專利名稱：一種評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種模式生物評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，具體涉及一種用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法。
背景技術(shù)：
活性篩選一直是藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)理、質(zhì)量控制、 炮制機(jī)理、配伍規(guī)律等關(guān)鍵領(lǐng)域的不可或缺手段，活性篩選新模型、新方法的研究是中藥研究的重要組成部分。
骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)異常和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一類疾病，由于西藥長(zhǎng)期應(yīng)用副作用大等缺陷，中藥治療骨質(zhì)疏松的功效正日益受到重視。 但壯骨中藥及其成分特別是微量成分的活性評(píng)價(jià)卻不能高效進(jìn)行，主要存在2個(gè)瓶頸問題一是評(píng)價(jià)模型問題現(xiàn)有動(dòng)物壯骨模型耗時(shí)長(zhǎng)，用樣量大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，使得活性篩選效率低；現(xiàn)有細(xì)胞模型成本高，試驗(yàn)條件要求較高，原代培養(yǎng)難度增加，一般的實(shí)驗(yàn)室不能進(jìn)行，此外，體外細(xì)胞模型作用環(huán)節(jié)相對(duì)單一，不能體現(xiàn)在體試驗(yàn)的綜合效果；二是化合物的數(shù)量問題由于中藥成分復(fù)雜，很難分離到能滿足體內(nèi)研究的足量化合物，大量的微量成分只能通過細(xì)胞模型進(jìn)行篩選?？梢?，現(xiàn)有模型難以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥及其成分壯骨活性的高效、 靈敏、高通量的篩選。
模式生物是指在人們研究生命現(xiàn)象過程中長(zhǎng)期、反復(fù)作為研究材料的物種，從這個(gè)物種研究中得出的許多生命活動(dòng)規(guī)律往往代表了許多物種共同的規(guī)律。其中斑馬魚是一種極好的模式生物，是取代青蛙、果蠅、小白鼠等作為研究對(duì)象的優(yōu)良試驗(yàn)?zāi)Ｊ紧~。斑馬魚喂養(yǎng)和維持的費(fèi)用更便宜，所需空間場(chǎng)地不大，易于室內(nèi)大規(guī)模飼養(yǎng)繁殖。成體魚長(zhǎng)3 4cm，養(yǎng)殖成本僅為養(yǎng)小鼠的O. 1%_1%。斑馬魚同人類基因的相似度與小鼠相當(dāng)，且在蛋白質(zhì)水平上，其關(guān)鍵部位的同源性幾乎是100%，所以可用斑馬魚模擬人類疾病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol, 4, 504-12 (2004)]。目前，人們已成功的用斑馬魚建立許多人類疾病模型，如神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、聽覺、視覺、癌癥等方面的疾病[S. Sumanas and S. Lin, DDT: TARGETS, 3，89-96 (2004)]。如中國(guó)專利 200810019040. 5 公開了一種用斑馬魚研究藥物毒性的方法，CN101810866A公開了一種用模式生物斑馬魚篩選抗肝損傷藥物的方法，200310108710. 8公開了利用斑馬魚基因治療截癱等疾病，201010258459. 3公開了一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法。斑馬魚與哺乳動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理極為相似，而且近年來越來越多的調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物骨骼發(fā)育關(guān)鍵基因的同源基因在斑馬魚基因組中被發(fā)現(xiàn)。和哺乳動(dòng)物一樣，斑馬魚的骨骼是從三種胚胎干細(xì)胞系發(fā)育而來，已有研究表明斑馬魚幼魚骨包含骨形成和骨吸收活動(dòng)所需的細(xì)胞，是較完整體系。骨骼形成機(jī)制也包括軟骨內(nèi)骨化和膜內(nèi)骨化，其過程都受到包括一系列轉(zhuǎn)錄因子和激素在內(nèi)的復(fù)雜機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控，參與調(diào)控的關(guān)鍵基因，如runx2, osteonectin, osteoprogenin等與哺乳動(dòng)物的相關(guān)基因具有高度的同源性。