專利名稱：一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素生產(chǎn)及研究技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種通過(guò)利用固定于高速振蕩器上的振蕩架，將多組裝有有機(jī)溶劑，振蕩破碎珠和待提取樣品的封閉破碎管進(jìn)行同時(shí)振蕩。借助于振蕩破碎珠的碰撞碾磨效應(yīng)以及有機(jī)溶劑的萃取效應(yīng)，從而將各破碎管中細(xì)胞內(nèi)所含的類胡蘿卜素同時(shí)進(jìn)行溶解抽提，從而實(shí)現(xiàn)分析樣本的類胡蘿卜素高通量快速提取。
背景技術(shù)：
胡蘿卜素(Carotene)最早由Wackenroder在1831年從胡蘿卜中分離出，β-胡蘿 卜素的分子式由Willstather在1906年測(cè)定，而結(jié)構(gòu)式在1928年-1932年為Zechmeister等確定。胡蘿卜素是一種橙色的光合色素，廣泛存在于綠色和黃色蔬菜以及水果中，使其帶有橙色，并在光合作用中扮演傳遞能量的角色。胡蘿卜素屬于屬四萜類化合物。在其分子的兩端各有一個(gè)紫蘿酮環(huán)，中心斷裂可產(chǎn)生兩個(gè)維生素Α，是視黃醇(維生素Α)的二聚物且擁有多種結(jié)構(gòu)，最主要的兩種是α-胡蘿卜素與β-胡蘿卜素，此外還有Υ-胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素與ε -胡蘿卜素三種。β-胡蘿卜素分子式是C4tlH56，分子量約536. 88。由于該化合物分子中具有長(zhǎng)的共軛雙鍵生色基團(tuán)，因而具有光吸收的性質(zhì)，使其顯黃色，在紫外光譜中有三個(gè)吸收峰(455nm, 483nm和340nm)。β -胡蘿卜素主要有全反式，9-順式，13-順式及15-順式四種形式，其中天然的β_胡蘿卜素主要是全反式異構(gòu)體和少量順式異構(gòu)體。這主要是因?yàn)樵陧樖浇Y(jié)構(gòu)中，雙鍵附近的氫原子之間或氫原子和甲基基團(tuán)之間會(huì)產(chǎn)生較大的空間位阻，而造成順式結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。9-順式-β-胡蘿卜素在疏水溶劑中溶解容易，結(jié)晶困難，通常以油狀物出現(xiàn)，而全反式-β -胡蘿卜素結(jié)晶較為容易。β -胡蘿卜素?zé)o臭無(wú)味，稀溶液呈橙黃色至黃色，濃度增大時(shí)帶橙色，因溶劑極性不同可能稍帶紅色。β_胡蘿卜素的結(jié)晶為暗紅紫色六角棱晶或暗紅色菱形片晶。在真空中的熔點(diǎn)為184°C，由于它的分子結(jié)構(gòu)中不存在不對(duì)稱碳原子，因而不具備旋光性。β-胡蘿卜素易溶于二硫化碳、二氯甲烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、丙酮、石油醚、己烷和植物油，不溶于水，難溶于醚、丙二醇、甘油、丙二醇、甲醇、乙醇、酸和堿。其在橄欖油和苯中的溶解度均為O. lg/mL，在氯仿中的溶解度為43g/l，高濃度時(shí)呈橙紅色，低濃度時(shí)呈橙色至黃色。β -胡蘿卜素在PH值2 7的范圍內(nèi)較穩(wěn)定，且不受還原性物質(zhì)的影響，但對(duì)光和氧均不穩(wěn)定，易在光照和加熱時(shí)發(fā)生氧化反應(yīng)。鐵離子會(huì)促使其褪色。自1831年Wzckenerler首次成功分離胡蘿卜素以來(lái)，世界上科學(xué)家們對(duì)胡蘿卜素的研究一直沒(méi)有停止過(guò)。近年來(lái)，有關(guān)β_胡蘿卜素對(duì)人體作用的研究異?；钴S。β_胡蘿卜素有維生素A源之稱，是一種重要的人體生理功能活性物質(zhì)，其在肝臟中可以轉(zhuǎn)變成維生素Α，是維生素A合成的前體[β-胡蘿卜素的合成.忻祥法，黃綺玲，俞國(guó)強(qiáng)，王慧倩，邵文文，金光衛(wèi)，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1985. 16(2) :54-55.]。盡管β-胡蘿卜素的生物活性機(jī)制尚未完全了解，Blumberg在1994年柏林召開(kāi)的第二屆抗氧化劑維生素在預(yù)防疾病中的作用的國(guó)際會(huì)議時(shí)已經(jīng)提出，β_胡蘿卜素至少有以下幾方面的功能(I) β _胡蘿卜素是維生素A的前體，而維生素A是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)成分；(2)具有免疫功能，能提高人體免疫系統(tǒng)抵抗病原物的能力；(3)具有抗氧化劑的功能，能夠淬滅單線態(tài)氧，清除體內(nèi)自由基的影響；(4)能預(yù)防癌癥，延緩癌癥的發(fā)展；(5)促進(jìn)細(xì)胞縫間連接交流。目前，胡蘿卜素在抗炎、解毒、抗癌、預(yù)防心血管疾病、防治白內(nèi)障和保護(hù)肝臟方面的生理作用也已被越來(lái)越多地證實(shí)，并應(yīng)用于疾病的預(yù)防和治療[Considerations of the scientificsubstantiation for antioxidant vitamins and beta—carotene in disease prevention. Blumberg, J.，Am J Clin Nutr,1995. 62(6) : 1521S-1526S.]。最近一項(xiàng)通過(guò)對(duì)4000多名內(nèi)科醫(yī)師長(zhǎng)達(dá)18年的研究表明，長(zhǎng)期隔日服用50mg的β-胡蘿卜素可以有效的防治男性大腦意識(shí)的衰退[Grodstein, F.，J. H. Kang, R. J. Glynn, N. R. Cook, and J. M. Gaziano, A Randomized Trial of Beta Carotene Supplementation and CognitiveFunction in Men The Physicians' Health Study II.Arch Intern Med, 2007. 167(20) :2184_2190]。此外，β -胡蘿卜素還可以作為著色和抗氧化添加劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和動(dòng)物飼料等行業(yè)。
