專利名稱：測(cè)定adamts-13蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于凝血診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在一樣本中體外測(cè)定血管性血友病因子(VWF)活性的方法。所述方法包括對(duì)GPIba蛋白功能獲得性變異體的使用，這樣就可放棄對(duì)瑞斯托霉素、美洲矛頭腹毒蛋白(Botrocetin)或與瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白等效的其他物質(zhì)的使用。本發(fā)明此外還涉及一種測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VffF)裂解活性的方法。
背景技術(shù)：
血管性血友病因子(VWF)是血漿中的一種大分子多聚體糖蛋白，在初期止血過(guò)程中具有重要作用。VWF具有膠原蛋白結(jié)合位點(diǎn)和用于定位于血小板表面的糖蛋白Ib(GPIb)的結(jié)合位點(diǎn)。GPIb是一種內(nèi)在膜蛋白，會(huì)與另一種內(nèi)在膜蛋白(糖蛋白IX (GPIX))在血小板膜中形成糖蛋白Ib-1X受體復(fù)合物。GPIb是雙鏈分子，由一條表觀分子質(zhì)量約為145kDa的重鏈(同義詞:heavy chain、α鏈或GPIb α )和一條表觀分子質(zhì)量約為22kDa的輕鏈(同義詞:light chain、β鏈或GPIbP )構(gòu)成,這兩條鏈通過(guò)二硫鍵彼此相連[Lopez, J.A.等人(1987)Cloning of the a chain of human platelet glycoproteinlb:A transmembraneprotein with homology to leucine-rich a 2-glycoprotein.Proc.Natl.Acad.Sci USA84:5615-5619]o血管受傷時(shí)，VWF結(jié)合到暴露的膠原蛋白表面。由于與膠原蛋白結(jié)合以及受到增大的剪力(作用在與膠原蛋白結(jié)合的VWF上)的影響，VWF發(fā)生變化或被激活，從而可以結(jié)合到血小板膜的GPIb-1X受體復(fù)合物中的GPIb重鏈(GPIb α )的氨基末端?；罨疺WF通過(guò)這種方式俘獲從旁邊經(jīng)過(guò)的血小板，使得受傷處形成由VWF、膠原蛋白和血小板構(gòu)成的第一團(tuán)聚體。其結(jié)果是血小板被激活，從而開始血漿凝血過(guò)程，該過(guò)程在經(jīng)過(guò)多次放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)和血小板進(jìn)一步聚集后最終促成傷口的愈合。VWF在質(zhì)或量上的異常是血管性血友病(同義詞:von WillebrandDisease，VWD)的起因，所謂的血管性血友病是最常見的遺傳出血性疾病之一。就血管性血友病的診斷而言目前存在不同的篩查方法，例如測(cè)定出血時(shí)間(BT)、測(cè)定VWF抗原濃度(VWF = Ag)的定量法(例如ELISA方法)和測(cè)定VWF活性的方法，例如瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板凝集(VWF:RCo)。瑞斯托霉素誘導(dǎo)固定血小板聚集的方法(又稱“瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)”)還能識(shí)別VWF蛋白用測(cè)定VWF抗原濃度的定量法所識(shí)別不到的功能性障礙。因此，為能對(duì)血管性血友病做出明確診斷，有必要實(shí)施用于測(cè)定瑞斯托霉素輔因子活性的瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)。實(shí)施瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)時(shí)通常是將患者的血漿樣本與固定的血小板和斯托霉素混合。在斯托霉素的誘導(dǎo)下，樣本所含的VWF結(jié)合到所添加的血小板的GPIb受體上，從而實(shí)現(xiàn)血小板的聚集。這一聚集反應(yīng)的反應(yīng)程度與患者樣本所含的活性VWF的量之間存在關(guān)聯(lián)。舉例而言，這種聚集反應(yīng)可通過(guò)測(cè)量傳播增長(zhǎng)率來(lái)加以光學(xué)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)VWF:RCo活性的量化。與VWF抗原檢測(cè)相比，瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)在于可對(duì)VWF進(jìn)行活性測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)VWF功能性障礙的識(shí)別，以及對(duì)血管性血友病的不同子類進(jìn)行分類，這些子類中僅部分子類也是隨VWF抗原濃度的降低而出現(xiàn)。一般情況下，進(jìn)行子類分類時(shí)須形成VWF瑞斯托霉素輔因子活性(VWF = RCo)與VWF抗原濃度(VWF = Ag)的比率(Ratio)。對(duì)于血管性血友病的子類2A、2B和2M而言，VWF:RCo/VWF:Ag之比通常小于I。通常建議將0.7的比率作為極限值。傳統(tǒng)的瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)的不足之處在于實(shí)施過(guò)程很難自動(dòng)化，因?yàn)樵跍y(cè)量過(guò)程中需要不斷地充分?jǐn)嚢铏z測(cè)標(biāo)本(Testansatz)中的血小板。此外，這種檢測(cè)的精確度相對(duì)較低，對(duì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的處于0%至20%范圍內(nèi)的低VWF活性的測(cè)定無(wú)法充分發(fā)揮作用。近來(lái)有人研發(fā)出了基于GPIba的VWF-ELISA檢測(cè)，這種檢測(cè)所使用的重組GPIb a片段(1-289 或 1-290)包含氨基末端 VWF 結(jié)合區(qū)[WO 01/02853A2 或 Vanhoorelbeke, K.等人(2002)A reliable von Willebrand factor:Ristocetincofactor enzyme-linkedimmunosorbent assay to differentiate between type I andtype 2von Willebranddisease.Semin Thromb Hemost.28(2):161-165 以及 Federicij A.B.等人(2004)Asensitive ristocetin co-factor activity assay withrecombinant glycoproteinIb a for the diagnosis of patients with low vonWillebrand factor levels.Heamatologica 89 (I): 77-85]。這些檢測(cè)方法借助特異性抗體將重組GPIb α片段結(jié)合在酶標(biāo)板上。添加患者樣本和瑞斯托霉素，使得患者樣本中的VWF可以結(jié)合到重組GPIba片段上。最后借助抗VWF抗體對(duì)結(jié)合的VWF進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明，這種VWF-ELISA檢測(cè)十分接近于基于血小板的傳統(tǒng)VWF瑞斯托霉素輔因子活性檢測(cè)，甚至比之更敏感、更精確。Hui等人(摘要，ISTH 2007)所描述的基于GPIb α的VWF-ELISA檢測(cè)使用在位置233和239上具有突變體的重組GPIb α片段(1-483)。這些突變體是所謂的功能獲得性突變體，它們?cè)谌鹚雇忻顾貪舛容^低的情況下與野生型GPIb α蛋白(W0 93/16712)相比對(duì)VffF的親和性更高，可以更強(qiáng)烈地與VWF相互作用。上述突變體涉及的是久為人知的GPIb a鏈突變變異體。Miller等人(US 5，317，097)描述的是GPIb α鏈位置233上的甘氨酸殘基被纈氨酸殘基(G233V)取代的方法。這種變異是血小板型血管性血友病(PT-VWD)的起因，后者是一種常染色體顯性遺傳出血性疾病。Russell和Roth描述的是GPIb α鏈位置239上的甲硫氨酸殘基被纈氨酸殘基(M239V)取代的方法[Russell，S.D.& BRoth, G.J.(1993)Pseudo-von Willebrand Disease:A mutation in the platelet glycoprotein Ib a geneassociated with a hyperactive surf ace receptor.Blood 81 (7)，1787-1791]。這種變異也會(huì)引發(fā)PT-VWD。上述基于GPIba的VWF-ELISA檢測(cè)以及瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)的缺點(diǎn)在于，它們建立在使用瑞斯托霉素或其他可以促使VWF結(jié)合到GPIb α鏈上的外源非生理性調(diào)節(jié)因子的基礎(chǔ)上。