哺乳動(dòng)物與斑馬魚頭部骨骼生成所涉及到的轉(zhuǎn)錄因子具有極其相似的表達(dá)機(jī)制和調(diào)控方式[Li N, Felber K, Elks P, Croucher P and Roehl HH. DevDyn, 238 (2)，459-466(2009)]。斑馬魚具有與哺乳動(dòng)物相似的調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的關(guān)鍵基因，具有與哺乳動(dòng)物相似的骨骼形成機(jī)制，以及與哺乳動(dòng)物相似的系統(tǒng)、酶系及基因，為研究人類許多常見疾病的發(fā)病機(jī)制提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，同時(shí)也為藥物的作用機(jī)制、安全性評(píng)價(jià)及代謝研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｒ虼丝蓪⑺鳛榫哂型暾趋荔w系的理想模式生物用于藥物對(duì)骨骼的作用研究。國(guó)內(nèi)在這方面的研究尚屬空白。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作方便、成本低、化合物用量少、勞動(dòng)強(qiáng)度低，且僅需在一般實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行的模式生物斑馬魚模型來快速評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松的藥物作用效果。
本發(fā)明的思路為利用茜素紅作為染色劑給斑馬魚加以染色并可反映出機(jī)體內(nèi)骨礦化量和骨密度的機(jī)理為茜素紅與鈣離子形成螯合物，使礦化的骨基質(zhì)染成紅色；再用專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算茜素紅染色區(qū)域的面積和累積光密度，以分別反應(yīng)骨礦化量和骨密度，計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行檢驗(yàn)；從而可以利用本方法來觀察和評(píng)估防治骨質(zhì)疏松藥物作用的效果。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為本發(fā)明這種用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，它包括以下步驟步驟一斑馬魚受精卵的收集控制斑馬魚成魚日夜節(jié)律，晝夜時(shí)間控制在14-12小時(shí)10-12小時(shí)，收集受精卵，置于培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基(5mM NaCl, O. 17mM KCl, O. 33mM CaCl2, O. 33mM MgSO4, 10_5%亞甲基藍(lán))。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度26° C_30° C。
步驟二 給藥方案方案一取受精后3天(3 dpf)斑馬魚胚胎放入盛有胚胎培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，根據(jù)培養(yǎng)板孔的大小每孔加入培養(yǎng)基O. 1-2 mL，每個(gè)孔里放1-10條幼魚，分為數(shù)組，每組5_15條幼魚，溶媒陰性對(duì)照組和測(cè)試藥物組。從4 dpf或5 dpf開始加入溶媒和測(cè)試藥物，加藥方法是吸凈培養(yǎng)板孔里的培養(yǎng)基后迅速加入溶液，每個(gè)藥物濃度做2或3份，溶媒對(duì)照濃度與藥物測(cè)試組的溶媒濃度相當(dāng)，將培養(yǎng)板密封放入26° C-30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)周期5-7天，每天將每個(gè)孔里的溶液吸出一半，加入等體積新溶液，培養(yǎng)至斑馬魚胚胎受精后 9-11天或者10-12天。
方案二 取受精后3天(3 dpf)斑馬魚胚胎放入盛有胚胎培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)基O. l_2mL，根據(jù)培養(yǎng)板孔的大小每個(gè)孔里放1-10條幼魚，分為數(shù)組，每組5-15條魚， 溶媒陰性對(duì)照組、模型藥物組(潑尼松龍或地塞米松)和測(cè)試藥物組。造模藥和溶媒從4 dpf或5 dpf開始加入,測(cè)試藥可與模型藥同時(shí)在4 dpf或者5 dpf加入,也可在模型藥物加入48小時(shí)后加入，加藥方法同“方案一”，即吸凈培養(yǎng)孔板里的培養(yǎng)基后迅速加入溶液， 每個(gè)藥物濃度做2或3份，溶媒對(duì)照濃度與藥物測(cè)試組的溶媒濃度相當(dāng)，將培養(yǎng)板密封放入 26° C-30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)周期5-7天，每天將每個(gè)孔里的溶液吸出一半，加入等體積新溶液，培養(yǎng)至斑馬魚胚胎受精后9-11天或者10-12天。
