉬絲作為對電極，甘汞電極(SCE)作為參比電極(附圖I)。將HRP酶與牛血清白蛋白(BSA)混合并覆蓋在玻碳電極上，加入戊二醛使BSA交聯成膜。將酶修飾后的玻碳電極浸入到含有氫醌的電解液中，同時浸入對電極和參比電極。加入微量H2O2，使電化學工作站在-O. 4 O. 2V的電壓范圍內進行循環(huán)伏安掃描，以確定生物傳感器的還原峰值電壓，并在隨后進行電流-時間曲線測定中施加這一電壓。在峰值電壓下，測定電流隨時間的變化，得到背景電流-時間曲線(計時安培線)。在溶液中，加入GOx酶和微量的β-D-吡喃葡萄糖后電流呈現出線性上升的趨勢(附圖2)，這說明酶催化反應已經開始。由于酶催化葡萄糖氧化過程中不斷生成H2O2，其生成的速率等于葡萄糖氧化的速率。而生成的H2O2在HRP酶的催化下將氫醌氧化為苯醌，苯醌可奪取電極上的電子而還原，這樣H2O2在電極表面的濃度正比于電子的流速(即電流)。電流上升的斜率反映了 H2O2濃度的增高。從H2O2濃度上升的速率可計算出葡萄糖氧化酶的活力。攪拌或旋轉圓盤電極可明顯改善傳感器體系的傳質效應，使電極擴散層變薄。對流使H2O2分子更容易接近電極表面，電極表面的H2O2濃度更接近于本體濃度，從而使固定HRP酶的效率上升，輸出電流也隨之整體抬升。但傳質的改善并不影響GOx酶的催化效率。在加入葡萄糖大約20s后，電流則以較慢的速率平穩(wěn)上升，在測試期間(特別是在反應的初期)呈線性。在葡萄糖濃度O. 25、0. 5、0. 75、1和1.25mm0l/L下，斜率分別為-I. 013,-1. 97,-2. 845,-3. 825和-4. 484 μ A/s。它們代表了反應的初速率，并且反映了酶在該底物濃度下的相對活力。傳感器電流⑴上升斜率的變化與β -D-吡喃葡萄糖的濃度[GOx]有關，它符合Michaelis-Menten方程。將附圖2的數據代入Lineweaver-Burk方程，擬合得到直線1/i=O. 24(±1· 79X10_3)/[G0x]+0. 028( + 3. 87X 1(Γ3)，相關系數為 O. 999，ρ < O. 0001，由此得到動力學常數 imax = -O. 24/0. 028 = -3. 57 μ A 和 K111 = 1/0. 24 = 8. 57 X l(T3mol/L。如果標定了在實際葡萄糖濃度下的傳感器電流，并繪制了標準校對曲線，即可將電流值換算成葡萄糖濃度，由此可換算成Michaelis常數Km和最大速率Vmax (轉換數keat)。值得注意的是傳質會影響動力學電流的測量。但根據Levich方程，當攪拌或電極的轉數恒定時，傳質控制電流亦為定值，并不對動力學方程的形式產生影響。本發(fā)明所構建的傳感器提供了一種新型的葡萄糖氧化酶活性檢測方法，特別適用于對酶動力學和酶機理的分析研究，并可對酶活性的變化進行連續(xù)監(jiān)測。本發(fā)明的優(yōu)點在于I.本發(fā)明所述的方法可用于酶活性檢測。為酶活性實驗，特別是為需要對酶活性進行精密的，不間斷的監(jiān)測的研究和應用領域提供了一種新的方法，同時為酶傳感器提供了一種新的應用途徑。2.本發(fā)明所述的方法可對酶動力學、酶抑制和酶催化機理的研究提供一種實驗技術。特別適用于在外界刺激下酶活性的變化進行實時跟蹤。3.本發(fā)明所述的方法也可用于微量葡萄糖濃度的測量，為發(fā)展能夠對血糖進行連續(xù)測量的儀器提供了一種可借鑒的途徑。


圖I是兩相酶傳感器結構示意圖。GOx為葡萄糖氧化酶，HRP為辣根過氧化物酶。圖2描繪了在不同葡萄糖濃度下電流隨時間變化的曲線。在HRP傳感器中，向電解液中加入葡萄糖氧化酶，并分別在不同的測量體系中加入β -D-吡喃葡萄糖，使葡萄糖的濃度分別為O. 25,0. 5,0. 75、I. O和I. 25mmol/L，得到5條以不同斜率上升的計時安培線。
具體實施方式
