專利名稱：基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極、制備方法及應(yīng)用，屬于生物分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是一種嚴重危害人類健康的疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，當今世界每隔6秒就有一個生命被癌癥奪去，使人們談癌色變。癌癥的早期及時診斷和治療為癌癥的治愈提供了很大機會?，F(xiàn)有的癌癥檢測方法有熒光成像，磁共振成像，計算機層析成像，X射線攝影和超聲技術(shù)，但是這些技術(shù)不僅成本高、耗時長、檢測環(huán)境苛刻，而且伴有一定程度的放射性風(fēng)險，因而，開發(fā)一種簡單快速、低成本、高靈敏的檢測方法對于癌癥早期診斷具有重要的意義。電化學(xué)檢測方法由于具有高靈敏度、操作簡單快速、低成本、低能耗等優(yōu)點，在細胞傳感器方面引起了廣泛的研究。電化學(xué)細胞傳感器的制備一般基于監(jiān)測傳感界面的電流或阻抗的信號變化，這些信號變化與細胞的生理狀態(tài)，例如細胞活性、增殖和凋亡以及細胞數(shù)量直接相關(guān)，從而實現(xiàn)對細胞數(shù)量和生理狀態(tài)的檢測。基于細胞本身帶有負電性，通過構(gòu)建正電的電化學(xué)傳感界面，利用靜電吸附實現(xiàn)細胞的固定和檢測。然而這種基于靜電作用只能實現(xiàn)細胞的非特異性固定，多數(shù)應(yīng)用于細胞的生理狀態(tài)監(jiān)測，以及藥物篩選方面的研究，并不能夠滿足細胞選擇性檢測的需求。祀向結(jié)合技術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了細胞傳感器的特異性識別。例如，(ElectrochimicaActa，61，2012, 179-184)文獻公開了基于葉酸功能化的金納米粒子修飾電極檢測癌細胞的方法是利用在電極表面修飾的金納米粒子上修飾具有選擇性識別癌細胞的功能性分子葉酸分子(FA)，電解質(zhì)溶液中加入游離的的氧化還原探針鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀，用于提供電化學(xué)檢測信號，基于葉酸分子對癌細胞的特異性結(jié)合，從而影響電化學(xué)信號的變化實現(xiàn)癌細胞的選擇性檢測。但是，該方法中引入的外部電化學(xué)探針鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀在生理環(huán)境下很容易發(fā)生變質(zhì)，有損細胞和組織的活性，影響檢測結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有癌細胞檢測過程中引入外部化學(xué)物質(zhì)對細胞產(chǎn)生損壞而影響檢測結(jié)果的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極、制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，該方法包括以下步驟(I)制備金納米粒子修飾的電極；(2)將金納米粒子修飾的電極浸入到巰基脂肪酸和二茂鐵基烷基硫醇的混合溶液中，組裝5-12小時，然后浸入到I- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，活化O. 5-2小時，然后浸入到葉酸水溶液中反應(yīng)O. 5-2小時，共價交聯(lián)葉酸分子，取出，用水沖洗電極表面，制得基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。優(yōu)選的是，所述的巰基脂肪酸為含8-16個碳原子的巰基脂肪酸，尤其優(yōu)選8-巰基辛酸，9-巰基壬酸，10-巰基癸酸，11-巰基十一酸，12-巰基十二酸，13-巰基十三酸，14-巰基十四酸，15-巰基十五酸或者16-巰基十六酸。優(yōu)選的是，所述的_■茂鐵基燒基硫醇為含6_11個碳原子的_■茂鐵基燒基硫醇，尤其優(yōu)選6- 二茂鐵基己硫醇，7- 二茂鐵基庚硫醇，8- 二茂鐵基辛硫醇，9- 二茂鐵基壬硫醇，10- 二茂鐵基癸硫醇或者11- 二茂鐵基十一硫醇。優(yōu)選的是，所述的疏基脂肪酸和_■茂鐵基燒基硫醇的混合溶液由疏基脂肪酸和_■茂鐵基烷基硫醇按質(zhì)量比5-10溶于乙醇溶液中制得。優(yōu)選的是，所述的疏基脂肪酸和_■茂鐵基燒基硫醇的混合溶液中，疏基脂肪酸的濃度為1.0-10 mmol/L，二茂鐵基烷基硫醇的濃度為1.0-10 mmol/L。優(yōu)選的是，所述的I-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液由I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺按物質(zhì)的量比1-5溶于水中制得。優(yōu)選的是，所述的I-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽的濃度為10-75 mmol/L, N-輕基琥拍酰亞胺的濃度為10-75 mmol/L。優(yōu)選的是，所述的葉酸水溶液的濃度為50-150 mmol/L。本發(fā)明還提供由上述方法制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。