瑞斯托霉素是一種來(lái)自于諾卡氏菌屬(Bakterium Nocardia Iurida)的抗生糖肽，美洲矛頭腹毒蛋白(同義詞:Co凝集素)是一種來(lái)自于矛頭腹屬的蛇毒，它們通常用于體外誘導(dǎo)VWF結(jié)合到血小板和分離GPIb α蛋白或其片段上。使用瑞斯托霉素的缺點(diǎn)是，它不僅會(huì)結(jié)合到VWF上，還會(huì)結(jié)合到許多其他類型的蛋白上，例如纖維蛋白原或抗GPIba抗體(在特定的實(shí)驗(yàn)中觀察到的)。因此，在VWF檢測(cè)方法中使用瑞斯托霉素存在發(fā)生非特異性結(jié)合反應(yīng)或沉淀反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),這些反應(yīng)會(huì)使檢測(cè)結(jié)果失真。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種在不存在瑞斯托霉素的情況下測(cè)定VWF活性的方法。達(dá)成這個(gè)目的的解決方案是使用在就人類GPIba受體氨基酸序列而言的位置233和位置239上具有兩處點(diǎn)突變的GPIb α鏈的功能獲得性變異體。在本發(fā)明范圍內(nèi)，GPIba鏈的功能獲得性變異體指的是一種在瑞斯托霉素濃度較低的情況下與野生型GPIb α蛋白相比對(duì)VWF的親和性明顯更高、可以更強(qiáng)烈地與VWF相互作用的突變變異體。本發(fā)明的標(biāo)的是一種在一樣本中測(cè)定血管性血友病因子(VWF)活性的方法，其中，將所述樣本和分離GPIb α蛋白混合成一檢測(cè)標(biāo)本，該檢測(cè)標(biāo)本中不添加瑞斯托霉素和美洲矛頭腹毒蛋白。所用的GPIb α蛋白包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列與人類GPIb a蛋白的野生型序列相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)取代基Xaa (SEQ ID NO:1)。GPIba鏈位置233上的甘氨酸殘基取代基Xaa和位置239上的甲硫氨酸殘基取代基Xaa優(yōu)選由纈氨酸殘基(G233V或M239V)或絲氨酸殘基(G233S或M239S)構(gòu)成。這兩個(gè)位置上的不同取代基Xaa可以為任意一種組合。在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明時(shí)，提及GPIba蛋白的地方均可理解為指向這樣一種突變變異體。在進(jìn)一步過(guò)程中，優(yōu)選不在所述檢測(cè)標(biāo)本中添加“瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白的等效物質(zhì)”。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白的等效物質(zhì)”指的是可以體外誘導(dǎo)分離VWF結(jié)合到野生型GPIb α鏈或其片段上的外源(B卩非生理性)物質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)使用GPIba的功能獲得性變異體，就無(wú)需通過(guò)(例如)流體流動(dòng)、攪拌或振動(dòng)來(lái)對(duì)檢測(cè)標(biāo)本施加剪應(yīng)力。就VWF活性測(cè)定方法而言，“樣本”指的是有可能含有待檢測(cè)物質(zhì)(即VWF)的材料。舉例而言樣本”這一概念包括人和動(dòng)物的生物液體(如血液、血漿或血清)以及用于血管性血友病患者替代療法的工業(yè)產(chǎn)品(例如Haemate P)，例如VWF定標(biāo)劑、VffF質(zhì)控血漿(VWF-KontrolIe)或高濃度VWF濃縮物。必要時(shí)須對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，以便可以檢測(cè)到被分析物或?qū)⒏蓴_性的樣本成分移除。這種樣本預(yù)處理可以包括分離和/或溶解細(xì)胞或?qū)颖镜碾x心分離?！皹颖尽边@一概念還包括包含上述樣本材料中的一種樣本材料的反應(yīng)混合物，該樣本材料中被加入用作基質(zhì)的分離WF，以便測(cè)定VWF改性因子的活性，在培養(yǎng)VWF基質(zhì)后需要借助VWF改性因子在這類反應(yīng)混合物中測(cè)定殘留VWF活性。舉例而言，由血漿樣本和分離大分子VWF構(gòu)成的用于測(cè)定該血漿樣本中的VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶的混合物就是這樣一種反應(yīng)混合物。血漿樣本中的ADAMTS-13蛋白酶裂解所添加的VWF基質(zhì)，從而降低該樣本的VWF活性。本發(fā)明的方法所用的GPIba鏈可以是用重組法或合成法制成的GPIb α蛋白。已知的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)適合用來(lái)制造重組GPIb α蛋白，例如細(xì)菌(大腸桿菌)表達(dá)系統(tǒng)，酵母(例如釀酒酵母、甲醇酵母)表達(dá)系統(tǒng)，植物、動(dòng)物或人類細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)。已知的體外蛋白合成技術(shù)適合用來(lái)制造合成GPIb α蛋白，例如固相合成(例如Merrifield合成法)。本發(fā)明的方法所用的GPIba蛋白優(yōu)選是一種用重組法在人類細(xì)胞培養(yǎng)物(優(yōu)選人胚腎細(xì)胞(HEK細(xì)胞)培養(yǎng)物)中制成的GPIba蛋白。本發(fā)明的方法所用的GPIba蛋白可在N端上與同源的人類GPIb α信號(hào)序列MPLLLLLLLLPSPLHP (SEQ ID NO:2，亦稱“氨基酸殘基16至I”)融合。作為替代方案，所用的GPIb α蛋白可在N端上與異源信號(hào)序列融合，即與一種通常不存在于人類GPIb α多肽中、但在所選表達(dá)系統(tǒng)中會(huì)對(duì)重組表達(dá)的GPIb α蛋白的表達(dá)和/或分泌產(chǎn)生有利影響的多肽融合。舉例而言，MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRR (SEQ ID NO:3)就是一種適用的異源信號(hào)序列。此外，本發(fā)明的方法所用的GPIb α蛋白還可在C端上與一或多個(gè)親和標(biāo)簽融合，這些親和標(biāo)簽可使重組表達(dá)蛋白結(jié)合到親和載體上，從而實(shí)現(xiàn)(例如)重組表達(dá)GPIb α蛋白的純化，或者還實(shí)現(xiàn)重組GPIb α蛋白與一固相的結(jié)合。長(zhǎng)度不超過(guò)12個(gè)氨基酸的小親和標(biāo)簽為較佳之選。特別優(yōu)選的親和標(biāo)簽是選自組氨酸標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、精氨酸標(biāo)簽、c-Myc標(biāo)簽和Strep標(biāo)簽群組的親和標(biāo)簽。以較高親和性結(jié)合到親和標(biāo)簽上的適當(dāng)親和載體例如是特異性抗體、固定化陽(yáng)離子(例如對(duì)組氨酸標(biāo)簽具有親和性的Ni2+)或其他類型的結(jié)合對(duì)象(例如對(duì)Strep標(biāo)簽具有親和性的鏈霉親和素)。根據(jù)本發(fā)明的方法的一種實(shí)施方式，所述GPIba蛋白與一固相相關(guān)。“相關(guān)”這一概念含義廣泛，例如包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合、直接結(jié)合和間接結(jié)合、表面吸附和凹穴夾雜(Einschluss in eine Vertiefung)。共價(jià)結(jié)合是分離GPIb α蛋白借助化學(xué)鍵結(jié)合到固相上。非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)例子就是表面吸附。除了直接結(jié)合到固相上之外，分離GPIba蛋白也可通過(guò)與其他特異性結(jié)合對(duì)象的特異性相互作用來(lái)間接地結(jié)合到固相上，例如通過(guò)與抗體的特異性相互作用，優(yōu)選是與抗GPIb α抗體或與抗親和標(biāo)簽抗體(只要分離GPIb α蛋白具有親和標(biāo)簽)的特異性相互作用。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“固相”這一概念包括一種由非水溶性多孔和/或無(wú)孔材料構(gòu)成的物體，它可以極其不同的形式存在，例如容器、細(xì)管、微量滴定板(例如酶標(biāo)板)、球體、微粒、細(xì)棒、條帶、濾紙或?qū)游黾埖?。一般情況下，該固相的表面親水或可以獲得親水性。所述固相可由各種材料構(gòu)成，例如無(wú)機(jī)和/或有機(jī)材料、合成材料、天然材料和/或經(jīng)改性的天然材料。