β -胡蘿卜素根據(jù)生產(chǎn)方式不同分為化學(xué)合成β -胡蘿卜素和天然β _胡蘿卜素兩大類。其中包括β-胡蘿卜素在內(nèi)的類胡蘿卜素廣泛存在于生物界中，包括植物、動(dòng)物、 藻類和微生物等，它們是天然類胡蘿卜素的豐富來(lái)源。雖然天然β_胡蘿卜素生產(chǎn)成本較高，但由于不存在致癌物質(zhì)，水溶性較好，具有良好的生理活性，且常常與其他類胡蘿卜素等抗氧化天然活性產(chǎn)物復(fù)合在一起，因此具有很好的抗哮喘、抗染色體畸變和防癌等藥理活性。天然β-胡蘿卜素目前已被國(guó)際癌癥研究中心及美國(guó)國(guó)家癌癥研究所認(rèn)可，并經(jīng)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)為A類營(yíng)養(yǎng)食品添加劑。隨著人們對(duì)天然營(yíng)養(yǎng)和保健產(chǎn)品認(rèn)識(shí)的不斷提高，以及食品安全問(wèn)題的日益重視(尤其是近年來(lái)違法使用瘦肉精、吊白塊、蘇丹紅、三聚氰胺、梓檬黃和鄰苯二甲酸酯等人工色素和食品添加劑現(xiàn)象的曝光)，天然色素及安全的食品添加劑(例如，天然色素β-胡蘿卜素等)將逐步在市場(chǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位。
目前，天然β _胡蘿卜素主要可通過(guò)植物提取、鹽藻法和微生物發(fā)酵三種方法生產(chǎn)。其中，微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)穩(wěn)定，受季節(jié)、氣候、時(shí)間和地域因素影響小，生產(chǎn)周期較短，質(zhì)量控制相對(duì)比較容易等優(yōu)勢(shì)。另外，通過(guò)發(fā)酵規(guī)模的放大，也較為容易滿足目前對(duì)天然類胡蘿卜素日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。鑒于以上特點(diǎn)，研究人員對(duì)天然分離得到的產(chǎn)β_胡蘿卜素微生物進(jìn)行了系統(tǒng)的比較和研究，并通過(guò)誘變篩選和發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)了一些極有應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)微生物菌株。
無(wú)論何種來(lái)源的天然β-胡蘿卜素，其工業(yè)生產(chǎn)菌株、藻種以及各類動(dòng)植物皆經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的誘變、雜交、基因工程改造以及篩選工作，從而使得生物來(lái)源的組織細(xì)胞，能夠在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中大量積累β_胡蘿卜素，以降低生產(chǎn)成本并獲得符合預(yù)期的市場(chǎng)利潤(rùn)。在以上工業(yè)菌株(包括各類微生物、藻種、動(dòng)植物及相應(yīng)的細(xì)胞系)選育過(guò)程中，對(duì)培養(yǎng)得到的生物體組織細(xì)胞中的β-胡蘿卜素進(jìn)行提取和分析，是目前表征生物體組織細(xì)胞生產(chǎn)及積累β_胡蘿卜素能力高低的唯一和必須手段。
根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)各類生物體組織細(xì)胞進(jìn)行破碎并對(duì)細(xì)胞中的β _胡蘿卜素進(jìn)行提取的方法主要分為物理法和化學(xué)法。其原理為借助于各類溶劑體系，直接滲入細(xì)胞5中提取(例如，超臨界流體)或借助各類物理或化學(xué)過(guò)程使細(xì)胞破裂甚至粉碎后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的β-胡蘿卜素進(jìn)行溶解萃取。
孫景茂發(fā)明《一種從胡蘿卜中提取天然β胡蘿卜素的工藝》(公開(kāi)號(hào)CN1092063 ；
公開(kāi)日1994.09. 14)。它以干燥的胡蘿卜為原料，以沸點(diǎn)低于80°C，室溫下為液體的有機(jī)溶劑為提取劑，以胡蘿卜重量與溶劑體積之比為1 I. 5 5，浸取溫度為室溫，經(jīng)過(guò)罐組逆流浸出器提取，刮板式薄膜蒸發(fā)器蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶，洗滌，重結(jié)晶，干燥可得含80 % 90%的β-胡蘿卜素晶體。
中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所的陳濤等人發(fā)明了《一種三孢布拉氏霉菌中胡蘿卜素的提取方法》(公開(kāi)號(hào)CN1221737 ;
公開(kāi)日1999. 07. 07)所述方法是采用低沸點(diǎn)的石油系有機(jī)溶劑萃取菌中的胡蘿卜素。萃取溶劑與菌體積比為I 10 : 1，溫度為40°C 70°C， 每次為O. 5小時(shí) I小時(shí),萃取二次,并合并萃取液。
西格弗里德·彼得等人發(fā)明了《從含有胡蘿卜素的原料中提取胡蘿卜素的方法》(國(guó)際公布W099. 58611英；
公開(kāi)日1999· 11. 18 ;公開(kāi)號(hào)CN1297469 ;
公開(kāi)日
2001.05.30)。該方法主要從含有胡蘿卜素的原料中、特別是從生物學(xué)來(lái)源的脂肪和油中提取胡蘿卜素的方法，該方法包括用提取劑利用逆流流程提取所述含有胡蘿卜素的原料， 所述提取劑包含選自下列成員的至少一種物質(zhì)乙腈、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、N，N-二甲基乙酰胺、糠醛、嗎啉、4-甲?；鶈徇?-乙?；鶈徇?-甲基嗎啉、 4-苯基嗎啉。