步驟三斑馬魚骨骼茜素紅染色將培養(yǎng)至受精后9-11天或者10-12天的斑馬魚幼魚用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)處死，然后將幼魚固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中2-3 h。將固定液4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液去除，然后將斑馬魚幼魚置于50% 乙醇中10 min，去除乙醇，加入用O. 5%K0H配制的茜素紅染色液，放置過夜，去除染色液，加入超純水洗去多余的染液后加入新鮮配制的漂白劑(1.5%H202和1%K0H)，放置20 min-2 h， 去除漂白劑后，加入3:1的O. 5%K0H和甘油的混合溶液30 min-8 h，然后更換溶液為I: I的0.5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后更換溶液為1:3的O. 5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h,最后保存于純甘油中。
步驟四斑馬魚骨骼染色的檢測(cè)與分析用倒置顯微鏡觀察步驟三中茜素紅染色的斑馬魚頭骨腹面，用成像軟件采集圖像(放大100倍)，所有的圖像均采用相同的光強(qiáng)度和曝光設(shè)置。用專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算茜素紅染色區(qū)域的面積和累積光密度(IOD)，以分別反應(yīng)骨礦化量和骨密度。計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。
作為優(yōu)選方案，以上所述的模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用的新方法，其中步驟二中的溶媒陰性對(duì)照組、模型藥物組和測(cè)試藥物組均平行設(shè)3個(gè)組，保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性。
作為優(yōu)選方案，其中步驟一和步驟二所述的培養(yǎng)溫度為28° C_29° C。
作為優(yōu)選方案，其中步驟二所述的培養(yǎng)板為96孔、48孔、24孔、12孔或6孔培養(yǎng)板，其中較優(yōu)的為24孔板，每孔加入培養(yǎng)基O. 5-1. 5mL，每孔放5_10條幼魚。
作為優(yōu)選方案，其中步驟二所述的溶媒為水或者是含有(Tl% 二甲基亞砜(DMSO) 助溶劑的水溶液。對(duì)于水溶性較差的藥物，采用二甲基亞砜助溶，可以有效提高藥物的水溶性，使藥物均勻分散于水溶中。
作為優(yōu)選方案，步驟二的方案一所述的測(cè)試藥不含造模藥(潑尼松龍或地塞米松)；步驟二的方案二所述的測(cè)試藥含有造模藥(潑尼松龍或地塞米松)，且所含造模藥的濃度與模型組的造模藥濃度相同。
作為優(yōu)選方案，步驟二中斑馬魚魚齡選擇受精后3天的斑馬魚幼魚，溶媒和藥物從斑馬魚受精后4天或者受精后5天開始加入，培養(yǎng)周期為5天，培養(yǎng)至受精后9天或者10天。
作為優(yōu)選方案，步驟二中方案二的測(cè)試藥加入有兩種方法一種是與溶媒或模型藥物的加入方法相同，在斑馬魚幼魚4 dpf或者5 dpf加入；另一種是在模型藥誘導(dǎo)48小時(shí)后加入測(cè)試藥。均培養(yǎng)至受精后9天或者10天。
作為優(yōu)選方案，以上所述的評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用的模式生物斑馬魚新方法，其中步驟三中采用斑馬魚骨骼茜素紅染色，茜素紅骨骼固定染色是經(jīng)典、可靠、組織特異性強(qiáng)的染色方法，不僅可對(duì)幼魚染色，也可分析成魚骨骼。
作為優(yōu)選方案，以上所述的評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用的模式生物斑馬魚新方法，用倒置顯微鏡觀察茜素紅染色的斑馬魚頭骨腹面，并采集頭部骨骼圖像。
作為優(yōu)選方案，步驟四中分析茜素紅染色的面積采用專業(yè)圖像分析軟件Image pro plus 6. O進(jìn)行分析，首先對(duì)茜素紅染色的區(qū)域的色調(diào)，飽和度和強(qiáng)度設(shè)定一個(gè)閾值，樣品閾值設(shè)定后應(yīng)用于同一板幼魚的其他所有圖像中，再計(jì)算圖像茜素紅染色區(qū)域的面積和累積光密度(IOD)，作為斑馬魚骨骼的檢測(cè)指標(biāo)，來反應(yīng)骨骼礦化量。
作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用的模式生物斑馬魚新方法，篩選的受試藥物可為化學(xué)藥品、中藥及其提取物、中藥復(fù)方及其提取物、天然藥物，或它們的組合物，作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述的受試藥物為鮭魚降鈣素、依替膦酸二鈉、續(xù)斷提取物、續(xù)斷皂苷類及淫羊藿黃酮類化合物等。