本發(fā)明還提供基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極在檢測癌細胞方面的應(yīng)用，包括以下步驟(I)將基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極與對電極和參比電極組成三電極體系，制得電化學(xué)傳感器；(2)在電解質(zhì)溶液中，采用差分脈沖伏安法，檢測癌細胞。優(yōu)選的是，所述的電解質(zhì)溶液為NaClO4溶液或者KClO4溶液，濃度為0. 05-0. 2mol/L0優(yōu)選的是，所述差分脈沖伏安法，測試參數(shù)為調(diào)整時間為50 ms,間隔時間為0. 5s，調(diào)制振幅為50 mV，階躍電勢為5 mV，掃描范圍為0. 1-0. 7 V。本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明在電極表面修飾的金納米粒子上同時修飾具有選擇性識別癌細胞的功能性葉酸分子(FA)和能夠產(chǎn)生電化學(xué)信號的氧化還原型探針分子二茂鐵基烷基硫醇，基于葉酸分子對癌細胞表面過表達的葉酸受體(FR)的特異性識別，細胞傳感界面能夠選擇性結(jié)合癌細胞，固定在界面上的癌細胞對內(nèi)部的探針分子電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生抑制，引起電化學(xué)信號的降低，實現(xiàn)對癌細胞的選擇性檢測；(2)本發(fā)明的納米尺度的三維金納米粒子具有很大的比表面積，能夠結(jié)合更多的氧化還原探針分子二茂鐵基烷基硫醇，金納米粒子良好的導(dǎo)電性促進了表面固定的探針分子與底部電極間的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，探針分子的固定化避免了外部化學(xué)探針的引入對細胞活性的影響，且納米粒子用于探針的固定化平臺可以實現(xiàn)更多探針固定到電極表面，提高了檢測靈敏度，實現(xiàn)信號放大的效果，可應(yīng)用于癌細胞的早期檢測；(3)本發(fā)明的癌細胞檢測采用差分脈沖伏安法(DPV)，在一分鐘以內(nèi)即可完成電化學(xué)測試，快速的檢測能夠減少長時間電場效應(yīng)降低細胞活性的風(fēng)險，從而進一步提高了檢測靈敏度；(4)本發(fā)明所述一種基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極用于電化學(xué)檢測癌細胞具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)過多次循環(huán)伏安掃描還能夠保持原有的信號強度。
中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極不同掃速下中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在電解質(zhì)溶中Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)/FA工作電極在浸入食鹽


圖I為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)工作電極和對比例I中Au/(MHDA-HT-Fc)工作電極的循環(huán)伏安圖；圖2為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖；圖3為本發(fā)明實施例I的峰電流與掃速的線性關(guān)系；圖4為本發(fā)明實施例I液中連續(xù)電位掃描的循環(huán)伏安5為本發(fā)明實施例I水前后的循環(huán)伏安圖；圖6為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在相同濃度人宮頸癌細胞溶液中孵育不同時間后的DPV響應(yīng)峰電流；圖7為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在不同濃度人宮頸癌細胞溶液中孵育后的DPV響應(yīng)曲線；圖8為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極的DPV歸一化電流與人宮頸癌細胞濃度對數(shù)值的線性關(guān)系曲線；圖9為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極與人胚腎細胞溶液作用前和作用后的DPV響應(yīng)曲線；圖10為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極對混有人胚腎細胞的不同濃度的人宮頸癌細胞溶液的DPV歸一化電流與人宮頸癌細胞濃度對數(shù)值的線性關(guān)系曲線；圖11為本發(fā)明基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備及應(yīng)用的過程圖。