固相材料例如有聚合物(例如纖維素、硝化纖維素、醋酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)優(yōu)選糖酐分子、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯或尼龍)、乳膠、陶瓷、玻璃、金屬(特別是貴金屬，如金和銀)、磁體、上述材料的混合物或組合物。所述固相可具有一個(gè)由一或多個(gè)分層構(gòu)成的覆蓋層，所述分層由(例如)蛋白、碳水化合物、親脂性物質(zhì)、生物聚合物、有機(jī)聚合物或其混合物構(gòu)成，用以抑制或避免樣本成分與該固相之間的非特異性結(jié)合，或者在粒子固相的懸浮穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、成形穩(wěn)定性或者抗紫外線、微生物或其他具有破壞作用的用劑的特性等方面達(dá)到改善目的。本發(fā)明的VWF活性測(cè)定方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式包括對(duì)粒子相關(guān)GPIba蛋白(優(yōu)選乳膠粒子相關(guān)GPIb α蛋白)的使用，以及借助粒子固相的GPIba介導(dǎo)凝集對(duì)VWF活性的測(cè)定。優(yōu)選使用通過(guò)抗體與粒子固相發(fā)生關(guān)聯(lián)的GPIba蛋白。此處可用抗 GPIb α 抗體，特別是單克隆抗體 VM16d[Mazurov, A.V.等人(1991)Characterizationof an antiglycoprotein Ibmonoclonals antibody that specifically inhibitsplatelet-thrombin interaction.Thromb Res.62(6)，673-684;購(gòu)買途徑:荷蘭于登Sanbio B.V.,產(chǎn)品號(hào) M0N1146]和 SZ-2 [Ruan, C.等人(1987) A murine antiglycoproteinIb complex monoclonal antibody, SZ 2,inhibits platelet aggregation inducedby bothristocetin and collagen.Blood 69 (2), 570-577;購(gòu)買途徑:美國(guó)富勒頓BeckmanCoulter Inc.,產(chǎn)品號(hào)IM0409]。如果所用的GPIba蛋白在C端上與一或多個(gè)Flag標(biāo)簽融合，則也可使用抗Flag抗體[參見US 5,011,912;購(gòu)買途徑:德國(guó)施泰因海姆Sigma-Aldrich Chemie GmbH]。定量測(cè)定與樣本中所存在的VWF的量或活性之間存在關(guān)聯(lián)的凝集反應(yīng)時(shí)，可對(duì)粒子聚集體上的光散射加以利用，例如通過(guò)測(cè)量散射光強(qiáng)度(測(cè)混法)或測(cè)量介質(zhì)的濁度(測(cè)濁法)。優(yōu)選在存在去垢劑的情況下通過(guò)粒子固相的GPIba介導(dǎo)凝集來(lái)測(cè)定VWF活性，所述去垢劑優(yōu)選選自Tween 20、Thesit、Triton去垢劑(例如Triton X-100 或Triton X-405 )和十二烷基硫酸鈉(SDS)群組。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，去垢劑的存在會(huì)對(duì)粒子固相(特別是乳膠粒子)取決于VWF的凝集速率產(chǎn)生影響:在不同的VWF濃度和逐步升高的Tween 20濃度下測(cè)定該凝集速率(參見圖4，測(cè)定方法如實(shí)例5)。從圖中可以清楚看到，ATween 20濃度相對(duì)較低(0.02-0.lg/L)時(shí)，反應(yīng)強(qiáng)化作用特別明顯，隨著Tween 20濃度的升高，這種強(qiáng)化作用逐漸變小，并達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的強(qiáng)化水平。舉例而言，當(dāng)VWF濃度為149.6%,Tween 20濃度約為lg/L時(shí)，達(dá)到穩(wěn)定的強(qiáng)化水平，強(qiáng)化度為不存在Tween 20時(shí)的初始值的80%。如果將Tween 20用作去垢劑，就會(huì)存在兩種可能性。其一，可以在濃度較低(0.02-0.lg/L)時(shí)調(diào)節(jié)Tween 20，以便對(duì)特定VWF濃度進(jìn)行最高達(dá)20%的特強(qiáng)強(qiáng)化。這樣就會(huì)在Tween 20濃度為0.05g/L (在檢測(cè)標(biāo)本中)、VWF濃度為30.4%時(shí)獲得216%的凝集速率強(qiáng)化度。由于低VWF濃度特別難以測(cè)定，因而此時(shí)進(jìn)行反應(yīng)強(qiáng)化就特別有幫助。其二，如果在去垢劑的飽和區(qū)內(nèi)針對(duì)所有的相關(guān)VWF濃度進(jìn)行操作，則測(cè)量系統(tǒng)通常會(huì)更加穩(wěn)定。例如自lg/L的Tween 20濃度起，情況即如此。這種方案更適用于VWF濃度范圍較寬的篩查檢測(cè)。如果需要在測(cè)定VWF濃度時(shí)將凝集反應(yīng)強(qiáng)化20%以上，則0.6-20.0g/L (優(yōu)選lg/L)的Tween 20濃度是有利的。其他去垢劑，如Thesit (同義詞:Polydocanol,瑞士羅特里斯特Scharer
&Schlapfer Ltd.)、Triton 去垢劑(例如 Triton X-100 或 Triton X-405 )和十二燒基硫酸鈉(SDS)，顯示出穩(wěn)定的與濃度有關(guān)的凝集反應(yīng)強(qiáng)化作用(參見圖5，測(cè)定方法如實(shí)例5:45 μ L樣本，但所含為Thesit而非Tween 20)。測(cè)定一血漿樣本的VWF活性時(shí)，通常須用緩沖液或乏VWF血漿對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)稀釋。在需要制作定標(biāo)曲線的情況下，須對(duì)正常血漿(例如標(biāo)準(zhǔn)人類血漿)進(jìn)行同樣的處理。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在用乏VWF血漿稀釋的過(guò)程中以及在常規(guī)的去垢劑濃度(在檢測(cè)標(biāo)本中為lg/L)下，GPIba乳膠粒子的凝集會(huì)被非期望地強(qiáng)化，但是通過(guò)足夠多的去垢劑可以抑制這種強(qiáng)化作用。如果如圖6所示在一含有45 μ L樣本的檢測(cè)標(biāo)本中用乏VWF血漿或緩沖液稀釋該樣本(在此情況下為標(biāo)準(zhǔn)人類血漿)，則在存在乏VWF血漿的情況下，特定的VWF濃度下該樣本中就會(huì)出現(xiàn)較高的凝集速率。而如果在檢測(cè)系統(tǒng)中完全放棄使用去垢劑，并用乏VWF血漿稀釋標(biāo)準(zhǔn)人類血漿樣本，所產(chǎn)生的凝集速率就會(huì)低于用緩沖液稀釋時(shí)的凝集速率。但如果添加足夠多的去垢劑(例如> 3g/L Thesit)，用緩沖液稀釋和用缺乏血漿稀釋情況下的凝集速率就會(huì)彼此相同。借此可確保緩沖液對(duì)血漿樣本的真正稀釋。無(wú)論是對(duì)正常血漿(用作定標(biāo)劑)的稀釋還是對(duì)患者樣本的可能的稀釋，均可通過(guò)簡(jiǎn)單的緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)，而無(wú)需借助于乏VWF血漿，這對(duì)檢測(cè)是特別有利的。緩沖液價(jià)格便宜，貯存穩(wěn)定性有保證，許多自動(dòng)檢測(cè)機(jī)僅用一種緩沖液來(lái)實(shí)施多種檢測(cè)。此外,乏VWF血漿并非任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有供應(yīng)。測(cè)量VWF濃縮物時(shí)需要進(jìn)行大量的稀釋操作，其中，能用緩沖液真正有效地達(dá)成稀釋目的也是十分有利的。另一優(yōu)選方案是在存在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、優(yōu)選在該聚乙烯吡咯烷酮在檢測(cè)標(biāo)本中的濃度為0.1%至1.0%的情況下以及/或者在存在右旋糖酐T500、優(yōu)選在該右旋糖酐在檢測(cè)標(biāo)本中的濃度為0.1%至3%的情況下以及/或者在存在藻酸鹽500-600cP、優(yōu)選在該藻酸鹽500-600cP在檢測(cè)標(biāo)本中的濃度為0.01%至0.2%的情況下通過(guò)粒子固相的GPIba介導(dǎo)凝集來(lái)測(cè)定VWF活性。本發(fā)明的VWF活性測(cè)定方法的另一優(yōu)選實(shí)施方式涉及的是一種具有競(jìng)爭(zhēng)力的檢測(cè)方案。這種方法包括對(duì)粒子相關(guān)抗GPIba抗體(優(yōu)選VM16d)和反應(yīng)標(biāo)本(Reaktionsansatz)中的粒子相關(guān)VWF的使用以及GPIb α蛋白的添加。