地塞米松為腎上腺皮質(zhì)激素類藥。具有抗炎、抗過敏、抗風(fēng)濕、免疫抑制等作用，長(zhǎng)期使用有骨質(zhì)疏松及骨折的副作用，是大鼠骨質(zhì)疏松模型常用造模藥物。
潑尼松龍為腎上腺皮質(zhì)激素類藥物。具有抗炎、抗過敏和抑制免疫等多種藥理作用，長(zhǎng)期使用也會(huì)產(chǎn)生骨質(zhì)疏松的副作用，也是大鼠骨質(zhì)疏松模型常用的造模藥物。
故本發(fā)明選擇地塞米松和潑尼松龍為誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松的模型藥物。
鮭魚降鈣素是調(diào)節(jié)鈣代謝，抑制甲狀旁腺素的激素之一，它能顯著地降低高周轉(zhuǎn)性骨病的骨鈣丟失，如骨質(zhì)疏松癥，它能抑制破骨細(xì)胞活性，同時(shí)刺激成骨細(xì)胞形成，也能抑制溶骨作用。臨床用于骨質(zhì)疏松癥和痛性骨病等。
依替膦酸二鈉是抗骨質(zhì)疏松藥，為骨吸收抑制劑。在低劑量時(shí)，通過抑制破骨細(xì)胞活性，防止骨的吸收、降低骨轉(zhuǎn)換率而達(dá)到骨鈣調(diào)節(jié)作用。
故本發(fā)明選擇鮭魚降鈣素、依替膦酸二鈉為西藥代表測(cè)試藥。
續(xù)斷是傳統(tǒng)壯骨中藥，具補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、調(diào)血脈、續(xù)折傷及止崩漏之功效。用于腰背酸痛；肢節(jié)痿痹；跌撲創(chuàng)傷、損筋折骨、胎動(dòng)漏紅、血崩、遺精、癰疽?guī)?、瘡腫，臨床在骨傷科用藥非常廣泛，續(xù)斷中主要含有三萜皂苷類、生物堿類和環(huán)烯醚萜類等成分，續(xù)斷能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖，防止成骨細(xì)胞凋亡[程志安，吳燕峰，黃智清，曾志勇， 謝文峰，羅懿明，蕭勁夫和劉尚禮.中醫(yī)正骨，16(16)，1-3 (2004)]，其中皂苷類化合物是續(xù)斷促進(jìn)骨損傷愈合作用的活性組分，川續(xù)斷皂苷VI是主要活性皂苷，具有促進(jìn)人骨髓間充值細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的活性[武密山，趙素芝，任立中，王茹，白霞，韓紅偉和李彬.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，28(28)，222-6 (2012)]。
淫羊藿也是知名傳統(tǒng)壯骨中藥，具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的功效。用于腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣。淫羊藿中主要含黃酮類化合物、生物堿、揮發(fā)油等成分，其中淫羊藿總黃酮具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的功能，黃酮單體具有抗骨質(zhì)疏松作用，如淫羊藿苷元及其苷類在體外具有促進(jìn)成骨細(xì)胞活性、抑制破骨細(xì)胞活性的作用[J Huang, L Yuan, X Wang, TL Zhang and K Wang. Life sciences, 81(81)，832-40 (2007)]o
故本發(fā)明選擇續(xù)斷、淫羊藿及其活性成分為中藥代表測(cè)試藥。
與小鼠、大鼠、犬等哺乳動(dòng)物不同，斑馬魚的體積較小，口服或注射給藥方式很困難，因此，步驟二中本發(fā)明將受試藥物溶解于斑馬魚所生活的溶媒中，斑馬魚會(huì)自主的通過腔道和皮膚連續(xù)的從溶液中吸收受試藥物。
有益效果本發(fā)明提供的評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的模式生物斑馬魚新方法和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的模式生物斑馬魚新方法，選用斑馬魚作為模型動(dòng)物，通過優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)分組方法，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是對(duì)斑馬魚魚齡的優(yōu)選、藥物給藥方式和給藥時(shí)間的優(yōu)選、斑馬魚骨骼染色、顯微檢測(cè)、圖像捕獲及圖像軟件分析骨礦化量的優(yōu)選，整個(gè)實(shí)驗(yàn)方法條件簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，能客觀的反應(yīng)藥物對(duì)斑馬魚骨骼作用的真實(shí)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，能克服一般體外成骨和破骨細(xì)胞活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)條件苛刻、難以體現(xiàn)在體效應(yīng)綜合結(jié)果的缺點(diǎn)，且能克服一般體內(nèi)防治骨質(zhì)疏松藥效實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、所用藥量大、勞動(dòng)強(qiáng)度大的缺點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)方法可重復(fù)性強(qiáng)，尤其是所需受試藥物量少 (μ g mg數(shù)量樣品)，成本低，勞動(dòng)強(qiáng)度低，應(yīng)用范圍廣泛，且可在培養(yǎng)板中高通量成批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，工作效率高。



圖1 O. 5%DMS0溶媒對(duì)照組斑馬魚骨檢測(cè)照片圖2模型藥物組(10 μ M地塞米松)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖3模型藥物組(10 μ M潑尼松龍)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖4模型藥物組(25 μ M潑尼松龍)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖5依替膦酸二鈉組(15 μ g/mL依替膦酸二鈉)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖6依替膦酸二鈉組(含10 μ M地塞米松的15 μ g/mL依替膦酸二鈉)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖7依替膦酸二鈉組(含10 μ M潑尼松龍的30 μ g/mL依替膦酸二鈉)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖8鮭魚降鈣素組(含25 μ M潑尼松龍的8. 3 n g/mL鮭魚降鈣素)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖9淫羊藿苷組(含10 μ M潑尼松龍的20 ng/mL淫羊藿苷)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖10淫羊藿總黃酮組(10 ng/mL淫羊藿總黃酮)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖11川續(xù)斷皂苷VI組(含25 μΜ潑尼松龍的25 ng/mL川續(xù)斷皂苷VI )斑馬魚骨檢測(cè)照片圖12續(xù)斷總皂苷組(含10 μ M潑尼松龍的100 ng/mL續(xù)斷總皂苷)斑馬魚骨檢測(cè)照片圖13空白培養(yǎng)基組斑馬魚骨檢測(cè)照片圖14續(xù)斷總提物組(25 ng生藥/mL續(xù)斷總提物)斑馬魚骨檢測(cè)照片具體實(shí)施方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的樣品濃度、給藥方式與方法、斑馬魚骨骼染色與檢測(cè)條件及斑馬魚骨礦化分析方法與結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例一地塞米松誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生骨質(zhì)疏松1.材料與儀器受試藥物地塞米松配制方法精密稱取地塞米松適量，加入少量DMSO使溶解，用培養(yǎng)基配制成I μ M、2. 5 μ MUO μ M 和 25 μ M 的 O. 5%DMS0 的溶液。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚成魚(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)。
試劑地塞米松(sigma-aldrich，批號(hào)077K10501 ；彡97%);茜素紅S(鄭州四季化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)Sj20110806);多聚甲醛(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100504) ；MS-222 (Acros Organics，批號(hào)A0288328)。
儀器ZEISS熒光倒置顯微鏡Axio observer. Al (蔡司光學(xué)儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司)；生化培養(yǎng)箱SPX-80 (寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)。