具體實施例方式基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，該方法包括以下步驟(I)制備金納米粒子修飾的電極；(2)將金納米粒子修飾的電極浸入到巰基脂肪酸的濃度為1.0-10 mmol/L和二茂鐵基烷基硫醇的濃度I. 0-10 mmol/L的混合溶液中，組裝5_12小時，然后浸入到1_(3_ 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽的濃度為10-75 mmol/L和N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為10-75 mmol/L的混合溶液中，室溫下活化O. 5-2小時后，然后浸入到濃度為50-150mmol/L的葉酸水溶液中，反應(yīng)O. 5-2小時，共價交聯(lián)葉酸分子，取出，用超純水沖洗電極表面，制得基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。優(yōu)選的是，所述的巰基脂肪酸為含8-16個碳原子的巰基脂肪酸，巰基位于脂肪酸的端基或非端基都可以，位于端基效果更好，所以本發(fā)明尤其優(yōu)選8-巰基辛酸，9-巰基壬酸，10-巰基癸酸，11-巰基i^一酸，12-巰基十二酸，13-巰基十三酸，14-巰基十四酸，15-巰基十五酸或者16-巰基十六酸。優(yōu)選的是，所述的_■茂鐵基燒基硫醇為含6_11個碳原子的_■茂鐵基燒基硫醇，_■茂鐵基位于端基或非端基都可以，位于端基效果更好，所以本發(fā)明尤其優(yōu)選6-二茂鐵基己硫醇，7- 二茂鐵基庚硫醇，8- 二茂鐵基辛硫醇，9- 二茂鐵基壬硫醇，10- 二茂鐵基癸硫醇或者11-二茂鐵基i^一硫醇。優(yōu)選的是，所述的疏基脂肪酸和_■茂鐵基燒基硫醇的混合溶液由疏基脂肪酸和_■茂鐵基烷基硫醇按質(zhì)量比5-10溶于乙醇溶液中制得。優(yōu)選的是，所述的I-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液由I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺按物質(zhì)的量比1-5溶于水中制得。所述的制備金納米粒子修飾的電極的過程為現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供一種制備方法以金球電極為基礎(chǔ)電極，經(jīng)氫焰煅燒清潔后，浸入到濃度為I. 0-10 mmol/L的二硫醇溶液中，室溫下組裝1-4小時后，取出，用大量的乙醇和超純水沖洗電極表面，然后浸入到濃度為0.5-5 nmol/L的金膠體溶液中，室溫下組裝1-3小時，取出，用超純水沖洗電極表面，得到金納米粒子修飾的電極；所述金膠體溶液中，金納米粒子的粒徑優(yōu)選為10-50 nm ；所述二硫醇溶液優(yōu)選由二硫醇溶于乙醇中制得；所述的二硫醇優(yōu)選為1，6- 二巰基己烷。本發(fā)明還提供由上述方法制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極?；谌~酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極在檢測癌細胞方面的應(yīng)用，包括以下步驟(I)將基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極與對電極和參比電極組成三電極體系，制得電化學(xué)傳感器；(2)在電解質(zhì)溶液中，采用差分脈沖伏安法，檢測癌細胞。所述的癌細胞可以為任何葉酸過表達的癌細胞，本發(fā)明實施例提供檢測人宮頸癌細胞(HeLa細胞)、胰腺癌細胞(CFPAc-I)和白血病細胞(HL-60)，但本發(fā)明并不局限于此。優(yōu)選的是，所述的電解質(zhì)溶液為NaClO4溶液或者KClO4溶液，濃度為0. 05-0. 2mol/L0優(yōu)選的是，所述差分脈沖伏安法，測試參數(shù)為調(diào)整時間為50 ms,間隔時間為0. 5s，調(diào)制振幅為50 mV，階躍電勢為5 mV，掃描范圍為0. 1-0. 7 V。
基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備及應(yīng)用的過程如圖11所示。首先，在金電極表面組裝二硫醇分子，得到巰基終端的修飾電極，金納米粒子可以通過Au-S鍵作用結(jié)合到金電極表面，然后在金納米粒子表面通過Au-S鍵作用組裝巰基脂肪酸和二茂鐵基烷基硫醇，帶有羧基功能團的巰基脂肪酸可以通過共價交聯(lián)的方式結(jié)合上葉酸分子，葉酸受體在癌細胞膜表面表現(xiàn)出過表達的特征，葉酸分子對癌細胞表面過表達的葉酸受體具有特異識別性，而表面固定的二茂鐵作為氧化還原型電化學(xué)探針產(chǎn)生電流信號實現(xiàn)對細胞的檢測，基于葉酸分子對葉酸受體的高度親和性，葉酸分子功能化的細胞傳感器能夠特異性識別癌細胞?；谌~酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極檢測癌細胞的機理，表面限定的二茂鐵在支持電解質(zhì)中的氧化還原過程如下- Fe + Xs- — - Fc+X-+ e> 溶劑分子其中，-Fe和-Fe+分別代表二茂鐵基團的還原態(tài)和氧化態(tài)，Xs_代表電解質(zhì)溶液中溶劑化的陰離子，-Fc+F是由二茂鐵陽離子和電解質(zhì)中的陰離子結(jié)合形成的離子對。表面限定的二茂鐵氧化還原過程主要包括兩個過程一個是二茂鐵與底部電極之間發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移，而另一個則為電解質(zhì)溶液的溶劑化陰離子與二茂鐵之間的轉(zhuǎn)移過程；細胞由于具有較大的尺度和較高的電阻(IO2-IO5 Ω)，因而可以當做一種電絕緣材料，一旦細胞被傳感器界面捕獲，吸附在界面上的細胞將會一定程度上致使傳感界面絕緣于電解質(zhì)溶液，這將會阻礙二茂鐵電化學(xué)反應(yīng)過程中的溶劑化陰離子與二茂鐵分子之間的轉(zhuǎn)移過程，從而降低二茂鐵電化學(xué)反應(yīng)的響應(yīng)電流，電流響應(yīng)直接與捕獲的細胞數(shù)量有關(guān)，越多的細胞被捕獲，電流降低越明顯。