在存在GPIb α蛋白、不存在瑞斯托霉素、美洲矛頭腹毒蛋白或等效物質(zhì)的情況下，粒子發(fā)生凝集。添加含有VWF的樣本，可以抑制這種凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)受到抑制的程度與存在于樣本中的VWF的量或活性存在關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的VWF活性測(cè)定方法的另一優(yōu)選實(shí)施方式包括對(duì)與非粒子固相相關(guān)的GPIba蛋白(優(yōu)選與微量滴定板表面相關(guān)的GPIb α蛋白)的使用以及通過(guò)測(cè)定已結(jié)合到該GPIba蛋白上的VWF量對(duì)VWF活性的測(cè)定。優(yōu)選使用通過(guò)抗體與非粒子固相發(fā)生關(guān)聯(lián)的GPIba蛋白。此處可用抗GPIb α抗體，特別是單克隆抗體VM16d(參見上文)和MB45 [參見Modderman, P.W.等人(1992) Glycoproteins V and Ib-1X form a noncovalent complexin the plateletmembrane.J.Biol.Chem.267 (I), 364-369 及其中所引用的參考資料 26;購(gòu)買途徑:荷蘭阿姆斯特丹Sanquin =PeliCluster CD42b，產(chǎn)品號(hào)M9142]。如果所用的GPIb α蛋白在C端上與一或多個(gè)Flag標(biāo)簽融合，則也可使用抗Flag抗體(參見上文)。測(cè)定已結(jié)合到GPIb α蛋白上的VWF量時(shí)，可使用直接或間接與一信號(hào)形成系統(tǒng)的成分相關(guān)的抗WF抗體，從而實(shí)現(xiàn)GPIba結(jié)合VWF量的量化。由于只有“活性”(功能完好的)VWF會(huì)結(jié)合到GPIb α受體上，因此根據(jù)這一原理測(cè)定的VWF抗原濃度與VWF活性之間存在關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及一種應(yīng)用于本發(fā)明的方法的檢測(cè)試劑盒，其中，所述檢測(cè)試劑盒包括至少一種試劑，所述試劑含有GPIb α蛋白，所述GPIba蛋白包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列與人類GPIb α蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa，所述GPIb α蛋白與一粒子固相相關(guān)。該檢測(cè)試劑盒優(yōu)選包括一含有乳膠粒子相關(guān)GPIba蛋白的試劑。所述GPIba蛋白優(yōu)選通過(guò)抗體與所述粒子固相發(fā)生關(guān)聯(lián)。該試劑可以液態(tài)或凍干形式加以提供。如果該試劑以凍干粉劑形式存在，則所述檢測(cè)試劑盒還可包含使該凍干粉劑懸浮所需的溶劑，例如蒸餾水或適當(dāng)?shù)木彌_液。本發(fā)明此外還涉及一種應(yīng)用于本發(fā)明的方法的檢測(cè)試劑盒，其中，所述檢測(cè)試劑盒包括一非粒子固相，優(yōu)選微量滴定板，包括一氨基酸序列的GPIb α蛋白與所述非粒子固相相關(guān)，所述氨基酸序列與人類GPIba蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa。所述GPIb α蛋白優(yōu)選通過(guò)抗體與所述非粒子固相發(fā)生關(guān)聯(lián)。所述檢測(cè)試劑盒還可包括一試劑，該試劑含有一抗VWF抗體，優(yōu)選直接或間接與一信號(hào)形成系統(tǒng)的成分相關(guān)的抗VWF抗體。所述含有抗VWF抗體的試劑可以液態(tài)或凍干形式加以提供。如果該試劑以凍干粉劑形式存在，則所述檢測(cè)試劑盒還可包含使該凍干粉劑懸浮所需的溶劑，例如蒸餾水或適當(dāng)?shù)木彌_液。本發(fā)明還涉及一種分離GPIb α蛋白在體外測(cè)定血管性血友病因子(VWF)活性方法中的應(yīng)用，所述分離GPIba蛋白包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列與人類GPIba蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa，其中，所述VWF活性測(cè)定方法不使用瑞斯托霉素和美洲矛頭腹毒蛋白。使用位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由纈氨酸殘基或絲氨酸殘基構(gòu)成的分離GPIba蛋白為較佳之選。這兩個(gè)位置上的不同取代基Xaa可以為任意一種組
八
口 ο本發(fā)明此外還涉及一種獲得分離GPIba蛋白的方法，所述分離GPIb α蛋白包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列與人類GPIba蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa，其特征在于，在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的培養(yǎng)物中重組表達(dá)所述GPIba蛋白，通過(guò)使用親和載體以親和層析的方式從細(xì)胞溶解產(chǎn)物或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離出所述GPIb α蛋白。用于獲得位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由纈氨酸殘基或絲氨酸殘基構(gòu)成的分離GPIba蛋白的方法為較佳之選。這兩個(gè)位置上的不同取代基Xaa可以為任意一種組合。本發(fā)明的另一標(biāo)的是一種測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VWF)裂解活性的方法。ADAMTS-13 (a disintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs)是一種溶蛋白性裂解血管性血友病因子(VWF)、從而減小血管性血友病因子(VWF)活性的金屬蛋白酶。ADAMTS-13酶活性的先天性或獲得性缺乏是各種疾病的起因，例如血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，一種危及生命的血栓栓塞性微循環(huán)疾病。在TTP患者的血漿中發(fā)現(xiàn)的異常巨大的VWF多聚體被視為引起大量聚集VWF和血小板的血栓形成的原因所在。因此，在患者樣本中測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解蛋白酶活性具有診斷學(xué)意義。在測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性或診斷ADAMTS-13缺乏癥方面，現(xiàn)有技術(shù)中存在多種不同的方法:Furlan等人(1996)描述的方法是以經(jīng)純化的人類VWF為基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)含有ADAMTS-13蛋白酶的樣本，隨后通過(guò)借助于SDS瓊脂糖凝膠電泳的VWF多聚體分析或通過(guò)借助于聚丙烯酰胺凝膠電泳的VWF片段分析，隨后再通過(guò)免疫印跡來(lái)檢測(cè)ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性[Furlan, M., Robles, R.及Ljirnmle,B.(1996)Partial purification andcharacterization of aprotease from human plasma cleaving von Willebrand factorto fragmentsproduced by in vivo proteolysis.Blood 87，10:4223-4234]。這類借助凝膠電泳而實(shí)現(xiàn)的多聚體分析工作量極大，耗時(shí)頗多，因而不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室。其他的功能檢測(cè)方法測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性的方式是以VWF為基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)含有ADAMTS-13蛋白酶的樣本，隨后再測(cè)定VWF基質(zhì)的活性損失。樣本中所含ADAMTS-13蛋白酶越多，被裂解的VWF基質(zhì)就越多，之后可在反應(yīng)混合物中檢測(cè)到的VWF活性就越少。這類功能檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)將VWF用作基質(zhì)以及通過(guò)測(cè)量大分子多聚體的功能喪失，可以體外模擬ADAMTS-13蛋白酶在活體內(nèi)的相關(guān)功能。