上?；ぱ芯吭旱耐毜热税l(fā)明了《β-胡蘿卜素的提取方法》(公開(kāi)號(hào) CN1331342;公開(kāi)·日2002. 01. 16)。該方法是將發(fā)酵液過(guò)濾得到的濕菌絲體，進(jìn)行離心過(guò)濾得到菌絲體。隨后，將菌絲體配成10%的水溶液，并利用珠磨機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破損。破碎后的菌絲體，利用95%的乙醇(或無(wú)水乙醇)進(jìn)行兩次逆流脫水。脫水后的濾餅以溶劑油進(jìn)行三次逆流萃取提取β_胡蘿卜素。提取液經(jīng)結(jié)晶、真空干燥后得到β_胡蘿卜素晶體。
中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所的童驍?shù)热税l(fā)明了《胡蘿卜素的提取方法》(公開(kāi)號(hào) CN1363554 ;
公開(kāi)日2002. 08. 14)。該發(fā)明利用石油有機(jī)溶劑在40°C 70°C萃取三孢布拉氏霉菌菌體中的胡蘿卜素30min/次 60min/次。共反復(fù)萃取兩次，合并得到萃取液。所得萃取液用適量的堿在40°C 60°C進(jìn)行精煉中和其中的游離脂肪酸，得到的萃取液用清水或鹽水洗滌至中性，得到中性萃取液，然后再將萃取液經(jīng)濃縮、結(jié)晶、脫膠和脫溶可得到胡蘿卜素晶體和油溶品。
中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的孫君社等人發(fā)明公開(kāi)了《一種提取β_胡蘿卜素的方法》(公開(kāi)號(hào)CN1683334 ;
公開(kāi)日2005. 10. 19)。該方法利用蛋白酶和果膠酶對(duì)胡蘿卜原料于40°C酶解28小時(shí)。酶解后的原料離心分離脫水，并以JY99-III型超聲波連續(xù)破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破壁lOmin，得到胡蘿卜原料固形物。利用丙酮和正己烷(I I. I)混合有機(jī)溶劑，對(duì)固形物原料于萃取罐中在68°C和260rpm攪拌轉(zhuǎn)速下，回流萃取18小時(shí),得到β -胡蘿卜素粗制品。所述有機(jī)溶劑為丙酮，正己烷，乙酸乙酯和甲醇中的任意一種或任兩種組合。通過(guò)對(duì)萃取后得到的β-胡蘿卜素粗制品有機(jī)溶液，進(jìn)行超臨界二氧化碳流體萃取，得到β-胡蘿卜素。
上?；ぱ芯吭旱臑踉聘咄薜热税l(fā)明了《一種天然β-胡蘿卜素的提取方法》(公開(kāi)號(hào)CN101070555 ;
公開(kāi)日2007. 11. 14)。該方法將發(fā)酵液過(guò)濾得到的三孢布拉霉菌濕菌CN 102914462 A書(shū)明說(shuō)4/10 頁(yè)體，利用物理和化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壁處理后，將吸附介質(zhì)如磁鐵礦等與破碎裂解液充分混合一段時(shí)間。利用過(guò)濾法，將吸附有β_胡蘿卜素的吸附介質(zhì)進(jìn)行分離并干燥。用環(huán)己烷溶劑提取吸附在吸附介質(zhì)表面上的脂溶性天然β-胡蘿卜素，提取過(guò)β-胡蘿卜素的吸附介質(zhì)可重復(fù)利用。工藝簡(jiǎn)單、成本較低。
喬維漢等人發(fā)明了《一種天然β-胡蘿卜素的提取方法》(公開(kāi)號(hào)CN101768099A ；
公開(kāi)日2010.07.07)。該方法系將胡蘿卜粉碎打漿，并在萃取罐中加入互不相溶的混合溶劑(甲醇和正己烷或乙腈和正庚烷)，于45°C 50°C、800W 900W超聲波輔助下攪拌萃取 30min,并靜止分層。以新鮮正己烷對(duì)下層的漿料多次重復(fù)萃取操作，并合并每次萃取產(chǎn)生的上層正己烷溶液。合并后的萃取液經(jīng)液液分配后脫溶得到β-胡蘿卜素油狀物，經(jīng)重結(jié)晶得到β_胡蘿卜素晶體。
劉沛則發(fā)明了一種《胡蘿卜素的提取工藝》(公開(kāi)號(hào)CN102060742A;
公開(kāi)日
2011. 05. 18)。該工藝主要利用其工藝步驟為取樣品香甘薯，放入組織搗碎機(jī)中打碎成糊狀物，并加入體積比為I : 9 I : I的丙酮-石油醚混合溶液，在超聲波清洗器中提取 5min 30min，離心分離出上清液，靜置分層，棄除下層液體，重復(fù)提取2 6次，并合并提取液。
另有文獻(xiàn)報(bào)道，生物樣品中的胡蘿卜素主要通過(guò)丙酮-甲醇，以及丙酮-石油醚等混合溶劑，經(jīng)多次浸取抽提之后得到；且浸取抽提過(guò)程，通常還需要輔以超聲或者人工研磨 [Takaichi, S. ,Characterization of carotenes in a combination of a Cl8HPLCc olumn with isocratic elution and absorption spectra with a photodiode—array detector. Photosynth Research,2000.65 93~99 ；Choudhari, S. and R. Singhal, Mediaoptimization for the production of beta—carotene by Blakeslea trispora A statisticalapproach. Bioresour Technol,2008. 99(4) :722_730]。