為使本領(lǐng)域技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合對比例和實施例及附圖進一步說明本發(fā)明。對比例I將金球電極浸入到16-巰基十六酸(MHDA)為8. O mmol/L和6_ 二茂鐵基己硫醇(HT-Fc)為I. 6 mmol/L的混合溶液中，組裝6小時，制備一個MHDA和HT-Fc修飾的金球電極，記為 Au/ (MHDA-HT-Fc)。將Au/ (MHDA-HT-Fc)組裝成工作電極，進行循環(huán)伏安檢測。實施例I結(jié)合圖1-10說明實施例I基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法(I)以金球電極為基礎(chǔ)電極，經(jīng)氫焰煅燒清潔后，將金球電極浸入到I. O mmol/L的1，6-二巰基己烷溶液中，室溫下組裝4小時，取出用大量的乙醇和超純水沖洗電極表面，將所得電極浸入到濃度為4 nmol/L，粒徑為13 nm的金膠體溶液中，室溫下組裝I個小時，取出用純水沖洗電極表面，得到金納米粒子修飾的電極；(2)將得到的金納米粒子修飾的電極浸入到16-巰基十六酸(MHDA)的濃度為8. Ommol/L和6-二茂鐵基己硫醇(HT-Fc)的濃度為1.6 mmol/L的混合溶液中，組裝6小時，記為 Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc);將電極 Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)浸入到 1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽的濃度為75 mmol/L和N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為15 mmol/L的混合溶液中，室溫下活化I小時后，將所得修飾電極浸入到濃度為150mmol/L的葉酸水溶液中反應(yīng)I小時，用超純水沖洗電極表面，制得基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極，記為Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA。將 Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc)和 Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA 組裝成工作電極，進行性能檢測。圖I為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc)工作電極和對比例I中Au/(MHDA-HT-Fc)工作電極在O. I mol/L的NaClO4支持電解質(zhì)溶液中的循環(huán)伏安圖，掃速為80 mV/s ;曲線 a 代表 Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)工作電極，曲線 b 代表 Au/(MHDA-HT-Fc)工作電極；從圖中可以看出，循環(huán)伏安曲線a存在一對電位為O. 37 V的氧化還原峰，這表明HT-Fc中-Fe的還原態(tài)與Fe+氧化態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，對于Au/ (MHDA-HT-Fc)工作電極而言，HT-Fc直接連在金球電極表面，-Fe與底部金電極的距離與傳感器上的相比更近，但是Au/ (MHDA-HT-Fc)工作電極的循環(huán)伏安曲線中的電流響應(yīng)明顯要小于Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)工作電極，說明本發(fā)明的Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA具有良好的信號放大作用。圖2為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖，掃速 a，b，c，d，e，f，g，h 分別代表:20,50,80,100，200，300，400，500 mV/s ;從圖2可以看出，隨著電位掃速的增加，氧化還原峰的峰峰電位差并沒有發(fā)生明顯的變化，峰峰電位差在50 mV/s掃速下為20 mV,當掃速增加到500 mV時，峰峰電位差略增加到32 mV，表明金納米粒子起到了良好的促進電子轉(zhuǎn)移的作用。圖3為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極不同掃速下的峰電流與掃速的線性關(guān)系，從圖3可以看出，當CV掃速在20-500 mV/s之間變化時，F(xiàn)e的峰電流隨著掃速的增加而線性增加，表明Fe在電極表面的電化學(xué)行為是表面控制的過程。