相關(guān)軟件圖像采集軟件AxioVisionRel. 4. 6 ;圖像分析軟件Image pro plus 6. O2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1給藥將3 dpf (受精后3天)的斑馬魚胚胎放入盛有胚胎培養(yǎng)基的24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基I mL，每孔放5條幼魚，10-15條魚/組，分為模型藥物組(地塞米松)、溶媒陰性 (O. 5%DMS0)對(duì)照組，每組做2份。從4 dpf開始加入藥物(I μΜ、2. 5 μ MUO μ M和25 μ M地塞米松和O. 5%DMS0)，吸凈24孔板里的培養(yǎng)基后迅速加入溶液，將24孔板密封放入 28.5° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)周期5天，每天將每個(gè)孔里的溶液用移液槍吸出一半，加入等體積新溶液，培養(yǎng)至斑馬魚胚胎9 dpf。
2. 2斑馬魚骨骼染色培養(yǎng)9 dpf的斑馬魚置于MS-222中麻醉致死，去除MS-222溶液，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定2 h-3 h，去除4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定液，置于50%乙醇中10 min, 去除乙醇,加入用O. 5%K0H配制的菌素紅染色液,放置過夜,去除染色液,加入超純水洗去多余的染液后加入新鮮配制的漂白劑(1. 5%H202和1%K0H)，放置20 min-2 h，去除漂白劑后，加入3:1的O. 5%K0H和甘油的混合溶液30 min-8 h，然后更換溶液為1:1的O. 5% KOH 和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后更換溶液為1:3的O. 5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后保存于純甘油中。
2. 3染色的礦化骨骼定量分析用ZEISS熒光倒置顯微鏡觀察茜素紅染色的斑馬魚頭骨腹面，用AxioVisionRel. 4. 6 成像軟件采集圖像(100倍)，所有的圖像均采用相同的光強(qiáng)度和曝光設(shè)置。用專業(yè)圖像分析軟件Image pro plus 6. O計(jì)算菌素紅染色區(qū)域的面積和累積光密度(I0D),以分別反應(yīng)骨礦化量和骨密度。用Excel軟件計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行t-檢驗(yàn)。
2. 4斑馬魚骨骼染色的顯微檢測(cè)重復(fù)性對(duì)斑馬魚幼魚骨骼染色后，將一條幼魚用熒光倒置顯微鏡觀察，捕獲、采集圖像。再將幼魚轉(zhuǎn)移到新的孔中，重新定位后再次進(jìn)行圖像的捕獲、采集。重復(fù)5次。用圖像分析軟件計(jì)算染色面積和累積光密度(IOD)。計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果斑馬魚骨骼染色的顯微檢測(cè)重復(fù)性斑馬魚幼魚用茜素紅染色后，頭骨骨骼部分呈紅色，而非骨組織耳石部分呈棕黑色。顯微成像后用圖像分析軟件計(jì)算紅色部分面積之和以及累積光密度。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果良好紅色染色面積之和的平均值為21352. 6，標(biāo)準(zhǔn)差 SD為256. 00，變異系數(shù)CV為1. 19%(n=5);紅色染色部分累積光密度(IOD)的平均值為 14100. 97，標(biāo)準(zhǔn)差 SD 為 459. 13，變異系數(shù) CV 為 3. 25%(n=5)。
采用AxioVisionRel. 4. 6軟件采集放大100倍的圖像,采用圖像分析軟件Image pro plus 6. O對(duì)染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，得到頭部骨骼染色面積以及累積光密度(IOD)值 (具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表I)。
結(jié)果與陰性對(duì)照組O. 5%DMS0(見圖1)相比，低濃度地塞米松(I μ Μ)對(duì)斑馬魚骨礦化面積影響不明顯，但隨著地塞米松濃度的增加，骨礦化面積呈顯著降低趨勢(shì)。當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?ο μ M(見圖2)和25 μΜ時(shí)，斑馬魚骨骼礦化量和骨密度與溶媒陰性對(duì)照組相比差異呈顯著性(P〈0. 001, Ρ<0. 01)。提示2. 5 μ Μ^25 μ M地塞米松可誘導(dǎo)斑馬魚形成骨質(zhì)疏松。
表I地塞米松對(duì)斑馬魚骨骼染色面積和累積光密度的影響(η=5-7)
權(quán)利要求