根據(jù)以上已經(jīng)公開(kāi)報(bào)道的專利和文獻(xiàn)信息分析可知，目前各種利用物理和化學(xué)法破碎組織細(xì)胞提取β-胡蘿卜素的專利技術(shù)，其發(fā)明的主要目標(biāo)主要面對(duì)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程。這些技術(shù)的主要特點(diǎn)為所需裝置較大且昂貴；處理物料多，但每次的損耗以及所需的樣品量較大；過(guò)程較為復(fù)雜(需要樣本的預(yù)處理，以及需要多次對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行反復(fù)提取處理)；所需溶劑量較大；提取過(guò)程常常需要加熱處理，運(yùn)行成本高；每次每套裝置僅能處理單獨(dú)的樣品。對(duì)于以獲得優(yōu)良工業(yè)生產(chǎn)菌株的菌種選育以及最優(yōu)過(guò)程工藝的發(fā)酵優(yōu)化過(guò)程而言，由于一次所需提取分析樣本極大(從數(shù)十至數(shù)百個(gè)樣品/次)，以往的文獻(xiàn)專利所公開(kāi)報(bào)道的技術(shù)存在耗時(shí)、耗力、耗能、勞動(dòng)強(qiáng)度大、處理通量低、樣品需求量大且提取過(guò)程有損耗等缺點(diǎn)，不適合大量樣品的同時(shí)處理以及樣品分析的需求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可一次性充分提取生物樣本中胡蘿卜素的高通量提取方法。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于，處理樣本通量大、過(guò)程簡(jiǎn)單、工作效率高、實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差小、所需樣品和溶劑少、勞動(dòng)強(qiáng)度低、且隔絕溶劑揮發(fā)。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管7架上，在一定的振蕩轉(zhuǎn)速或頻率下，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
所述的生物樣本包括三孢布拉霉菌、微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物組織或植物組織。
所述的微生物包括天然菌株，突變株或基因工程菌株。
所述的胡蘿卜素包括α -胡蘿卜素、β -胡蘿卜素、Y -胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素、 胡蘿卜素、胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、角黃素、辣椒紅素、葉黃素、辣椒黃素、鏈孢紅素、番爺紅素原(前番爺紅素)、八氫番爺紅素、六氫番爺紅素、花黃素(百合黃素)、玉米胡蘿卜素、蔥綠葉黃素、辣椒玉紅素、硅甲藻黃素、巖藻黃質(zhì)、多甲藻素、隱黃素、紫黃素(紫黃質(zhì))、大馬烯酮、3-氧代海葵醇、新黃素(新黃質(zhì))、硅藻黃素、藏紅花素、藏紅花苦素中的一種或幾種的混合。
所述的有機(jī)溶劑包括石油醚、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、二硫化碳、三油酸甘油酯、植物油、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、四氫呋喃、二甲亞砜、N，N- 二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋喃、糠醛、嗎啉、4-甲?；鶈徇?、4-乙酰基嗎啉、4-甲基嗎啉、4-苯基嗎啉、苯、甲苯、石油醚、戍燒、異戍燒、己燒、環(huán)己燒、庚燒、辛燒、壬燒、葵燒、甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、丙酮、乙腈在內(nèi)的一種或者幾種的混合。
根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平回旋振蕩、垂直回旋振蕩、垂直往復(fù)振蕩、水平往復(fù)振蕩以及傾斜往復(fù)振蕩方式的一種，其振蕩軌跡亦包括圓周回旋振蕩，線性往復(fù)振蕩或橢圓振蕩軌跡；機(jī)械振蕩器的振幅為O. Imm 400mm。
所述的振蕩破碎珠為空心珠或?qū)嵭闹?，其形狀包括球形、長(zhǎng)方形、立方形、橢圓形、 錐形或不規(guī)則形狀中的任意一種，粒徑大小為Imm 100mm,振蕩破碎珠的數(shù)量為I 1000 個(gè)；所述的振蕩破碎的安放傾斜角度為0° 180° ;所述的機(jī)械振蕩器的轉(zhuǎn)速為IOrpm 3000rpm,振蕩時(shí)間為Is 360min。
所述的振蕩破碎珠的材質(zhì)包括鋼、不銹鋼、鎢鋼、玻璃、瑪瑙、聚四氟乙烯、陶瓷、超高分子量聚乙烯、高分子量化合物或含有以上材質(zhì)的復(fù)合型材質(zhì)。
所述的振蕩破碎珠為直徑為5mm 8mm的實(shí)心圓球形振蕩破碎珠，數(shù)量為12 42粒；所述的振蕩破碎管通過(guò)振蕩破碎管固定架固定在機(jī)械振蕩器上，振蕩破碎架傾斜安放的水平夾角度為0° 60° ;所述的機(jī)械振蕩器的轉(zhuǎn)速為300rpm 500rpm,振蕩時(shí)間為 20min 40mino
所述的振蕩破碎管使用直徑或管口周長(zhǎng)范圍為Imm 500mm，容積范圍為Iml IOOOml的圓底、平底或圓錐形底的圓管狀、長(zhǎng)方體或立方體的容器。
機(jī)械振蕩器可以根據(jù)需要改變振蕩器類型、振蕩破碎管運(yùn)行軌跡、振蕩破碎時(shí)間、 破碎溫度、提取溶劑、振蕩轉(zhuǎn)速(或頻率)和振幅、振蕩破碎珠規(guī)格和數(shù)量以及樣品處理量。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速高通量的天然胡蘿卜素提取方法，以滿足大量樣品提取的需求，從而為高通量的菌株選育及生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供胡蘿卜素提取分析上的技術(shù)保障，并進(jìn)而提高通過(guò)菌株選育和工藝優(yōu)化獲取高產(chǎn)胡蘿卜素菌株及最優(yōu)工藝條件的工作效率以及成功幾率。由于該發(fā)明系利用密閉的小型破碎管，借助高頻振蕩產(chǎn)生的動(dòng)能，以及振蕩破碎珠的碰撞碾磨效應(yīng)以及溶劑萃取效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)樣品的破碎CN 102914462 A書(shū)明說(shuō)6/10 頁(yè)及樣品中β_胡蘿卜素的充分提取。鑒于以上原理，因此整個(gè)提取過(guò)程具有以下優(yōu)點(diǎn)