WO 2004/005451A2所揭示的方法是以經(jīng)純化的人類VWF為基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)含有ADAMTS-13蛋白酶的樣本，隨后借助瑞斯托霉素輔因子檢測(cè)通過(guò)測(cè)定殘留在反應(yīng)混合物中的VWF活性來(lái)檢測(cè)ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性。替代方案是通過(guò)膠原結(jié)合檢測(cè)來(lái)測(cè)定殘留在反應(yīng)混合物中的VWF活性(參見WO 00/50904)。其缺點(diǎn)是反應(yīng)混合物的培養(yǎng)時(shí)間極長(zhǎng)，部分須連夜進(jìn)行，以便使VWF被充分地蛋白水解。Kostousov, V. , Fehr, J. , Bombeli, T.(2006)Novel,sem1-automated, 60-min-assay to determine von Willebrandfactorcleaving activity of ADAMTS-13. Thrombosis Res. 118:723-731 則描述了一種經(jīng)改進(jìn)的方法，可以將培養(yǎng)時(shí)間縮減至60分鐘。US 2007/0065895A1和US 2005/0186646A1所揭示的方法是以具有特異性ADAMTS-13蛋白酶裂解位點(diǎn)的肽或VWF肽(片段)為基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)含有ADAMTS-13蛋白酶的樣本，隨后再借助SDS-PAGE通過(guò)對(duì)所生成的肽片段進(jìn)行分析以及視情況通過(guò)免疫印跡來(lái)檢測(cè)ADAMTS-13蛋白酶的蛋白水解活性。已知檢測(cè)系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于不是技術(shù)上太復(fù)雜(例如借助SDS-PAGE分析蛋白水解所生成的基質(zhì)片段)，就是沒有對(duì)天然VWF基質(zhì)加以利用，因而可能無(wú)法識(shí)別到ADAMTS-13蛋白酶某些功能障礙。因此，本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VWF)裂解活性的方法，這種方法可以盡可能多地檢測(cè)到ADAMTS-13蛋白酶功能障礙，還可以在傳統(tǒng)的臨床分析儀上以節(jié)省時(shí)間的方式自動(dòng)進(jìn)行。達(dá)成這個(gè)目的的解決方案是將一可能含有ADAMTS-13蛋白酶的樣本和用作基質(zhì)的分離VWF混合成一反應(yīng)標(biāo)本，其中，所述VWF基質(zhì)由大分子多聚體VWF構(gòu)成，所述大分子多聚體VWF包含有具有至少一處氨基酸序列變異(多態(tài)或突變)的VWF單體，所述氨基酸序列變異使得所述VWF基質(zhì)與大分子多聚體VWF是由野生型VWF單體構(gòu)成的VWF基質(zhì)相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。先在活體內(nèi)將人類VWF單體合成2813個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的前體蛋白。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)處理產(chǎn)生大小可超過(guò)20000kDa的VWF多聚體。這些多聚體由通過(guò)二硫鍵彼此相連大小為275kDa長(zhǎng)度為2050個(gè)氨基酸的呈線性分布的VWF單體構(gòu)成。該VWF以大小自500kDa (二聚體)至15000kDa不等的多聚體的球狀形式在血漿中循環(huán)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“大分子多聚體VWF基質(zhì)”指的是一種由10個(gè)以上二聚化VWF分子構(gòu)成、大小超過(guò)5000kDa的VWF蛋白，這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的凝膠電泳加以確證。此外，大分子多聚體VWF還包含有具有至少一處氨基酸序列變異(多態(tài)或突變)的VWF單體，所述氨基酸序列變異使得所述VWF基質(zhì)與大分子多聚體VWF是由野生型VWF單體構(gòu)成的VWF基質(zhì)相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。VffF蛋白的氨基酸序列變異可以提高VWF對(duì)ADAMTS-13蛋白酶溶蛋白性裂解的感受性，這一點(diǎn)屬于現(xiàn)有技術(shù)[參見 Hassenpflug, ff. A. , Budde, U. , Obser, T. , Angerhaus, D. , Drewke, E. , Schneppenheim, S. , Schneppenheim, R. (2006)Impact of mutationsin the von Willebrand factor A2domain onADAMTS13-dependent proteolysis. Blood107: 2339-2345 或 Rayes, J., Hommais, A., Legendre, P., Tout, H., Veyradier, A., Obert,
B.,Ribba, A.S., Girma, J.P.(2006)Effect of von Willebrand disease type 2B andtype 2M mutations onthe susceptibility of von Willebrand factor to ADAMTS-13.J Thromb Haemost.5:321-328]。特別適用于本發(fā)明的VWF基質(zhì)應(yīng)該由大分子多聚體VWF構(gòu)成，所述大分子多聚體VWF包含有VWF單體，所述VWF單體具有至少一處來(lái)自下列群組的氨基酸序列變異:P1648S、E1638K、G1505R、S1506L、M1528V、R1569del、R1597W、V1607D、G1609R、G1629E、G1631D、R1597Q、V1499E 和 Y1584C。氨基酸位置的說(shuō)明與VWF前體蛋白2813個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列有關(guān)(參見NCBI Accession N0.AAB59458, Version AA59458.1，Gl: 340356)?！癲el” 這個(gè)縮寫表示的是相關(guān)氣基酸殘基的缺失。有關(guān)血管性血友病因子的突變和多態(tài)命名，另見Goodeve, A.C., Eikenboom, J.C.J., Ginsburg, D., Hilbert, L., Mazurier, C., Peake,1.R., Sadler, J.E.和 Rodeghiero, F.(2001)A Standardnomenclature for von Willebrand factor genemutations and polymorphisms.Thromb Haemost.85:929—931。其他天然存在的或人工制成的VWF氨基酸序列變異同樣適用于本發(fā)明，只要它們能使得所生成的VWF基質(zhì)與大分子多聚體VWF是由野生型VWF單體構(gòu)成的VWF基質(zhì)相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用，也就是說(shuō)，所生成的VWF基質(zhì)對(duì)ADAMTS-13蛋白水解具有更高的感受性?！皩?duì)ADAMTS-13蛋白水解具有更高的感受性”表示的是，大分子多聚體VWF基質(zhì)在體外被ADAMTS-13蛋白水解的速度超過(guò)純野生型的大分子多聚體VWF基質(zhì)，亦即，在相同的培養(yǎng)條件下VWF基質(zhì)的斷裂程度更大，這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的凝膠電泳加以確證。本發(fā)明所使用的分離大分子多聚體VWF基質(zhì)可從適當(dāng)VWF氨基酸序列變異的雜合或純合載體的捐獻(xiàn)者血衆(zhòng)(Spenderplasmen)中獲得,或者可以借助本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法加以重組表達(dá)。用重組法制成的VWF基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于，它沒有任何在移入檢測(cè)標(biāo)本的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失真的ADAMTS-13污染，且其完全多聚化，不像從血漿中分離出來(lái)的VWF那樣被蛋白水解。根據(jù)本發(fā)明用于測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VWF)裂解活性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)將所述樣本附加地與肝磷脂和/或分離天然GPIb α蛋白和/或重組野生型GPIb α蛋白以及瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白混合，還可進(jìn)一步加速VWF基質(zhì)的分解。