1.一種用于評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，利用茜素紅可特異性地與鈣離子螯合從而使礦化的骨基質(zhì)染成紅色的特性，其特征在于運(yùn)用模式生物斑馬魚為評(píng)價(jià)模型，在給予斑馬魚幼魚防治骨質(zhì)疏松藥物后，通過對(duì)其骨骼進(jìn)行茜素紅染色后的圖像進(jìn)行采集和分析，計(jì)算出染色區(qū)域的面積和累積光密度，即反映骨礦化量和骨密度的數(shù)據(jù)，以此作為對(duì)藥物作用效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)； 具體包括以下步驟 步驟一斑馬魚受精卵的收集控制斑馬魚成魚日夜節(jié)律，晝夜時(shí)間控制在14-12小時(shí)10-12小時(shí)，收集受精卵，置于培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基，于26° C-30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng); 步驟ニ 給藥方案取受精后3天斑馬魚胚胎放入盛有胚胎培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，根據(jù)培養(yǎng)板孔的大小每孔加入培養(yǎng)基O. l-2mL，每個(gè)孔里放1-10條幼魚，分為數(shù)組，每組5_15條魚，溶媒陰性對(duì)照組和測(cè)試藥物組，從受精后4天或受精后5天開始加入溶媒和測(cè)試藥物，加藥方法是吸凈培養(yǎng)板孔里的培養(yǎng)基后迅速加入溶液，溶媒對(duì)照濃度與藥物測(cè)試組的溶媒濃度相當(dāng)，將培養(yǎng)板密封放入26° C-30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)周期5-7天，每天將每個(gè)孔里的溶液吸出一半，加入等體積新溶液，培養(yǎng)至斑馬魚胚胎受精后9-11天或者10-12天; 步驟三斑馬魚骨骼茜素紅染色將培養(yǎng)至斑馬魚胚胎受精后9-11天或者10-12天的幼魚用間氨基苯甲酸乙3酯甲磺酸鹽處死，然后將幼魚固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中2-3h，將固定液4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液去除，然后將斑馬魚幼魚置于50%乙醇中l(wèi)Omin，去除こ醇,加入用O. 5%KOH配制的菌素紅染色液,放置過夜,去除染色液,加入超純水洗去多余的染液后加入新鮮配制的漂白剤，放置20min-2h，去除漂白劑后，加入3:1的O. 5%KOH和甘油的混合溶液30min-8h，然后更換溶液為I: I的O. 5%KOH和甘油的混合溶液6h_24h，最后更換溶液為1:3的O. 5%KOH和甘油的混合溶液6h-24h，最后保存于純甘油中； 步驟四斑馬魚骨骼染色的檢測(cè)與分析用倒置顯微鏡觀察步驟三中茜素紅染色的斑馬魚頭骨腹面，用成像軟件采集圖像，所有的圖像均采用相同的光強(qiáng)度和曝光設(shè)置，用專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算茜素紅染色區(qū)域的面積和累積光密度，以分別反應(yīng)骨礦化量和骨密度，計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行t-檢驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種用于評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，其特征在于 步驟ニ 給藥方案取受精后3天斑馬魚胚胎放入盛有胚胎培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，根據(jù)培養(yǎng)板孔的大小每孔加入培養(yǎng)基O. l-2mL，每孔放1-10條幼魚，分為數(shù)組，每組5_15條魚，溶媒陰性對(duì)照組、潑尼松龍或地塞米松模型藥物組和測(cè)試藥物組；造模藥和溶媒從斑馬魚胚胎受精后4天或斑馬魚胚胎受精后5天開始加入，測(cè)試藥可與模型藥同時(shí)在受精后4天或者受精后5天加入，也可在模型藥物加入48小時(shí)后加入，加藥方法是吸凈培養(yǎng)板孔里的培養(yǎng)基后迅速加入溶液，溶媒對(duì)照濃度與藥物測(cè)試組的溶媒濃度相當(dāng)，將培養(yǎng)板密封放入26° C-30° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)周期5-7天，每天將每個(gè)孔里的溶液吸出一半，加入等體積新溶液，培養(yǎng)至斑馬魚胚胎受精后9-11天或者10-12天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ー種評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用的新方法，其特征在干步驟一中控制斑馬魚成魚日夜節(jié)律，晝夜時(shí)間控制在14小時(shí)10小時(shí)，收集受精卵；培養(yǎng)基組成為5mM NaCl, O. 17mM KCl，O. 33mM CaCl2,0. 