I.待提取樣品無(wú)需復(fù)雜的預(yù)處理過(guò)程，只需要將樣品進(jìn)行離心過(guò)濾，去除游離的水分即可。每次提取，只需要取得少量的組織或細(xì)胞樣品，加入破碎管中，并添加振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑即可置于振蕩器中的振蕩架上即可進(jìn)行振蕩破碎。
2.整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，不需要多級(jí)萃取過(guò)程。破碎后，直接將破碎管進(jìn)行離心，待管內(nèi)的細(xì)胞或組織碎片沉積至管底，即可取少量的澄清萃取液進(jìn)行β-胡蘿卜素的分析。
3.無(wú)溶劑揮發(fā)泄露。封閉的提取體系避免了有機(jī)溶劑揮發(fā)溢出對(duì)操作人員的毒害。
4.由于在密閉的體系進(jìn)行細(xì)胞的破碎和提取，因此無(wú)損耗，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的完全粉碎，并做到100%回收樣品中的β-胡蘿卜素。
5.每個(gè)樣品所需溶劑量極小。每個(gè)樣品所需的有機(jī)溶劑體積僅為5ml，從而避免了樣品提取分析過(guò)程中的大量試劑開(kāi)銷。
6.可常溫進(jìn)行操作，避免了加熱、回流以及儀器設(shè)備的冷卻，降低了提取過(guò)程中的能耗。
7. 一次可處理的樣品數(shù)量極大。根據(jù)振蕩架的設(shè)計(jì)容量，以及振蕩搖床的尺寸，可以實(shí)現(xiàn)一次同時(shí)破碎100·至1000個(gè)樣本。實(shí)現(xiàn)了大量樣品的快速同時(shí)提取處理，符合菌株選育過(guò)程中的高通量需求。
8.由于提取過(guò)程中無(wú)溶劑和樣品損耗，因此該方法所需的樣本量很少(視樣品中胡蘿卜素的含量，僅需要O. Olg 2g樣品)，滿足對(duì)待測(cè)樣品中β-胡蘿卜素分析的要求。


圖I為破碎時(shí)間與β -胡蘿卜素提取率的曲線圖2為振蕩破碎珠直徑大小對(duì)β -胡蘿卜素提取率的影響曲線圖3為振蕩破碎管振蕩角度對(duì)β -胡蘿卜素提取率的影響曲線圖4為振蕩器振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)β -胡蘿卜素提取率的影響曲線圖5為振蕩破碎珠使用數(shù)量對(duì)β -胡蘿卜素提取率的影響曲線圖6為國(guó)標(biāo)提取法與本發(fā)明提取方法的分析結(jié)果比較圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以下實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
首先，以75目濾網(wǎng)將發(fā)酵液中的三孢布拉霉菌菌體進(jìn)行真空抽濾收集，所收獲的濾餅，以等發(fā)酵液體積的自來(lái)水漂浮清洗。隨后，收集漂浮的菌體細(xì)胞并重新以75目濾網(wǎng)將菌體進(jìn)行真空抽濾收集。自來(lái)水漂洗三孢布拉霉菌發(fā)酵菌體兩次，以充分去除發(fā)酵液中少量的小顆粒泥沙以及不可溶性微粒。最后，以相同體積的去離子水漂洗三孢布拉霉菌發(fā)酵菌體,并以4_孔徑的濾網(wǎng)去除菌體懸浮液中夾雜的較大的菌絲體,重復(fù)過(guò)濾兩次,并以 75目濾網(wǎng)將菌體進(jìn)行真空抽濾收集。
將所收集的菌體濾餅，以藥匙分散均勻，并稱重約O. 20±0. Olg分裝于IOml破碎管中封蓋，-20°C避光保存。分裝菌體作為本發(fā)明實(shí)施例所用的樣品。9
實(shí)施例I
每組條件設(shè)三組平行樣，破碎振蕩破碎珠直徑為6mm，破碎振蕩破碎珠使用數(shù)量為 15個(gè)，破碎轉(zhuǎn)速為400rpm，破碎管安放傾角為0°，分析樣品的稱重為約O. 2g。破碎時(shí)間按圖I中所述條件范圍進(jìn)行實(shí)施
根據(jù)實(shí)施結(jié)果分析可知，當(dāng)破碎時(shí)間達(dá)到30min時(shí)，三組平行樣的破碎提取率皆達(dá)到100%，且隨著破碎時(shí)間的延長(zhǎng)，三孢布拉霉菌中β-胡蘿卜素提取率在100 %的水平上保持不變。由此可見(jiàn)，通過(guò)選擇合適的破碎時(shí)間，本發(fā)明可以有效的實(shí)施于三孢布拉霉菌β-胡蘿卜素的提?。黄渲?，綜合考慮縮短提取時(shí)間以及β-胡蘿卜素提取效果穩(wěn)定性， 30min提取時(shí)間最佳。
實(shí)施例2
為了保證本發(fā)明可以有效的實(shí)施于三孢布拉霉菌中β-胡蘿卜素的提取。本實(shí)施例對(duì)破碎珠的大小規(guī)格進(jìn)行了考察。在破碎振蕩破碎珠使用數(shù)量為15個(gè)，破碎轉(zhuǎn)速為 400rpm,破碎時(shí)間30min,破碎管安放傾角為0° ,分析樣品的稱重為約O. 2g的實(shí)施條件下, 本實(shí)施例考察4mm, 5mm和6mm三種大小不同破碎珠對(duì)發(fā)明實(shí)施的影響。
根據(jù)發(fā)明實(shí)施結(jié)果可知，在破碎珠尺寸考察范圍內(nèi)，皆可以充分的提取三孢布拉霉菌中的β-胡蘿卜素。在三組實(shí)施實(shí)驗(yàn)中，以6mm鋼珠的破碎效果最佳，且工作效率最高。
實(shí)施例3
通過(guò)改變破碎管固定架角度，考察本發(fā)明對(duì)三孢布拉霉菌細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素提取的實(shí)施。將裝有15粒直徑6mm的振蕩破碎珠，約O. 2g的三孢布拉霉菌細(xì)胞，以及5ml提取溶劑的振蕩破碎管鎖定于不同安放角度的固定架中，于破碎轉(zhuǎn)速為400rpm的振蕩器上破碎時(shí)間30min，以此考察本發(fā)明的實(shí)施，結(jié)果如圖3所示。