圖4 為本發(fā)明實施例 I 中 Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA 工作電極在 O. I mol/L的NaClO4支持電解質(zhì)溶液中連續(xù)電位掃描20圈的循環(huán)伏安圖，掃速為100 mV/s ；圖5為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/Au NPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在浸入O. 9%NaCl溶液前后在O. I mol/L的NaC104支持電解質(zhì)溶液中的循環(huán)伏安圖，掃速100 mV/s，曲線a為Au/HDT/Au NPs/(MHDA-HT-Fc)/FA工作電極浸入0. 9% NaCl溶液之前的循環(huán)伏安圖，曲線b為Au/HDT/Au NPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在浸入0. 9% NaCl溶液中I小時之后取出后測定的循環(huán)伏安圖；從圖4和圖5中可以看出，在上述兩個過程中，電流均未發(fā)生明顯的變化，證明本發(fā)明的Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA具有較好的穩(wěn)定性。圖6為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在10 4cells/mL的人宮頸癌細胞溶液中孵育不同時間后，在0. I mol/LNaC104支持電解質(zhì)溶液中的DPV響應(yīng)峰電流，孵育時間分別為0，5，10, 15，20, 30 min ;從圖6可以看出，電流響應(yīng)信號在開始的5分鐘孵育時間內(nèi)顯著降低，在孵育10-30分鐘的時間達到一個穩(wěn)定的平臺，說明孵育時間10分鐘已可用于檢測。圖7為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極在不同濃度人宮頸癌細胞溶液中孵育后的DPV響應(yīng)曲線，支持電解質(zhì)為0. I mol/L NaClO4溶液，a, b，c，d，e，f，g 分別代表細胞濃度為0，10，IO2, IO3, IO4, IO5, IO6 cells/mL ;從圖 7 可以看出，隨著人宮頸癌細胞濃度的增大，DPV峰電流響應(yīng)逐漸降低，檢測范圍最低可以達到10cells/mL。圖8為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極的歸一化電流與人宮頸癌細胞濃度對數(shù)值的線性關(guān)系曲線，所述的歸一化電流為DPV電流響應(yīng)的比* (Iblank ^HeL a)/ (Iblimk-Iia6IfeLa)，其中Iblmk和IlfeLa分別代表細胞傳感器在一定濃度的細胞懸濁液中孵育前后的DPV峰電流響應(yīng)，11(|6_代表傳感器在濃度為IO6 cells/mL的細胞懸濁液中孵育后的DPV峰電流響應(yīng)；從圖8可以看出，在細胞濃度IO-IO6ceIlsAiL范圍里，(Iblank-IHeJ / (Ibla^I lO^eJ的比值與細胞濃度的對數(shù)之間展現(xiàn)了很好的線性關(guān)系，表明制備的傳感器在較寬的濃度范圍內(nèi)(10-106 cells/mL)對人宮頸癌細胞具有一個很好的檢測效果和一個非常低的檢測限(10 cells/mL);較小的誤差線(error bar)說明該細胞傳感器的制備表現(xiàn)出很好的重現(xiàn)性。 圖9為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極與10 4cells/mL的人胚腎細胞溶液作用前和作用后在O. I mol/1 NaClO 4溶液中的DPV響應(yīng)曲線，曲線a為Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)/FA工作電極與IO4 cells/mL的人胚腎細胞溶液作用前在 O. I mol/1 NaClO 4 溶液中的 DPV 曲線，曲線 b 為 Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極與IO4 cells/mL的人胚腎細胞溶液作用后在O. I mol/1 NaClO4溶液中的DPV曲線；從圖9可以看出，Au/HDT/AuNPs/(MHDA-HT-Fc)/FA工作電極與IO4 cells/mL的人胚腎細胞溶液作用前和作用后，DPV信號沒有明顯的變化，然而，IO4 cells/mL的人宮頸癌細胞可使其DPV信號大幅度減弱，因此，傳感界面并不能夠結(jié)合普通的膜表面葉酸受體匱乏的人胚腎細胞，因而能夠很好的分辨癌細胞與普通細胞，實現(xiàn)癌細胞的選擇性檢測。圖10為本發(fā)明實施例I中Au/HDT/AuNPs/ (MHDA-HT-Fc) /FA工作電極對混有人胚腎細胞(IO4 cells/mL)的不同濃度人宮頸癌細胞溶液的DPV歸一化電流與人宮頸癌細胞濃度對數(shù)值的線性關(guān)系曲線；從圖10可以看出，在人宮頸癌細胞濃度IO-IO6ceIlsAiL范圍內(nèi)，(Iblank-U / (Iblank-IlO6HeLa)的比值與人宮頸癌細胞濃度的對數(shù)呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，表明人胚腎細胞的存在不會對人宮頸癌細胞的檢測產(chǎn)生干擾。