為此，也可將所述樣本與包括一氨基酸序列的重組或合成GPIba蛋白混合，所述氨基酸序列與人類GPIb α蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa。所用GPIba蛋白的位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa優(yōu)選由纈氨酸殘基或絲氨酸殘基構(gòu)成。用VWF基質(zhì)培養(yǎng)樣本后殘留在反應(yīng)標(biāo)本中的VWF活性可用不同的方式加以測(cè)定，例如通過(guò)測(cè)量瑞斯托霉素輔因子活性(VWF:RCo)或其他的已知方法。一種優(yōu)選實(shí)施方式用以測(cè)定反應(yīng)標(biāo)本中的殘留VWF活性的方法是將該反應(yīng)標(biāo)本或它的等分試樣與包括一氨基酸序列的分離GPIba蛋白混合，不添加瑞斯托霉素和美洲矛頭腹毒蛋白，其中，所述氨基酸序列與人類GPIba蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1_268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa(優(yōu)選Xaa=纈氨酸殘基或絲氨酸殘基)。特別優(yōu)選的方案是上述GPIba蛋白與一粒子固相相關(guān)，該粒子固相根據(jù)殘留VWF活性發(fā)生凝集。借助這一凝集反應(yīng)可測(cè)定反應(yīng)標(biāo)本中的殘留VWF活性，根據(jù)殘留VWF活性又可得知所述樣本所含的ADAMTS-13活性。本發(fā)明在一樣本中測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VWF)裂解活性的方法的優(yōu)點(diǎn)主要在于可以免去對(duì)VWF基質(zhì)的尿素處理，使用尿素會(huì)帶來(lái)這樣的風(fēng)險(xiǎn):如果預(yù)處理時(shí)沒有嚴(yán)格遵守培養(yǎng)時(shí)間，就會(huì)測(cè)到過(guò)低的VWF活性。在現(xiàn)有技術(shù)的各種各樣方法中，必須通過(guò)用尿素或具有相似變性作用的物質(zhì)對(duì)VWF基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理來(lái)使VWF完全能夠被 ADAMTS-13 蛋白酶分解(參見 WO 2004/005451A2)。由于任何一份需要在其中對(duì)ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性加以測(cè)定的人類血漿樣本中均含有樣本固有WF,因而在對(duì)原有檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)量的同時(shí)并行測(cè)量一第二檢測(cè)標(biāo)本，是有利的；測(cè)量時(shí)，用本發(fā)明的方法對(duì)同一樣本的第二等分試樣進(jìn)行分析，但并不對(duì)與VWF基質(zhì)混合的樣本進(jìn)行與原有檢測(cè)標(biāo)本一樣長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng),而是在樣本和VWF基質(zhì)混合后立即在第二檢測(cè)標(biāo)本中測(cè)定VWF活性。在此情況下，第二檢測(cè)標(biāo)本中的VWF活性(無(wú)培養(yǎng)步驟)與原有檢測(cè)標(biāo)本中的VWF活性(經(jīng)用于實(shí)現(xiàn)VWF蛋白水解的培養(yǎng)步驟)之差就是在原有檢測(cè)標(biāo)本中被ADAMTS-13分解的VWF活性。


圖1本發(fā)明測(cè)定VWF所應(yīng)用的GPIb a-(aal-285, G233V/M239V)檢測(cè)系統(tǒng)或野生型GPIb a -ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)由實(shí)例4給出。將VWF/Faktor VIII濃縮物Haemate 的四份不同稀釋物用作樣本。在不存在瑞斯托霉素(Omg/mL)的情況下，使用突變GPIb a -(aal-285, G233V/M239V)時(shí)，VWF會(huì)發(fā)生與濃度有關(guān)的強(qiáng)烈結(jié)合(上圖)。在添加瑞斯托霉素的情況下，這種結(jié)合可小幅上升，其原因可能在于非特異性結(jié)合，這種結(jié)合即使不存在GPIba也會(huì)發(fā)生。而野生型GPIba只需添加1.2mg/mL瑞斯托霉素就會(huì)發(fā)生程度相當(dāng)?shù)腣WF結(jié)合。使用野生型GPIba時(shí)，如果不添加瑞斯托霉素，就不會(huì)出現(xiàn)任何結(jié)合現(xiàn)象(下圖)。圖2借助GPIb α乳膠粒子凝集檢測(cè)在不使用瑞斯托霉素的情況下用于在人類檸檬酸鹽血漿樣本中測(cè)定VWF活性(10%-200%VWF活性)的定標(biāo)曲線(參見實(shí)例5)。圖示內(nèi)容為與VffF活性有關(guān)的粒子凝集反應(yīng)速度。圖3借助GPIb α乳膠粒子凝集檢測(cè)在不使用瑞斯托霉素的情況下用于在人類檸檬酸鹽血漿樣本中測(cè)定低VWF活性O(shè) 3%VWF活性)的定標(biāo)曲線(參見實(shí)例5，45 μ L樣本)。圖示內(nèi)容為與VWF活性有關(guān)的粒子凝集反應(yīng)速度。圖4在樣本不含瑞斯托霉素以及在檢測(cè)標(biāo)本中存在不同Tween 20濃度的情況下以不同VWF濃度(14.9%至149.6%)進(jìn)行的GPIb α乳膠粒子凝集檢測(cè)(參見實(shí)例5，Tween 20濃度變化，15 μ L樣本)。圖5
在樣本不含瑞斯托霉素以及在檢測(cè)標(biāo)本中存在不同Thesit濃度的情況下以不同VWF濃度(8%至40%)進(jìn)行的GPIb α乳膠粒子凝集檢測(cè)(參見實(shí)例5，用Thesit代替Tween 20，45μ L 樣本)。圖 6在樣本不含瑞斯托霉素以及在檢測(cè)標(biāo)本中存在不同Thesit濃度的情況下以不同VffF濃度(已預(yù)先用乏VWF血漿或緩沖液加以稀釋)進(jìn)行的GPIb α乳膠粒子凝集檢測(cè)(參見實(shí)例 5，用 Thesit 代替Tween 20，45 μ L 樣本)。
具體實(shí)施例方式下面借助實(shí)例從試驗(yàn)角度對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)例。實(shí)例1:克隆 GPIba-(G233V/M239V)-(3XFlag)_(6XHis)組成物對(duì)表達(dá)載體pIRES neo2(BD Biosciences, Clontech,商品號(hào):6938-1)進(jìn)行改性，使其在EcoRI酶切位點(diǎn)和Notl酶切位點(diǎn)之間包含一 3 XFlag標(biāo)簽和一 6 XHis標(biāo)簽。在標(biāo)簽序列的上游(5’)嵌入一個(gè)為信號(hào)肽(SEQ IDN0:2)和人類GPIba受體(SEQ ID N0:1)的氨基酸1-285編碼的片段，這個(gè)片段在為氨基酸位置233和239編碼的位點(diǎn)上分別包含有一個(gè)為纈氨酸編碼的密碼子。實(shí)例2:在冊(cè)1(細(xì)胞中表達(dá)重組6 讓0-(6233￥/]\1239￥)-(3\ 1&8)-(6\把8)融合蛋白 用實(shí)例I中所描述的組成物轉(zhuǎn)化HEK 293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞；ATCC編號(hào):CRL-1573;海德堡 Cell Lines Service CLS)。在下列物質(zhì)中培養(yǎng)這些細(xì)胞:DMEM (商品號(hào):31966-021, Invitrogen)經(jīng)熱滅活處理的+10%FBSOrigin EU (商品號(hào):10270-106，Invitrogen)或 10%FBSOrigin USA (商品號(hào):A15-003,批號(hào):A01123-678，PAA)+l%Antibiotic-Antimycotic-SoIution (IOOx)(商品號(hào):P11-002，PAA)+0.l%Gentamycin-Solution 50mg/ml (商品號(hào) Pl 1-005，PAA)+500 μ g/ml Geneticin (G418)-Solution 50mg/ml active Geneticin (商品號(hào):10131-027, Invitrogen)表達(dá)(生產(chǎn)):0PTIPR0-SFM (商品號(hào) J23O9-Ol9, Invitrogen)+0.5%Antibiotic-Antimycotic-Solution(IOOx)(商品號(hào):Pll-002, PAA)+0.05%Gentamycin-Solution 50mg/ml (商品號(hào):Pll-005, PAA)+2%Glutamax I (100X)(商品號(hào):35050-038, Invitrogen)無(wú)Geneticin過(guò)程如下:I)將T175中的細(xì)胞(IKryo為5-lOx 10e6細(xì)胞)和培養(yǎng)物在含血清的介質(zhì)中溶解96h