據(jù)本實(shí)施例的結(jié)果分析可知，當(dāng)振蕩破碎管安置角度為90° (垂直于回旋振蕩平面)時(shí)，細(xì)胞破碎效果(或β_胡蘿卜素提取效率)最差；隨著傾角的不斷增大，在其他條件保持不變的條件下，破碎效果逐漸改善。當(dāng)振蕩破碎管的振蕩傾角為水平時(shí)，三孢布拉霉菌細(xì)胞的破碎效果以及胞內(nèi)β_胡蘿卜素的提取效果達(dá)到最佳。
實(shí)施例4
為了考察振蕩器振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)本發(fā)明實(shí)施的影響，本實(shí)施例將裝有15粒直徑6mm的振蕩破碎珠，約O. 2g的三孢布拉霉菌細(xì)胞，以及5ml提取溶劑的振蕩破碎管鎖定于O °安放角度的固定架中，于250rpm 500rpm振蕩轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)破碎時(shí)間30min。結(jié)果如下
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施結(jié)果分析可知，在所考察的振蕩器振蕩轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，皆可以提取三孢布拉霉菌菌體中的β-胡蘿卜素；其中，以400rpm 500rpm轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)可以達(dá)到有效的實(shí)施；另外，又以振蕩器最大振蕩轉(zhuǎn)速(500rpm)的破碎效果最佳。綜合考慮本發(fā)明實(shí)施效率以及設(shè)備的使用負(fù)荷，其中又以400rpm振蕩轉(zhuǎn)速最為適宜。雖然在所考察的條件范圍內(nèi)，較低的振蕩轉(zhuǎn)速其提取效果較差，未能達(dá)到100 %提取率，但通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)振蕩破碎時(shí)間以及改變振蕩珠的大小、數(shù)量和材質(zhì)，理應(yīng)可以使本發(fā)明進(jìn)行有效的實(shí)施。
實(shí)施例5
為了考察振蕩破碎珠使用數(shù)量對(duì)本發(fā)明實(shí)施效果的影響，本實(shí)施例將裝有直徑為 6mm的振蕩破碎珠，約O. 2g的三孢布拉霉菌細(xì)胞，以及5ml提取溶劑的振蕩破碎管鎖定于 O °的振蕩固定架中，于破碎轉(zhuǎn)速為400rpm的振蕩器上破碎時(shí)間30min，以此考察3 42粒破碎珠使用范圍內(nèi)，本發(fā)明的實(shí)施效果。結(jié)果如圖5所示
根據(jù)圖表中的數(shù)據(jù)可知，在本實(shí)施例其他參數(shù)固定的情況下，隨著振蕩破碎珠使用數(shù)量的增加，本專利實(shí)施的效果得到顯著改善。具體表現(xiàn)為，完全提取三孢布拉霉菌細(xì)胞內(nèi)β_胡蘿卜素所需的時(shí)間會(huì)隨之大大減少。雖然較少的振蕩破碎珠使用數(shù)量，在當(dāng)前實(shí)施條件下，未能完全提取三孢布拉霉菌細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素，但通過(guò)適當(dāng)改變振蕩破碎珠的材質(zhì)、規(guī)格和尺寸，振蕩器的運(yùn)行轉(zhuǎn)速以及振蕩破碎時(shí)間，將可以使本發(fā)明得到有效的實(shí)施。
實(shí)施例6
在本實(shí)施例中，為了最終證明本發(fā)明實(shí)施的有效性，以本發(fā)明所用的方法與國(guó)標(biāo) 《GB8821-1988食品添加劑β -胡蘿卜素》中的方法，對(duì)同一批27個(gè)不同實(shí)驗(yàn)條件下所獲取的三孢布拉霉菌菌體中的β-胡蘿卜素含量進(jìn)行提取并分析。結(jié)果如圖6所示。
在本實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)施條件為振蕩破碎珠直徑為6mm，使用數(shù)量為12個(gè)， 破碎轉(zhuǎn)速為400rpm,破碎時(shí)間為30min,破碎管安放傾角為0°。結(jié)果顯示以兩種不同的方法對(duì)同一批樣品進(jìn)行提取分析，所測(cè)得β_胡蘿卜素的含量基本相符。從數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為， 回歸曲線為線性，且其斜率和回歸系數(shù)接近于I。由此可以證實(shí)，通過(guò)本實(shí)施例，有效的實(shí)現(xiàn)了三孢布拉霉菌菌體細(xì)胞中β_胡蘿卜素的準(zhǔn)確充分提取，并兼顧了本發(fā)明預(yù)期的各種優(yōu)
實(shí)施例I
一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本天然菌株或植物組織、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑石油醚裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在轉(zhuǎn)速為300rpm下，振蕩時(shí)間為360min，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
所述的胡蘿卜素包括β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素以及玉米黃質(zhì)或以上化合物的衍生化合物。
所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平圓周回旋振蕩；機(jī)械振蕩器的振幅為 IOmm0所述的振蕩破碎珠為空心鋼珠，其形狀為長(zhǎng)方體形，粒徑為1mm，振蕩破碎珠的數(shù)量為 42個(gè)；所述的振蕩破碎的安放傾斜角度為30°。
實(shí)施例8
