專利名稱：乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測小麥球蛋白的高靈敏ELISA試劑及制備方法，可應(yīng)用于牛奶中小麥蛋白摻偽快速篩查檢測，以及蛋白飲品中小麥球蛋白過敏原的快速定性檢測。
背景技術(shù)：
不同來源的蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值有別，一般來說，牛奶中蛋白質(zhì)含有人體生長發(fā)育的一切必需的氨基酸，消化率可達(dá)98% 100%，為完全蛋白質(zhì)，因而具有較高的營養(yǎng)價值，植物蛋白白中缺少必需氨基酸，且在人體消化吸收和利用程度也較差，因而營養(yǎng)價值相對較低。根據(jù)其不同的溶解性，可將小麥中的蛋白質(zhì)分為清蛋白(溶于水和稀的緩沖液)、球蛋白(溶于鹽溶液)、麥谷蛋白(溶于稀酸和稀堿溶液)和醇溶蛋白(溶于70% 90%乙醇)，后兩種蛋白主要影響面粉面筋性能。由于生產(chǎn)來源及加工工藝的因素，市場上動物奶蛋白價格遠(yuǎn)高于植物蛋白。在利潤的驅(qū)使下，采用植物蛋白代替動物蛋白、在乳品及含蛋白飲料中摻假的情況時有發(fā)生；曾有過牛奶中摻小麥粉的報道，也存在摻小麥蛋白的可能性。這種摻假盡管質(zhì)量安全危害性較低，但降低了乳品應(yīng)有的價值，具有欺騙消費者、擾亂市場秩序的惡果。為確保產(chǎn)品的真實性，有必要建立快速檢測小麥球蛋白的方法。另據(jù)報道，國外約有30%的人群對特定食物有過敏反應(yīng)，我國一項針對15 24歲健康人群的調(diào)查顯示,在15 24歲年齡段健康人群中，約有6%的人曾患有食物過敏。估計20% 65%的過敏性腸道綜合征和消化不良患者的病因與食物過敏有關(guān)。小麥被認(rèn)為是一種主要的食物過敏原，它是FA0(1995)報告的八類常見過敏食物之一。雖然目前全世界缺乏有關(guān)小麥過敏的發(fā)病率統(tǒng)計數(shù)據(jù)，但小麥過敏仍然是一個不可忽視的食品安全問題，小麥球蛋白是小麥蛋白成分中的主要過敏原之一。對于食物過敏，目前還沒有有效的治療手段，患者只能通過嚴(yán)格避免過敏源來避免癥狀的發(fā)生。因此，食品中過敏原的檢測也就成為食源性過敏控制的主要手段。目前關(guān)于乳及蛋白飲品中小麥球蛋白的快速定性方法鮮見報道，針對蛋白成分檢測技術(shù)主要有SDS-PAGE、PCR、液相色譜和質(zhì)譜等；上述技術(shù)僅適合應(yīng)用于實驗室分析，不適合于普通消費者使用。由于乳及蛋白飲品消費群體廣，有必要建立一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高靈敏的定性檢測試劑，供廣大消費者自行使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對以上背景和技術(shù)需求，提供一種酶聯(lián)免疫吸附試劑(ELISA)以及制備方法，用于乳及蛋白飲品中小麥球蛋白的快速定性檢測；所述試劑及方法應(yīng)具有操作簡便、快速、結(jié)果直觀、高靈敏的特點。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛深入的研究，通過提取、純化麥胚粉中小麥球蛋白，制備小麥球蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，獲得了采用單克隆抗體捕獲目標(biāo)、多克隆抗體檢測的雙抗夾心法所需的檢測試劑，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，包括以下分別封裝的組分及含量鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體80_120ng/ml,其余是緩沖液；兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體70_90ng/ml,其余是緩沖液；底物顯色劑A液醋酸鈉26-28g/l，檸檬酸3-3. 5g/l，30%雙氧水O. 5-0. 7ml/l，其余為蒸懼水；底物顯色劑B液乙二胺四乙酸二鈉O. 3-0. 5g/l，檸檬酸1.8-2. Og/Ι，甘油O. 09-0. 111/1，TMB O. 28-0. 32g/l, DMSO 5_7ml/l，其余為蒸餾水；終止液1. 8-2. 2mol/L硫酸溶液。所述乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，包括以下分別封裝的組分及
含量鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體100ng/ml,其余是緩沖液；兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體80ng/ml,其余是緩沖液；底物顯色劑A液醋酸鈉27g/l，檸檬酸3. 2g/l，30%雙氧水O. 6ml/l，其余為蒸餾水；底物顯色劑B液乙二胺四乙酸二鈉O. 4g/l，檸檬酸1. 9g/l，甘油O. 11/1，TMBO. 30g/l, DMSO 6ml/l，其余為蒸餾水；終止液2. OmoI/L硫酸溶液。所述緩沖液是磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸鹽中的一種或多種。乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑的制備方法，其特征在于其中的鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體的制作方法是I)麥胚粉干熱滅酶，正己烷脫脂；用去離子水反復(fù)洗滌，充分洗去麥胚粉中水溶的清蛋白，洗滌后的沉淀溶于3% — 10%NaCl溶液，取上清為小麥球蛋白鹽溶液粗提物。將粗提小麥蛋白鹽溶液對去離子水透析過夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀3次，冷凍干燥，即為純化小麥球蛋白，作為抗原；2)用所制備的抗原免疫小鼠,取其脾臟的B細(xì)胞,將B細(xì)胞核骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選針對抗原蛋白表位的單克隆抗體分泌型雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔，8-10天后收集腹水，采用Protein G親和層析柱純化，獲得鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體；其中的兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體的制作方法是I)麥胚粉干熱滅酶，正己烷脫脂；用去離子水反復(fù)洗滌，充分洗去麥胚粉中水溶的清蛋白，洗滌后的沉淀溶于3% — 10%NaCl溶液，取上清為小麥球蛋白鹽溶液粗提物。將粗提小麥蛋白鹽溶液對去離子水透析過夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀3次，冷凍干燥，即為純化小麥球蛋白，作為抗原；2)用所制備的抗原免疫新西蘭白兔,取兔血清,采用Protein A親和層析柱純化,獲得兔抗小麥球蛋白多克隆抗體；采用戊二醛將HRP與兔抗小麥球蛋白多克隆抗體偶聯(lián)，賴氨酸封閉殘留的醛基，采用Sephadex G-200凝膠柱層析純化，獲得兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體。所述底物顯色劑中的A、B分別液避光保存，使用的時候根據(jù)需要量取等量A與B液混勻后使用。
本發(fā)明使用時的操作步驟如下I)將鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體；接著洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2)在固相抗體加上受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng)；使標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物；然后洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3 )在步驟2 )所述復(fù)合物上添加兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體(酶標(biāo)抗體)，保溫反應(yīng)；使復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，然后徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4)加底物顯色；若固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，即可得知受檢標(biāo)本中帶有小麥球蛋白；通過比色，還可測知標(biāo)本中的抗原量。本發(fā)明得到的小麥球蛋白和單克隆抗體SDS-PAGE電泳結(jié)果見

圖1 ;圖中M:蛋白分子Marker ；1:小麥球蛋白；2 :小麥球蛋白單克隆抗體?！膱D中可以看出，純化后的小麥球蛋白主要有六條譜帶，其分子量依次為57. 8kDa、41. 8kDa、38. 7kDa、24.1kD a、16. 5kDa 和 14. 3kDa。經(jīng)粗測，所提取的小麥球蛋白純度達(dá)到95%以上。純化后的單克隆抗體共有兩條譜帶，分別為55kDa (重鏈)和27kDa (輕鏈)，純度達(dá)98%以上。所制備的試劑對小麥球蛋白檢測的靈敏度將純化抗原的濃度稀釋到O. 5 μ g/mL，之后連續(xù)作2倍梯度稀釋，按確定的ELISA條件進(jìn)行測定，靈敏度測試結(jié)果見圖2。由圖2可知，檢測試劑對小麥球蛋白的檢測限均在10ng/mL左右，顯示出良好的靈敏度。所制備的試劑對小麥球蛋白檢測的的特異性分別用牛奶α -酪蛋白(a-casein)、大麥球蛋白(Barley globulin)、小麥清蛋白(Wheat albumin)、小麥醇溶蛋白(Wheat gliadin)、玉米醇溶蛋白(Zein)和花生球蛋白(Arachin)、小麥粉、喬麥粉、豆?jié){、玉米汁、雞蛋面條等樣品進(jìn)行測試，測試結(jié)果見表1，所制備的檢測試劑可正確識別小麥球蛋白和含該蛋白的樣品，與其他樣品無交叉情況，顯示出良好的特異性。表I小麥球蛋白ELISA方法的特異性和實際樣品測試
權(quán)利要求