2)碎裂成 4x T175，培養(yǎng) 72_96h3)碎裂成 25x T175，培養(yǎng) 72_96h4)將一個(gè)T175碎裂，并繼續(xù)培養(yǎng)以作儲(chǔ)備。將剩余的24x T175碎裂成3xCellStack Corning (每 CellStack 10 層，總共 6360cm2),培養(yǎng) 72h5)移除介質(zhì)，清洗包含DMEM但不具有FBS l_2x的單層，添加不含血清的OPTIPRO-SFM (每 CellStack1.8 升)，培養(yǎng) 96h6)收獲介質(zhì)。用離心法濾除上清液，回收溶解后的細(xì)胞團(tuán)塊，將其重新添加到具有新鮮 0PTIPR0-SFM 的 CellStack 中，培養(yǎng) 96h7)如 6)8 )最終收獲介質(zhì)，結(jié)束培養(yǎng)。實(shí)例3:親和層析分離重組 GPIba-(G233V/M239V)-(3XFlag)_(6XHis)融合蛋白通過(guò)離心分離法(35min,lOOOOUpM, Beckman J2-21,德國(guó) BeckmanCoulterGmbH)從存留的細(xì)胞或細(xì)胞片段中分離出按實(shí)例2獲得的、包含GPIb α - (G233V/M239V)-(3XFlag)-(6XHis)的介質(zhì)。使用分離限值為IOkDa的超濾盒(Ultrafiltrationskassette) (PES 10,德國(guó) Schleicher & Schiill)通過(guò)切向超濾將由此獲得的不含細(xì)胞的上清液濃縮至初始體積的1/10。用Ni2+瓊脂糖凝膠(His Prep FF16/10,瑞典GE Healthcare)按制造商指示通過(guò)親和層析法進(jìn)行純化處理。為了實(shí)現(xiàn)GPIb α - (G233V/M239V) - (3 XFlag) - (6 XHis)的結(jié)合，須在濃縮上清液中添加500mMol NaCl、20mMol Na2HPO4和5mM咪唑，并通過(guò)添加5M HCl將pH值調(diào)節(jié)至pH 7.4。通過(guò)用成分為500mMol NaCl、20mMol Na2HPO4和5mM咪唑的緩沖液(pH 7.4)沖洗導(dǎo)柱來(lái)移除未結(jié)合的成分。用成分為20mMol Na2HPO4、500mMoI NaCl, 500mMol咪唑的緩沖液(pH 7.4)對(duì)結(jié)合的 GPIb α - (G233V/M239V) - (3 XFlag) - (6 XHis)進(jìn)行洗脫處理。用超濾膜分離限值為IOkDa的超濾攪拌室(Ultrafiltrationsriihrzelle) (OMEGA10K，美國(guó)Pall Life Sciences)將由此獲得的洗脫液濃縮至初始體積的1/10。用層析柱Superdex 200prep grade 35/600 (瑞典GE Healthcare)按制造商指示通過(guò)凝膠過(guò)濾法對(duì)污染物進(jìn)行進(jìn)一步的純化和分離。用成分為0.048mol/L Na2HP04、0.02mol/L KH2PO4,
0.145mol/L NaCl、0.015mol/L似％的緩沖液(pH 7.2)以5.0ml/min的流率進(jìn)行層析處理。施加樣本后，GPIb α -(G233V/M239V) -(3XFlag) -(6XHis)以一根據(jù)約 300ml 的洗脫體積的峰值從所用的層析柱中洗脫。實(shí)例4:本發(fā)明在不使用瑞斯托霉素的抗FLAG/GPIb a -ELISA中測(cè)定VWF活性的方法使用已涂有抗Flag標(biāo)簽抗體(美國(guó)圣路易斯Sigma, ANT1-FLAG HS, M2coated96-well Plates (clear),產(chǎn)品號(hào)P 2983)的酶標(biāo)板。在該酶標(biāo)本的每個(gè)凹穴內(nèi)均加入IOOyL的磷酸緩沖液，該磷酸緩沖液含有濃度為2.4yg/mL的重組野生型GPIba-(3XFlag)-(6XHis)融合蛋白(細(xì)胞沉積后培養(yǎng)基的1:10稀釋上清液)或分離重
GPIb α - (aal-285, G233V/M239V) - (3 X Flag) - (6 X His)融合蛋白(參見實(shí)例 3)，在夜間于2-8V下進(jìn)行培養(yǎng)。用磷酸緩沖液(+0.0111,,Tween )進(jìn)行過(guò)四重清洗后，添加50 μ L經(jīng)磷酸緩沖液+0.1%牛血清白蛋白稀釋的Hamate (德國(guó)馬爾堡ZLB Behring)稀釋物和50 μ L經(jīng)磷酸緩沖液+0.1%牛血清白蛋白稀釋的瑞斯托霉素稀釋物。隨后在室溫下培養(yǎng)I小時(shí)。用上述方法進(jìn)行過(guò)四重清洗后，添加100 μ L的辣根過(guò)氧化物酶相關(guān)抗VWF抗體(RabbitAnt1-HumanVWF/HRP, DAKO, Ref.P0226),在室溫下培養(yǎng)I小時(shí)后按上述方式進(jìn)行清洗。隨后添加100 μ L用作基質(zhì)的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB Substrat,德國(guó)馬爾堡Dade BehringMarburg GmbH, Ref.450684)，在室溫下培養(yǎng)4分鐘。通過(guò)添加100 μ L的0.5Ν硫酸來(lái)終止反應(yīng)。隨后用分光光度計(jì)在405nm下測(cè)量消退度。在不存在瑞斯托霉素的情況下，使用根據(jù)實(shí)例1-3制得的突變GPIb α?xí)r，VffF會(huì)發(fā)生與濃度有關(guān)的強(qiáng)烈結(jié)合。在添加瑞斯托霉素的情況下，這種結(jié)合小幅上升，其原因可能在于非特異性結(jié)合，這種結(jié)合即使不存在GPIba也會(huì)發(fā)生。而野生型GPIba只需添加1.2mg/mL瑞斯托霉素就會(huì)發(fā)生程度相當(dāng)?shù)腣WF結(jié)合。使用野生型GPIba時(shí)，如果不添加瑞斯托霉素，就不會(huì)出現(xiàn)任何結(jié)合現(xiàn)象(圖1)。實(shí)例5:本發(fā)明在不使用瑞斯托霉素的GPIba乳膠粒子凝集檢測(cè)中測(cè)定VWF活性的方法準(zhǔn)備三種試劑:試劑1:將單克隆抗GPIba抗體VM16d (荷蘭于登Sanbio B.V.，產(chǎn)品號(hào)M0N1146)結(jié)合到乳膠粒子的表面，使粒子再懸浮在一用于長(zhǎng)期貯存的緩沖液中(0.6g/L TRIS,1.1%亮氨酸，12.5%蔗糖，0.05%HSA, 6.25mg/L慶大霉素和0.625mg/L兩性霉素，pH 8.25，乳膠濃度
0.22%)。試劑2:乏VWF血漿試劑3:將下列成分混合，產(chǎn)生總體積為30mL的試劑3:2.5mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(德國(guó)Fluka)在磷酸緩沖液(pH 7.1)中的7.5%溶液，12.9mL (0.625mg/mL)在Tris緩沖液(pH 7.1)中的異嗜性抗體阻斷劑I(Scantibodies Laboratory Inc,美國(guó) Santee, CA 92071, ), Tvveen(S) 20 (美國(guó)密蘇里州圣路易斯Sigma)在磷酸緩沖液(pH 7.2)中濃度為21g/L的3.4mL溶液，重組GPIba-(G233V/M239V)-(3xFlag)_(6xHis)(參見實(shí)例 3)在磷酸緩沖液(pH
7.1)中濃度為5.59mg/mL的0.086mL溶液，以及11.2mL 磷酸緩沖液(pH 7.1)。在自動(dòng)凝血分析儀BCS (BehringCoagulation System,德國(guó)馬爾堡 DadeBehring Marburg GmbH)上進(jìn)行檢測(cè)。將15 μ L的人類朽1檬酸鹽血衆(zhòng)樣本、30 μ L試劑2和70 μ L試劑3混合在一起。通過(guò)添加混合40 μ L試劑I來(lái)開始反應(yīng)過(guò)程。在575nm下持續(xù)對(duì)反應(yīng)混合物的消退度進(jìn)行測(cè)量。乳膠粒子的凝集速度與樣本中的VWF活性有關(guān)。為了計(jì)算VWF活性,利用標(biāo)準(zhǔn)人類血衆(zhòng)(德國(guó)馬爾堡Dade Behring Marburg GmbH)來(lái)制作定標(biāo)曲線。將標(biāo)稱瑞斯托霉素輔因子值用作該BCS 系統(tǒng)的VWF標(biāo)定值。通過(guò)在減少試劑2用量的同時(shí)提高標(biāo)準(zhǔn)人類血漿的體積，產(chǎn)生最高達(dá)200%的VWF活性。通過(guò)用試劑2稀釋該標(biāo)準(zhǔn)人類血漿，產(chǎn)生較低的VWF活性。圖2顯示的是一種典型的定標(biāo)曲線。借助于測(cè)定的反應(yīng)速度可以在該定標(biāo)曲線上讀取某一樣本的VWF活性。在一用于在樣本中測(cè)量特低VWF活性的檢測(cè)標(biāo)本中使用45 μ L樣本，而非15 μ L或30 μ L樣本(參見上文)。進(jìn)行定標(biāo)時(shí)，用試劑2稀釋標(biāo)準(zhǔn)人類血漿，從而產(chǎn)生最低達(dá)3%的低VWF活性(參見圖3)。這個(gè)檢測(cè)標(biāo)本使得對(duì)極低VWF活性的精確測(cè)定成為可能，這一點(diǎn)在形成VWF活性/抗原比率以便對(duì)血管性血友病的不同子類進(jìn)行分類時(shí)特別重要。通過(guò)將標(biāo)本中的PVP濃度提高到0.35%以及將樣本體積增大到60 μ L，可以進(jìn)一步強(qiáng)化與VWF有關(guān)的凝集反應(yīng)，還可以進(jìn)行1%VWF分化和0%VWF分化。借此可以極為可靠地將第3類血管性血友病(0%VWF)與極度缺乏的其他類型(例如1-5%)區(qū)別開來(lái)。實(shí)例6:本發(fā)明以經(jīng)尿素預(yù)處理的大分子多聚體VWF (P1648S)為VWF基質(zhì)測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法1.反應(yīng)緩沖液:lmmol/L Pefabloc SC (德國(guó)曼海姆 Roche DiagnosticsGmbH),
