抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽的分離富集方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可以高效富集抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽的分離富集方法，其特征在于以MWNTs-COOH為固相載體，在MWNTs-COOH表面修飾上TiO2納米顆粒，具備對轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽有高選擇性效果，達到特異性分離的目的，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆中磷酸肽的靈敏檢測。
【專利說明】抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽的分離富集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磷酸肽新型富集材料MWNTs-COOH的合成以及利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆中磷酸肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆商品化以來，已經(jīng)建立了不少的檢測方法，以檢測核酸為目標(biāo)的各種PCR檢測技術(shù)以及PCR快速檢測試劑盒；以檢測外源蛋白為目標(biāo)的ELISA檢測技術(shù)以及酶聯(lián)免疫快速檢測試紙條、試劑盒，這些檢測方法都可以為鑒定轉(zhuǎn)基因作物以及為轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全評價提供技術(shù)支持。但是自中國2009年批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)安全證書的釋放，成為第一個批準(zhǔn)主糧商業(yè)化種植的國家后，對轉(zhuǎn)基因作物安全性評價、特別是轉(zhuǎn)基因作物在食品安全性評價方面提出更高的要求。
[0003]生物信息是按DNA — mRNA —蛋白質(zhì)一代謝產(chǎn)物方向流動的，代謝物是細胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，它們的種類和數(shù)量變化被視為生物系統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)(Fiehn，2002)，轉(zhuǎn)基因作物均是通過調(diào)控基因的表達來控制目的性狀的改變，基因表達上極微小的變化即可導(dǎo)致代謝物種類、含量、分布的大幅改變。因此，對轉(zhuǎn)基因作物代謝物的分離鑒定，檢測分析可以為生物安全、特別是食品安全相關(guān)預(yù)警信號提供一個預(yù)知平臺，也可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在安全性評價方面提供一種新的技術(shù)。
[0004]由于植物代謝物在時間和空間都具有高度的動態(tài)性，且產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期的特異性，難于進行分離鑒定，所以人們一直在尋找更為強大的檢測分析方法，力求可檢測到樣品中的每種代謝物。代謝物的分析通常有兩種方法。一種方法稱作代謝物指紋分析，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的方法，比較不同樣品中各自的代謝產(chǎn)物以確定其中所有的代謝產(chǎn)物。代謝指紋分析涉及比較不同個體中代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰，最終了解不同化合物的結(jié)構(gòu)，建立一套完備的識別這些不同化合物特征的分析方法。另一種方法是代謝輪廓分析，研究人員假定了一條特定的代謝途徑，并對此進行更深入的研究，再結(jié)合模式識別方法，有可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物。
[0005]用于代謝物檢測的主要技術(shù)手段是核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)，色譜(HPLC，GC)等。對于代謝產(chǎn)物來說，不僅只有質(zhì)譜峰這個特征，由于質(zhì)譜只能檢測離子化的物質(zhì)，但有些代謝產(chǎn)物在質(zhì)譜儀中不能被離子化，因此，質(zhì)譜(MS)并不能檢測出所有的代謝產(chǎn)物。此夕卜，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物的同質(zhì)性不高，由于缺乏均勻性，使色譜分析變得更加困難，無法識別出樣品中的未知物質(zhì)。采用核磁共振(NMR)的方法，可以彌補色譜的不足，但由于核磁共振檢測的靈敏度不高，所以只用于分析低豐度代謝產(chǎn)物。因此，對代謝產(chǎn)物的分析最大的挑戰(zhàn)就是對代謝產(chǎn)物的識別以及高效的檢測方法。
[0006]抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆中外源EPSPS基因的表達阻斷植物體內(nèi)芳香族氨基酸和某些由其參與合成的維生素、生物堿、香豆素、類黃酮、木質(zhì)素、吲哚衍生物、酚類物質(zhì)等次生代謝物的生物合成。在這個過程中，一小部分蛋質(zhì)發(fā)生磷酸化，并且被大量的非磷酸肽所遮蔽，很難檢測，為了更加靈敏的檢測轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因在磷酸肽含量方面的差異，建立一種 高靈敏度和高特異性檢測磷酸肽的方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種可以高效富集抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽的分離富集方法，可以更加靈敏的檢測轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆在磷酸肽含量方面的差異。
[0008]本發(fā)明提供的一種新型聞效富集材料和富集方法為:
[0009]1、以MWNTs-COOH為固相載體，通過水熱法在MWNTs-COOH表面修飾上TiO2納米顆粒，合成了一種高效富集材料，利用標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白β -casein對其富集效率進行評價表明此方法對磷酸肽有較高的選擇性，富集效率可以達到25mg/g。
[0010]2、磷酸化肽的分離，富集及檢測被以下方法實現(xiàn):
[0011]I)以50%的乙腈作為上樣溶劑，將含有目標(biāo)物磷酸肽的上樣溶劑流過裝有IOmg新合成高效富集材料的固相萃取柱；
[0012]2)以濃度為0.1%的IOml三氟乙酸清洗上述吸附有目標(biāo)物的固相萃取柱3次，收集洗脫液。
[0013]3)所收集的洗脫液使用液質(zhì)進行磷酸肽含量測定。
[0014]本發(fā)明提供的方法可以解決在實際樣品中由于磷酸肽含量豐度很低并且被大量的非磷酸肽所抑制而造成的檢測困難問題，可以簡便高效的實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆種子萌發(fā)過程中磷酸肽變化情況的檢測。
【具體實施方式】
[0015]實施例1、高效富集材料的合成
[0016]稱取羧基化多壁碳納米管IOOmg于25mL圓底燒瓶中，在濃硫酸/硝酸(V/V =I: I)的條件下超聲4h，之后抽濾，用去離子水將MWNTs-COOH沖洗到中性。隨后將沖洗好的MWNTs-COOH在超聲條件下分散到IOOg正丁醇中得到懸浮液，接著將含有40%鈦酸正丁酯(TBT)的正丁醇溶液在攪拌的條件下加入到先前得到的懸浮液中。MWNTs-COOH和TBT的混合物磁力攪拌SOmin后在室溫下靜置6h，離心和在室溫下干燥48h后，得到黑色混合物將其研磨成粉末轉(zhuǎn)入到IOOmL反應(yīng)釜中，加入30ml的去離子水，280°C反應(yīng)3小時后自然冷卻到室溫。經(jīng)過真空抽濾，80°C條件下干燥后。
[0017]實施例2、磷酸肽的粗分離條件
[0018]將用水浸泡24小時和48小時的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆種子的磷酸肽首先使用離子交換色譜進行粗分離。分離條件為:色譜柱使用Hypersil SCX強陽離子交換柱(Ther-moKeystone,4.6mmX 150mm, 5 μ m, 30nm);流動相:A為8mmol/L ΝΗ4Η2Ρ04/40% 乙臆，pH= 2.7,B 為 A+245mmol/L NH4Cl,流速為 0.7mL/min，檢測波長為 214nm。
[0019]實施例3、磷酸肽富集
[0020]精確稱取TiO2-MWNTs納米復(fù)合材料10mg，先用去離子水振蕩洗滌，離心后棄上清得到沉淀，在用30% ACN-0.1% TFA上樣緩沖液將材料重新懸浮，振蕩條件下平衡材料IOmin,離心后棄上清得到沉淀。
[0021]取20 μ L粗分離液體，用30% ACN-0.1 % TFA的上樣緩沖液稀釋至ImL入到先前處理好的材料中，室溫條件下振蕩孵育80min，之后15000rpm條件下離心，棄去上清液收集沉淀。沉淀物先用800μ? 80% ACN-5% TFA振蕩洗滌一次，離心后棄去上清液，再用80% ACN-0.1% TFA振蕩洗滌兩次，離心后棄去上清液得到沉淀。最后，用200 μ L0.4mol/L的氨水在超聲的條件下洗脫TiO2-MWNTs納米復(fù)合材料，洗脫液凍干后重新復(fù)溶在60%ACN-0.1% TFA中，用于隨后的質(zhì)譜分析中。
[0022]實施例4、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件
[0023]Surveyor 液相部分:(I)色譜柱:Zorbax Eclipse Plus C18,2.1 X 150mm, 3.5 μ m ；
(2)柱溫:25°C ；(3)流動相及梯度洗脫程序:乙腈(A)-水⑶(0.1 %甲酸)，洗脫程序為5% -50% A,95% -50% B。(4)流速:0.2mL min-1 ； (5)進樣體積:10μ L ；(6)分析時間:45min ； (7)后運行時間:IOmin ；
[0024]LCQ Advantage MAX質(zhì)譜部分:(I)離子源:ESI ； (2)掃描方式:正離子掃描；(3)檢測模式:全掃描，Mass range, m/z 400-1800 ； (4)霧化氣:氮氣；(5)霧化器壓力:40psi ；(6)毛細管電壓:4500V ; (7)干燥氣溫度:350oC ;(8)輔助氣流速:5arb ; (9)鞘氣流速:30arb；(10)質(zhì)量分析器:三維離子阱。
[0025]對主要峰進行二級質(zhì)譜分析時，一級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴二級質(zhì)譜掃描模式(DataDependentMS/MS Scan),依次選取一級質(zhì)譜中離子強度最強的五個離子進行CID串聯(lián)質(zhì)譜，碰撞歸一化能量為35%;采用串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除功能(dynamic exclusion),設(shè)置排除時間為3min。`
【權(quán)利要求】
1.一種可以檢測轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其特征在于使用一種新合成的高效富集材料，具備對轉(zhuǎn)基因大豆種子中磷酸肽有高選擇性效果，達到特異性分離的目的，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆中磷酸肽的靈敏檢測。
2.權(quán)利要求1所述及的高效富集材料，是以MWNTs-COOH為固相載體，通過水熱法在MWNTs-COOH表面修飾上TiO2納米顆粒，合成的一種高效富集材料。
3.權(quán)利要求1所述及的磷酸肽選擇性富集方法包括: 1)以50%的乙腈作為上樣溶劑，將含有目標(biāo)物磷酸肽的上樣溶劑流過裝有IOmg權(quán)力要求2所合成的富集材料的固相萃取柱； 2)以濃度為0.1%的IOml三氟乙酸清洗上述吸附有目標(biāo)物的固相萃取柱3次，收集洗脫液。
【文檔編號】G01N30/08GK103808837SQ201210449335
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月12日
【發(fā)明者】王俊英, 王俊平, 林敏
申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所