實施例2基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法(I)以金球電極為基礎(chǔ)電極，經(jīng)氫焰煅燒清潔后，將金球電極浸入到10 mmol/L的1，6-二巰基己烷溶液中，室溫下組裝I小時，取出用大量的乙醇和超純水沖洗電極表面，將電極浸入到濃度為I nmol/L,粒徑為50 nm的金膠體溶液中，室溫下組裝2個小時,取出用純水沖洗電極表面，得到的金納米粒子修飾的電極；(2)將金納米粒子的修飾電極浸入到14-巰基十四酸的濃度為10 mmol/L和10- 二茂鐵基癸硫醇的濃度為I. O mmol/L的混合溶液中組裝10小時，將所得電極浸入到I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽的濃度為25 mmol/L和N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為25 mmol/L的混合溶液中，室溫下活化2小時后，將所得修飾電極浸入到濃度為50 mmol/L的葉酸水溶液中反應(yīng)2小時，用超純水沖洗電極表面，得到基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。實施例3基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法
(I)以金球電極為基礎(chǔ)電極，經(jīng)氫焰煅燒清潔后，將金球電極浸入到5 mmol/L的1，6- 二巰基己烷溶液中，室溫下組裝2小時，取出用大量的乙醇和超純水沖洗電極表面，將電極浸入到濃度為2. 5 nmol/L，粒徑為25 nm金膠體的溶液中，室溫下組裝3小時，取出用超純水沖洗電極表面，得到的金納米粒子修飾的電極；(2)將得到的金納米粒子修飾的電極浸入到8-巰基辛酸的濃度為8. O mmol/L和6- 二茂鐵基己硫醇的濃度為I. O mmol/L的混合溶液中，組裝8小時，將電極浸入到1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽的濃度為50 mmol/L和N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為15 mmol/L的混合溶液中，室溫下活化I. 5小時后，將所得電極浸入到濃度為100 mmol/L的葉酸水溶液中反應(yīng)I. 5小時，用超純水沖洗電極表面，得到基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。實施例4基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極檢測人宮頸癌細胞(HeLa細胞)的應(yīng)用(I)將實施例I制得的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極和鉬片作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極組成三電極體系，制得電化學(xué)傳感器；(2)在0. I mol/L的NaClO4電解質(zhì)溶液中，采用差分脈沖伏安法，檢測人宮頸癌細胞；差分脈沖伏安法的測試參數(shù)為調(diào)整時間為50 ms，間隔時間為0.5 S，調(diào)制振幅為50mV，階躍電勢為5 mV，掃描范圍為0. 1-0.7 V。經(jīng)測試證明，實施例I制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極電化學(xué)檢測人宮頸癌細胞(HeLa細胞)，具有高的檢測靈敏度，良好的選擇性和穩(wěn)定性。實施例5基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極檢測胰腺癌細胞的應(yīng)用(I)將實施例2制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極和鉬片作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極組成三電極體系，制得電化學(xué)傳感器；(2)在0. 05 mol/L的NaClO4電解質(zhì)溶液中，采用差分脈沖伏安法，檢測胰腺癌細胞；差分脈沖伏安法的測試參數(shù)為調(diào)整時間為50ms，間隔時間為0. 5 S，調(diào)制振幅為50mV，階躍電勢為5 mV，掃描范圍為0. 1-0.7 V。經(jīng)測試證明，實施例2制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極電化學(xué)檢測胰腺癌細胞(CFPAc-I)，具有高的檢測靈敏度，良好的選擇性和穩(wěn)定性。實施例6基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極檢測白血病細胞(HL-60)細胞的應(yīng)用(I)將實施例3制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極和鉬片作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極組成三電極體系，制得電化學(xué)傳感器；(2)在0. 2 mol/L的KClO4電解質(zhì)溶液中，采用差分脈沖伏安法，檢測白血病細胞(HL-60)細胞；差分脈沖伏安法的測試參數(shù)為調(diào)整時間為50 ms,間隔時間為0. 5 S，調(diào)制振幅為50 mV，階躍電勢為5 mV，掃描范圍為0. 1-0. 7 V。