12.Smmol /T, BaCl2, Smmol /T, TRIS, pH 8.0 ；2.準(zhǔn)備基質(zhì)緩沖液，在室溫下精確培養(yǎng)5分鐘:8.3U/mL (830%)用重組法制成的大分子多聚體 VWF-P1648S，4.6mol/L 尿素，4.6mmol/LTRIS, pH 8.0 ；3.在15 μ L人類血漿樣本中摻入300 μ L反應(yīng)緩沖液，再與150 μ L基質(zhì)緩沖液混合；4.在37°C下將檢測(cè)標(biāo)本培養(yǎng)4至8小時(shí)；5.以如實(shí)例5所述的方式，在將該反應(yīng)混合物用作樣本的情況下測(cè)量VWF活性。實(shí)例7:本發(fā)明以經(jīng)尿素預(yù)處理的重組大分子多聚體VWF (P1648S)為VWF基質(zhì)測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法1.將6 μ L人類血漿樣本(用反應(yīng)緩沖液1:6稀釋)與20 μ L反應(yīng)緩沖液混合；2.在37°C下將該混合物培養(yǎng)5分鐘以激活A(yù)DAMTS-13蛋白酶；3.添加12μ L基質(zhì)緩沖液(5U/mL (500%)重組大分子多聚體VWF-P1648S，5mol/L尿素，5mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)；4.在37 °C下將檢測(cè)標(biāo)本培養(yǎng)20分鐘；5.以如實(shí)例5所述的方式，在將該反應(yīng)混合物用作樣本的情況下測(cè)量VWF活性。實(shí)例8:本發(fā)明以大分子多聚體VWF (P1648S)為VWF基質(zhì)測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的VWF裂解活性的方法和借助/不借助ADAMTS-13分解來(lái)求差的方法檢測(cè)I:1.將 10 μ L 人類血漿樣本 20 μ L ADAMTS-13 激活緩沖液(18.75mmol/L BaCl2, pH
8.0, 5mmol/L Tris-HCl,1.5mmol/L Pefabloc SC(德國(guó)曼海姆 Roche Diagnostics GmbH))混合；2.在37 °C下將該混合物培養(yǎng)5分鐘；3.添加 20 μ L 在 5mmol/L Tris-HCl 中的濃度為1.25U/mL (125%)的重組 VWF 基質(zhì)(P1648S)，pH 8.0 ；4.在37 °C下將檢測(cè)標(biāo)本培養(yǎng)20分鐘；5.以如實(shí)例5所述的方式，在將該反應(yīng)混合物用作樣本的情況下測(cè)量VWF活性。檢測(cè)2:以如檢測(cè)I所述的方式對(duì)同一個(gè)人類血漿樣本的另外IOyL進(jìn)行處理，但此處不實(shí)施在37°C下培養(yǎng)20分鐘的培養(yǎng)步驟(參見第4步)，而是在添加VWF基質(zhì)(P1648S)后，立即以如實(shí)例5所述的方式在將該反應(yīng)混合物用作樣本的情況下測(cè)量VWF活性。檢測(cè)I和檢測(cè)2的VWF活性差就是被分解的VWF活性，也就是ADAMTS-13活性。借助定標(biāo)曲線據(jù)此測(cè)定血漿樣本中的ADAMTS-13活性。
權(quán)利要求
1.一種在一樣本中測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VWF)裂解活性的方法，其包括下列步驟: a)將所述可能包含ADAMTS-13蛋白酶的樣本與用作基質(zhì)的分離VWF混合成一反應(yīng)標(biāo)本， b)培養(yǎng)所述反應(yīng)標(biāo)本，以及 c)測(cè)定所述反應(yīng)標(biāo)本中的殘留VWF活性， 其特征在于， 所述VWF基質(zhì)由大分子多聚體VWF構(gòu)成，所述大分子多聚體VWF包含有具有至少一處氨基酸序列變異的VWF單體，所述氨基酸序列變異使得所述VWF基質(zhì)與大分子多聚體VWF是由野生型VWF單體構(gòu)成的VWF基質(zhì)相比，可以加速ADAMTS-13的分解作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中， 所述由大分子多聚體VWF構(gòu)成的VWF基質(zhì)的VWF單體具有至少一處來(lái)自下列群組的氨基酸序列變異:P1648S、E1638K、G1505R、S1506L、M1528V、R1569del、R1597W、V1607D、G1609R、G1629E、G1631D、R1597Q、V1499E 和 Y1584C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 所述大分子多聚體VWF基質(zhì)是用重組法制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 所述大分子多聚體VWF基質(zhì)是從適當(dāng)VWF氨基酸序列變異的雜合或純合載體的捐獻(xiàn)者血漿中分離而得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 在步驟a)中再將所述樣本與肝磷脂混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 在步驟a)中再將所述樣本與分離天然GPIba蛋白和/或重組野生型GPIb α蛋白以及瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 在步驟a)中再將所述樣本與包括一氨基酸序列的重組或合成GPIba蛋白混合，所述氨基酸序列與人類GPIba蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中， 所用GPIb α蛋白的位置233和/或位置239上的氨基酸取代基Xaa由纈氨酸殘基或絲氨酸殘基構(gòu)成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 在步驟c)中通過(guò)測(cè)量瑞斯托霉素輔因子活性來(lái)測(cè)定所述反應(yīng)標(biāo)本中的殘留VWF活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中， 在步驟c)中通過(guò)下面所述的方法來(lái)測(cè)定所述反應(yīng)標(biāo)本中的殘留VWF活性: 其中，將所述反應(yīng)標(biāo)本和分離GPIba蛋白混合成一檢測(cè)標(biāo)本，其中， 使用包括一氨基酸序列的分離G PIb a蛋白，所述氨基酸序列與人類GPIb a蛋白的野生型序列(SEQ ID NO:1)相比至少包含氨基酸殘基1-268，且分別在位置233和239上具有一個(gè)氨基酸取代基Xaa，以及不在所述檢測(cè)標(biāo)本中添 加瑞斯托霉素和美洲矛頭腹毒蛋白。。
全文摘要
本發(fā)明屬于凝血診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在一樣本中體外測(cè)定血管性血友病因子(VWF)活性的方法。所述方法包括對(duì)GPIbα蛋白功能獲得性變異體的使用，這樣就可放棄對(duì)瑞斯托霉素、美洲矛頭腹毒蛋白(Botrocetin)或與瑞斯托霉素或美洲矛頭腹毒蛋白等效的其他物質(zhì)的使用。本發(fā)明此外還涉及一種測(cè)定ADAMTS-13蛋白酶的血管性血友病因子(VWF)裂解活性的方法。
文檔編號(hào)G01N33/86GK103076459SQ20121044732
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者哈拉爾德·阿爾特豪斯, 托比亞斯·奧布斯?fàn)? 于爾根·帕茨克, 賴因哈德·施內(nèi)彭海姆 申請(qǐng)人:西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限責(zé)任公司