一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本動(dòng)物細(xì)胞、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑氯仿裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在轉(zhuǎn)速為500rpm下，振蕩時(shí)間為120min， 利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
所述的胡蘿卜素包括β -胡蘿卜素、蝦青素以及番茄紅素或以上化合物的衍生化合物。
所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平圓周回旋振蕩；機(jī)械振蕩器的振幅為 10mm。所述的振蕩破碎珠為直徑為5mm 8mm實(shí)心鎢鋼珠，振蕩破碎珠的數(shù)量為12個(gè)；所述的振蕩破碎的安放傾斜角度為60°。振蕩破碎管使用管口周長(zhǎng)為16mm，容積為IOml圓錐形底的圓管容器。
實(shí)施例9
一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本動(dòng)物細(xì)胞、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑石油醚和丙酮混合溶液或二甲亞砜裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在轉(zhuǎn)速為 IOrpm下，振蕩時(shí)間為360min，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
所述的胡蘿卜素包括α -胡蘿卜素、β -胡蘿卜素、Y -胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素、 ε-胡蘿卜素和ζ-胡蘿卜素或以上化合物的衍生化合物。
所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平線性往復(fù)振蕩；機(jī)械振蕩器的振幅為 400mm。所述的振蕩破碎珠為超高分子量聚乙烯包裹鋼珠，其形狀為立方體形，長(zhǎng)度為 100mm，振蕩破碎珠數(shù)量為I個(gè)；所述振蕩破碎管安放傾斜角度為60°。振蕩破碎管使用管口周長(zhǎng)為500mm，容積為IOOOml的平底長(zhǎng)方體振蕩破碎管。
實(shí)施例10
一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本動(dòng)物細(xì)胞、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑二硫化碳裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm下，振蕩時(shí)間為 360min，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
所述的胡蘿卜素包括α -胡蘿卜素、β -胡蘿卜素、Y -胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素、 胡蘿卜素、胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、角黃素、辣椒紅素、葉黃素、辣椒黃素、鏈孢紅素、番爺紅素原(前番爺紅素)、八氫番爺紅素、六氫番爺紅素、花黃素(百合黃素)、玉米胡蘿卜素、蔥綠葉黃素、辣椒玉紅素、硅甲藻黃素、巖藻黃質(zhì)、多甲藻素、隱黃素、紫黃素(紫黃質(zhì))、大馬烯酮、3-氧代?？?、新黃素(新黃質(zhì))、硅藻黃素、藏紅花素、藏紅花苦素的一種或幾種的混合。
所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平回旋振蕩；機(jī)械振蕩器的振幅為O. Imm0 所述的振蕩破碎珠為實(shí)心瑪瑙材質(zhì)，其形狀為圓形，粒徑為1mm，振蕩破碎珠的數(shù)量為1000 個(gè)；所述的振蕩破碎的安放傾斜角度為60° ;振蕩破碎管使用直徑為10mm，容積為IOml的圓底圓管狀振蕩破碎管。
實(shí)施例11
一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本動(dòng)物細(xì)胞、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑石油醚和丙酮混合溶液裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm下， 振蕩時(shí)間為ls，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
所述的胡蘿卜素包括α -胡蘿卜素、β -胡蘿卜素、Y -胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素、 胡蘿卜素、胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、角黃素、辣椒紅素、葉黃素、辣椒黃素、鏈孢紅素、番爺紅素原(前番爺紅素)、八氫番爺紅素、六氫番爺紅素、花黃素(百合黃素)、玉米胡蘿卜素、蔥綠葉黃素、辣椒玉紅素、硅甲藻黃素、巖藻黃質(zhì)、多甲藻素、隱黃素、紫黃素(紫黃質(zhì))、大馬烯酮、3-氧代?？肌⑿曼S素(新黃質(zhì))、硅藻黃素、藏紅花素、藏紅花苦素的一種或幾種的混合。