33mM MgSO4,10_5% 亞甲基藍(lán)； 斑馬魚胚胎和幼魚培養(yǎng)溫度為28° C-29° C； 步驟ニ中的培養(yǎng)板為96孔、48孔、24孔、12孔或6孔培養(yǎng)板，其中較優(yōu)的為24孔板，每孔加入培養(yǎng)基O. 5-1. 5mL,每孔放5-10條幼魚； 步驟ニ中斑馬魚魚齡選擇受精后3天的斑馬魚幼魚,溶媒和藥物從斑馬魚受精后4天或者受精后5天開始加入，培養(yǎng)周期為5天，培養(yǎng)至受精后9天或者10天； 配制藥物的溶媒為水或者是含有(Tl% ニ甲基亞砜助溶劑的水溶液； 步驟三中茜素紅采用O. 5%Κ0Η溶解；漂白剤由I. 5%Η202和1%Κ0Η組成，且需新鮮配制；步驟四中用ZEISS熒光倒置顯微鏡觀察茜素紅染色的斑馬魚頭骨腹面，用成像軟件采集圖像，放大倍數(shù)為100倍；用專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算茜素紅染色區(qū)域的面積和累積光密度；用Excel軟件計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種用于評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受試藥物為化學(xué)藥品、中藥、中藥復(fù)方、天然藥物或它們的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種用于評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受試藥物為化學(xué)藥品、中藥、中藥復(fù)方、天然藥物或它們的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種用于評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受試藥物為鮭魚降鈣素、依替膦酸ニ鈉及中藥續(xù)斷提取物、續(xù)斷皂苷類成分及淫羊藿黃酮類成分等。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ー種用于評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受試藥物為鮭魚降鈣素、依替膦酸ニ鈉及中藥續(xù)斷提取物、續(xù)斷皂苷類成分及淫羊藿黃酮類成分等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)防治骨質(zhì)疏松藥物作用效果的新方法，該方法通過選用斑馬魚作為模型動(dòng)物，通過優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)分組方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，采用優(yōu)選的藥物給藥方式進(jìn)行給藥，采用優(yōu)選的方法對(duì)斑馬魚骨骼進(jìn)行茜素紅染色，采用直觀的顯微觀察捕捉圖像，并采用優(yōu)選的圖像分析軟件分析骨骼染色區(qū)域以反應(yīng)骨礦化量，整個(gè)實(shí)驗(yàn)方法可操作性強(qiáng)，能客觀的反應(yīng)藥物在斑馬魚體內(nèi)對(duì)骨量生成的影響，能快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)化合物及復(fù)雜中藥成分防治骨質(zhì)疏松的作用。能克服一般體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)難條件苛刻，難以體現(xiàn)在體效應(yīng)綜合結(jié)果的缺點(diǎn)，并克服哺乳動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，受試藥量大、勞動(dòng)強(qiáng)度高等缺點(diǎn)。該方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，且實(shí)驗(yàn)方法可重復(fù)性強(qiáng)，所需受試藥物量少，成本低，勞動(dòng)強(qiáng)度低，應(yīng)用范圍廣泛，且可成批量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，工作效率高。
文檔編號(hào)G01N33/15GK102980981SQ20121044113
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者韋英杰, 賈曉斌, 王長(zhǎng)梅, 蔡雪婷, 詹揚(yáng), 孫娥, 舒孌, 宋捷 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院