經(jīng)測試證明，實施例3制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極電化學(xué)檢測白血病細胞(HL-60)，具有高的檢測靈敏度，良好的選擇性和穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)制備金納米粒子修飾的電極；(2)將金納米粒子修飾的電極浸入到疏基脂肪酸和_■茂鐵基燒基硫醇的混合溶液中，組裝5-12小時，然后浸入到I- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，活化O. 5-2小時，然后浸入到葉酸水溶液中反應(yīng)O. 5-2小時，共價交聯(lián)葉酸分子，取出，用水沖洗電極表面，得到基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，其特征在于，所述的巰基脂肪酸為8-巰基辛酸，9-巰基壬酸，10-巰基癸酸，11-巰基i^一酸，12-巰基十二酸，13-巰基十三酸，14-巰基十四酸，15-巰基十五酸或者16-巰基十六酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，其特征在于，所述的二茂鐵基烷基硫醇為6- 二茂鐵基己硫醇，7- 二茂鐵基庚硫醇，8- 二茂鐵基辛硫醇，9- 二茂鐵基壬硫醇，10- 二茂鐵基癸硫醇或者11- 二茂鐵基i^一硫醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，其特征在于，所述的疏基脂肪酸和_■茂鐵基燒基硫醇的混合溶液是由疏基脂肪酸和二茂鐵基烷基硫醇按質(zhì)量比5-10溶于乙醇溶液中制得，混合溶液中，巰基脂肪酸的濃度為1.0-10 mmol/L，二茂鐵基烷基硫醇的濃度為1.0-10 mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，其特征在于，所述的I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液是由I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺按物質(zhì)的量比1-5溶于水中制得，混合溶液中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽的濃度為10-75 mmol/L，N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為10-75 mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法，其特征在于，所述的葉酸水溶液的濃度為50-150 mmol/L。
7.權(quán)利要求1-6任何一項所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極的制備方法制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極。
8.權(quán)利要求7所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極在檢測癌細胞方面的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟(1)將基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極與對電極和參比電極組成三電極體系，制得電化學(xué)傳感器；(2)在電解質(zhì)溶液中，采用差分脈沖伏安法，檢測癌細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極在檢測癌細胞方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的電解質(zhì)溶液為NaClO4溶液或者KClO4溶液，濃度為0.05-0. 2mol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極在檢測癌細胞方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的差分脈沖伏安法，測試參數(shù)為調(diào)整時間為50 ms,間隔時間為0. 5 S，調(diào)制振幅為50 mV，階躍電勢為5 mV，掃描范圍為0. 1-0. 7 V。
全文摘要
基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極、制備方法及應(yīng)用，解決了現(xiàn)有電化學(xué)檢測癌細胞技術(shù)引入外界物質(zhì)損傷細胞、影響檢測結(jié)果的問題，該電極是通過將金納米粒子修飾的電極浸入到巰基脂肪酸和二茂鐵基烷基硫醇的混合溶液中，組裝5-12小時，然后浸入到1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，室溫下活化0.5-2小時，然后浸入到葉酸水溶液中反應(yīng)0.5-2小時，共價交聯(lián)葉酸分子后，用超純水沖洗電極表面而制得的。本發(fā)明制備的基于葉酸和二茂鐵功能化的金納米粒子修飾的電極用于檢測癌細胞靈敏度高，具有良好的選擇性和穩(wěn)定性。
文檔編號G01N27/30GK102944595SQ20121043613
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者劉吉洋, 徐善玲, 汪天書, 劉亞青, 汪爾康 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所