1.乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，包括以下分別封裝的組分及含量 鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體80-120ng/ml，其余是緩沖液；兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體70-90ng/ml，其余是緩沖液；底物顯色劑A液醋酸鈉26-28g/l，檸檬酸3-3. 5g/l，30%雙氧水O. 5-0. 7ml/l，其余為蒸餾水；底物顯色劑B液乙二胺四乙酸二鈉O. 3-0. 5g/l，檸檬酸1. 8-2. Og/Ι,甘油0.09-0. 111/1，TMB O. 28-0. 32g/l, DMSO 5_7ml/l，其余為蒸餾水；終止液1. 8-2. 2mol/L硫酸溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，其特征在于所述檢測試劑包括以下分別封裝的組分及含量鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體100ng/ml,其余是緩沖液；兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體80ng/ml,其余是緩沖液；底物顯色劑A液醋酸鈉27g/l，檸檬酸3. 2g/l，30%雙氧水O. 6ml/l，其余為蒸餾水； 底物顯色劑B液:乙二胺四乙酸二鈉0.4g/l，檸檬酸1.9g/l，甘油O. 11/1，TMB O. 30g/1,DMSO 6ml/l，其余為蒸餾水；終止液2. OmoI/L硫酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，其特征在于所述緩沖液是磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸鹽中的一種或多種。
4.權(quán)利要求1所述乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑的制作方法，其特征在于所述鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體的制作方法是O麥胚粉干熱滅酶，正己烷脫脂；用去離子水反復(fù)洗滌，充分洗去麥胚粉中水溶的清蛋白，洗滌后的沉淀溶于3%-10%NaCl溶液，取上清為小麥球蛋白鹽溶液粗提物。將粗提小麥蛋白鹽溶液對去離子水透析過夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀3 次，冷凍干燥，即為純化小麥球蛋白，作為抗原；2)用所制備的抗原免疫小鼠，取其脾臟的B細(xì)胞,將B細(xì)胞核骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選針對抗原蛋白表位的單克隆抗體分泌型雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔，8-10 天后收集腹水，采用Protein G親和層析柱純化，獲得鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體；所述兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體的制作方法是1)麥胚粉干熱滅酶，正己烷脫脂；用去離子水反復(fù)洗滌，充分洗去麥胚粉中水溶的清蛋白，洗滌后的沉淀溶于3% — 10%NaCl溶液，取上清為小麥球蛋白鹽溶液粗提物。將粗提小麥蛋白鹽溶液對去離子水透析過夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀3 次，冷凍干燥，即為純化小麥球蛋白，作為抗原；2)用所制備的抗原免疫新西蘭白兔，取兔血清，采用ProteinA親和層析柱純化，獲得兔抗小麥球蛋白多克隆抗體；采用戊二醛將HRP與兔抗小麥球蛋白多克隆抗體偶聯(lián)，賴氨酸封閉殘留的醛基，采用Sephadex G-200凝膠柱層析純化，獲得兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，其特征在于所述底物顯色劑中的A、B分別液避光保存，使用的時候根據(jù)需要量取等量A與B液混勻后使用.
全文摘要
本發(fā)明涉及乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑及制備方法。目的是提供的試劑及方法應(yīng)具有操作簡便、快速、結(jié)果直觀的特點。技術(shù)方案是乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑，包括以下分別封裝的組分及含量鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體、緩沖液；兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體、緩沖液；底物顯色劑A液；底物顯色劑B液；終止液。乳及蛋白飲品中小麥球蛋白快速定性檢測試劑的制備方法，其中的鼠抗小麥球蛋白單克隆抗體的制作方法是1)制取抗原；2)用所制備的抗原免疫小鼠，經(jīng)過處理獲得所述抗體；其中的兔抗小麥球蛋白酶聯(lián)多克隆抗體的制作方法是1)制取抗原；2)用所制備的抗原免疫新西蘭白兔，經(jīng)過處理獲得所述抗體。
文檔編號G01N33/577GK102998461SQ20121047218
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者肖海龍, 屠海云 申請人:杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院