專利名稱：一種再改良Sihler's肌內(nèi)神經(jīng)染色的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)解剖學(xué)領(lǐng)域，是一種更省時(shí)，更經(jīng)濟(jì)，神經(jīng)染色效果更好的改良方法。
背景技術(shù)：
關(guān)于Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色法，Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色法是由Sihler’s在19世紀(jì)提出的(C Sihler Ober muskelspindeln und intramuskulare nervenendigungenbei schlangen und froschen[J ]Archiv fiir Mikroskopische Anatomie, 1895,46:709-723.) ο此后各國學(xué)者對此方法進(jìn)行了多次改良，并且命名為Sihler’s染色技術(shù)以紀(jì)念發(fā)明者。Sihler s染色法能夠在保持肌肉大體形態(tài)，在標(biāo)本透明或者半透明狀態(tài)下肉眼看到肌內(nèi)神經(jīng)的分支，神經(jīng)主干及其分支被染成紫藍(lán)色，X線閱片箱上可見，肌纖維和 結(jié)締組織呈淡紫色。Sihler’ S肌內(nèi)神經(jīng)染色方法的具體步驟以Liu、Kumar等(Liu J,KumarVP,Shcn Y,etal. Modified Sihler’s technique for studying the distributionof intramuscular nerve branches in mammalian skeletal muscle[J]. AnatRec,1997,247(1) 137-144.)改良后的Sihler’ S肌內(nèi)神經(jīng)染色例介紹Sihler’ S染色的步驟:
(I)固定將新鮮標(biāo)本立即以10%的甲醛固定，時(shí)間約4周，液體渾濁時(shí)更換液體。人體的大塊肌肉固定時(shí)間相應(yīng)延長至兩個(gè)月。(2)浸軟和除色素固定后組織流水沖洗24h，置于3%的氫氧化鉀(每100毫升氫氧化鉀加O. 2毫升3%的過氧化氫)除色素，液體變渾濁后予以更換(一般2 3天)，并隨時(shí)通過X線閱片箱觀察肌內(nèi)神經(jīng)，至肌肉發(fā)白半透明神經(jīng)分支可見終止，此過程約需3 4周。(3)脫鈣將肌肉流水沖洗半小時(shí)，浸入Sihler’ S1(由I份冰醋酸、2份甘油和12份I %的水合三氯乙醛配制而成)溶液中脫鈣，每周換液I次，至肌肉透明，此過程約需4周。(4)染色脫鈣后的肌肉流水沖洗30分鐘后，浸入Sihler’ SII (由I份Ehrlich’ S蘇木素液,2份甘油和12份I %的水合三氯乙醒配制而成)溶液中，每周換液I次，直到肌內(nèi)神經(jīng)，此過程約需21周。(5)脫色染色后，肌肉重入Sihler’S I溶液中，使肌纖維脫色，液體顏色發(fā)黃后予以更換，觀察肌內(nèi)神經(jīng)與肌肉顏色的對比度，直到肌內(nèi)神經(jīng)顯示紫黑色，肌肉呈淡藍(lán)色為止。此過程約需20小時(shí)。(6)中和流水沖洗30min，入O. 05%碳酸鋰溶液中浸泡f 2小時(shí)。(7)透明將肌肉的筋膜剔除，依次放入40%、60%、80%、100%梯度甘油中透明，每種濃度的甘油作用3天。此過程約需12d。最后標(biāo)本避光保存于100%甘油中。雖然Sihler’s染色法可以整體觀察肌內(nèi)的神經(jīng)分布，但是整個(gè)染色過程時(shí)間比較長，步驟多，每一步的終止都沒有固定的時(shí)間要憑借經(jīng)驗(yàn)，都需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)才能達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。肌內(nèi)神經(jīng)細(xì)小分支以及分支間的聯(lián)系不能清晰觀察到，神經(jīng)纖維髓鞘在末端越來越少(Stevens , A. ; Lowe, J. Human Histology. 2nd.C V Mosby; London: 1997. p. 1-408)，吸收的蘇木素染料也越少，尤其脫色部分更需要緊密的觀察，容易褪色過度，觀察不到。中和的過程不好把握，中和時(shí)間長會(huì)導(dǎo)致肌肉淡藍(lán)色過深，造成肌肉和神經(jīng)細(xì)小分支的色差不明顯影響觀察。透明時(shí)間長，整個(gè)染色過程時(shí)間長且是水化的過程標(biāo)本形態(tài)有些變形，實(shí)驗(yàn)藥品試劑消耗量大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種再改良Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色的方法。本發(fā)明具體方法如下
按Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色法，肌肉標(biāo)本經(jīng)固定，浸軟和除色素，脫鈣，染色，脫色步驟不采用傳統(tǒng)的Sihler’S I液(由I份冰醋酸、2份甘油和12份I %的水合三氯乙醛配制而成)溶液脫色，而采用酸性分化液(由I份鹽酸，100份70%酒精溶液配制而成)進(jìn)行脫色，液體變紅更換液體。采用此分化液脫色速度快，傳統(tǒng)方法約需20小時(shí)，改良后約2 4小時(shí)即可，節(jié)約且在脫色的過程中有透明的效果，在脫色過程中細(xì)小神經(jīng)分以及分之間的聯(lián)系可以清晰看到。使用再改良的脫色方法可以節(jié)約脫色時(shí)間和透明時(shí)間。標(biāo)本脫色后且不需要用O. 05%碳酸鋰浸泡中和，流水沖洗15分鐘后，置于40%的甘油透明劑中，在40%的甘油透明劑中，標(biāo)本會(huì)緩慢繼續(xù)退去多余的顏色，便于控制脫色時(shí)間。再依次放入60%、80%、100%甘油各一天，以此方法脫色后可縮短透明時(shí)間，透明效果好，神經(jīng)纖維呈現(xiàn)紫藍(lán)色，肌肉透明略呈棕色，肌肉和神經(jīng)纖維色差明顯更易觀察，肌肉標(biāo)本不呈流動(dòng)的膠凍狀，支撐度 好更接近真實(shí)；
最后標(biāo)本用100%甘油玻璃標(biāo)本瓶密封避光保存；
本發(fā)明方法制作的肌內(nèi)神經(jīng)標(biāo)本形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)小分支清晰以及分之間的聯(lián)系清晰可見，標(biāo)本的支撐度好，標(biāo)本形態(tài)顏色更接近真實(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程縮短，更省時(shí)，更經(jīng)濟(jì)，效果更好。
權(quán)利要求
1.一種再改良Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色的方法，步驟如下 1)在新鮮尸體上，按照常規(guī)解剖暴露相關(guān)組織，觀察該組織血管神經(jīng)來源，將該組織分離，注意保留完整的血管神經(jīng)蒂； 2)按Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色法對所取肌肉組織進(jìn)行固定、浸軟和除色素、脫鈣、染色，脫色步驟不采用傳統(tǒng)的Sihler’ s I (由I份冰醋酸、2份甘油和12份I %的水合三氯乙醛配制而成)采用酸性分化液進(jìn)行脫色，不需中和用O. 05%d的碳酸鋰浸泡中和，直接進(jìn)行各級梯度甘油透明，肌肉呈透明狀，呈淺棕色，肌內(nèi)神經(jīng)被染成紫藍(lán)色； 3)上述肌肉標(biāo)本浸入100%甘油用玻璃標(biāo)本瓶避光封存。
2.按權(quán)利要求I所述的肌內(nèi)神經(jīng)方法的改良，其特征在于所說的酸性分化液是按I份鹽酸，100份70%酒精溶液配制而成。
3.按權(quán)利要求I所述的肌內(nèi)神經(jīng)方法的改良，其特征在于所說的各級梯度甘油濃度分別為 40%、60%、80%、100% ο
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)解剖學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種更省時(shí)，更經(jīng)濟(jì)，神經(jīng)染色效果更好的改良方法。取新鮮肌標(biāo)本，10%甲醛固定﹑浸軟和除色素﹑脫鈣﹑染色，采用酸性分化液(由1份鹽酸，100份70%酒精溶液配制)進(jìn)行脫色。脫色快，脫色的過程中有透明效果，神經(jīng)纖維﹑細(xì)小神經(jīng)分支以及分支之間的聯(lián)系均可清晰看到。不需用0.05%的碳酸鋰溶液浸泡中和，直接各級梯度甘油中透明，透明時(shí)間縮短。本發(fā)明方法制作的肌肉標(biāo)本形態(tài)完整，支撐度好，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)被染成紫藍(lán)色，細(xì)小神經(jīng)分支以及分支間聯(lián)系均清晰可見。標(biāo)本形態(tài)，顏色更接近真實(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程縮短，更省時(shí)，更經(jīng)濟(jì)，效果更好，更適用于解剖學(xué)和外科整形學(xué)對肌內(nèi)神經(jīng)分布的研究。
文檔編號G01N1/30GK102944459SQ201210443768
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者李艷, 陳道邦, 董立華 申請人:四川大學(xué)