所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平回旋振蕩；機(jī)械振蕩器的振幅為5_。所述的振蕩破碎珠為實(shí)心陶瓷材質(zhì)，其形狀為圓形，粒徑為6mm，振蕩破碎珠的數(shù)量為100個(gè)； 所述的振蕩破碎的安放傾斜角度為60° ;振蕩破碎管使用直徑為20mm，容積為IOOml的圓底圓管狀振蕩破碎管。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在一定的振蕩轉(zhuǎn)速或頻率下，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的生物樣本包括三孢布拉霉菌、微生物、藻類、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物組織或植物組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的微生物包括天然菌株，突變株或基因工程菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的胡蘿卜素包括α -胡蘿卜素、β -胡蘿卜素、Y -胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素、ε -胡蘿卜素、胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、角黃素、辣椒紅素、葉黃素、辣椒黃素、鏈孢紅素、番茄紅素原、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、花黃素、玉米胡蘿卜素、蔥綠葉黃素、辣椒玉紅素、硅甲藻黃素、巖藻黃質(zhì)、多甲藻素、隱黃素、紫黃素、大馬烯酮、3-氧代?？?、新黃素、硅藻黃素、藏紅花素、藏紅花苦素中的一種或幾種的混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑包括石油醚、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、二硫化碳、三油酸甘油酯、植物油、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、四氫呋喃、二甲亞砜、N，N- 二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋喃、糠醛、嗎啉、4-甲?；鶈徇?、4-乙?；鶈徇?、4-甲基嗎啉、4-苯基嗎啉、苯、甲苯、石油醚、戊烷、異戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷、壬烷、葵烷、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈在內(nèi)的一種或者幾種的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的機(jī)械振蕩器的振蕩方式包括水平回旋振蕩、垂直回旋振蕩、垂直往復(fù)振蕩、水平往復(fù)振蕩以及傾斜往復(fù)振蕩方式的一種，其振蕩軌跡亦包括圓周回旋振蕩，線性往復(fù)振蕩或橢圓回旋振蕩軌跡；機(jī)械振蕩器的振幅為O. Imm 400mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或6所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的振蕩破碎珠為空心珠或?qū)嵭闹椋湫螤畎ㄇ蛐?、長(zhǎng)方形、立方形、橢圓形、錐形或不規(guī)則形狀中的任意一種，粒徑大小為Imm 100mm,振蕩破碎珠的數(shù)量為I 1000個(gè)；所述的振蕩破碎的安放傾斜角度為0° 180° ;所述的機(jī)械振蕩器的轉(zhuǎn)速為IOrpm 3000rpm,振蕩時(shí)間為Is 360min。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的振蕩破碎珠的材質(zhì)包括鋼、不銹鋼、鎢鋼、玻璃、瑪瑙、聚四氟乙烯、陶瓷、超高分子量聚乙烯、高分子量化合物或含有以上材質(zhì)的復(fù)合型材質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或6所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的振蕩破碎珠為直徑為5mm 8mm的實(shí)心圓球形振蕩破碎珠，數(shù)量為12 42粒；所述的振蕩破碎管通過(guò)振蕩破碎管固定架固定在機(jī)械振蕩器上，振蕩破碎架傾斜安放的水平夾角度為0° 60° ;所述的機(jī)械振蕩器的轉(zhuǎn)速為300rpm 500rpm,振蕩時(shí)間為20min 40mino
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，所述的振蕩破碎管使用直徑或管口周長(zhǎng)范圍為Imm 500mm，容積范圍為Iml IOOOml的圓底、平底或圓錐形底的圓管狀，長(zhǎng)方體或立方體的容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機(jī)械振蕩器，提供振蕩破碎動(dòng)力，將生物樣本、振蕩破碎珠和有機(jī)溶劑裝至振蕩破碎管內(nèi)，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在一定的振蕩轉(zhuǎn)速或頻率下，利用管內(nèi)振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機(jī)溶劑的滲透溶解，實(shí)現(xiàn)生物樣本組織或細(xì)胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明兼具處理樣本通量大、過(guò)程簡(jiǎn)單、工作效率高、實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差小，所需樣品和溶劑少、勞動(dòng)強(qiáng)度低、且隔絕溶劑揮發(fā)等優(yōu)點(diǎn)。在工業(yè)微生物、動(dòng)物和植物優(yōu)良品種選育及工藝優(yōu)化過(guò)程中，應(yīng)用本發(fā)明可以有效的提高樣品的處理通量和胡蘿卜素提取效率。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102914462SQ20121047934
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者董宏偉, 徐大剛, 吳向陽(yáng), 蔡楊, 陳慧芳, 楊曄, 吳欣森, 李泓全, 童海寶 申請(qǐng)人:上海化工研究院