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實施例I :在修飾前，用砂布上覆蓋O. 05mm的氧化鋁糊漿對玻碳電極的表面進行打磨拋光，隨后分別用丙酮、50% NaOH溶液、50%硝酸、雙蒸水對玻碳電極進行超聲清洗，室溫干燥。將2. 5mg300U/mL HRP 和 4mg BSA 溶于 O. 2mL 的磷酸鹽緩沖液(O. 05mol/L, pH 值7.0)中形成混合液。然后將20 μ L的混合液滴加到玻碳電極表面。再將電極置于一個含有25%戊二醛蒸汽的封閉的容器內進行交聯4h，室溫干燥lh，在4°C下儲藏待用。實施例2 用電化學工作站(ChemLab-IO)和一套常規(guī)的三電極系統(tǒng)進行循環(huán)伏安實驗。其中，以修飾過的玻碳電極作為工作電極；鉬絲作為對電極；飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極；PBS(0. 05mol/L, pH值7· O)作為支持電解液。循環(huán)伏安實驗的電勢掃描范圍(相對于SCE)為-0.4 0.2V，掃描速率100mV/s。實驗在室溫下進行。實施例3 考察底物影響的實驗在盛有IOmL支持電解液的反應池中進行。在攪拌或旋轉圓盤電極作用下，加入O. 2mg/L的GOx (EC1. I. 3. 4，35U/mg，來自黑曲霉)和lmmol/L氫醌，在-O. 25V電壓下記錄初始電流的基線。待基線平穩(wěn)后(約50s后)，分別加入濃度為O. 25、
O.5、0. 75、I和I. 25mmol/L的β -D-吡喃葡萄糖溶液，分別得到呈逐漸上升趨勢的電流_時間曲線。實施例4 求出在反應初期給定葡萄糖濃度下電流-時間曲線上升的斜率。將不同葡萄糖濃度下的斜率代入Lineweaver-Burk方程，即可求出常數imax和Km。如果標定了在實際葡萄糖濃度下的傳感器電流，即可將電流值換算成葡萄糖濃度。
權利要求
1.一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于所述的工藝方法是采用電化學傳感器通過連續(xù)測量葡萄糖氧化反應的速率來獲得葡萄糖氧化酶活力的。
2.根據權利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于電化學酶傳感器是一種兩相酶體系；葡萄糖氧化酶溶解在溶液中，而辣根過氧化物酶固定在電極表面上。
3.根據權利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于辣根過氧化物酶是通過牛血清白蛋白與戊二醛的交聯固定在電極表面上的。
4.根據權利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于溶液中含有作為底物的β-D-吡喃葡萄糖。
5.根據權利要求I所述的一種檢測葡萄糖氧化酶活力的工藝方法，其特征在于溶液中含有作為電子媒介體的氫醌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種電化學測量葡萄糖氧化酶(GOx)催化活性的工藝方法。所述的工藝方法是構建一種兩相酶電化學傳感器通過對H2O2濃度的不間斷測量來實現的，而H2O2濃度的連續(xù)上升則來源于葡萄糖在GOx酶催化下的氧化反應。體系中GOx酶溶解在電解液中，辣根過氧化物酶(HRP)固定在電極上。溶液中的GOx酶將葡萄糖氧化為葡萄糖酸同時生成H2O2。HRP酶則催化氫醌將擴散到電極表面的H2O2還原，而被氧化的氫醌在電極上獲取電子而產生電流。在這一反應序列中，傳感器的輸出電流與葡萄糖和H2O2的濃度有著化學計量關系，由此可計算出GOx酶的活力。此方法可作為GOx酶活力檢測的一種新手段具有靈敏、簡便和設備成本低的特點。
文檔編號G01N27/48GK102901767SQ20121040760
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權日2012年10月24日
發(fā)明者黃積濤, 黃薇, 宮澤, 李敏 申請人:南開大學