專利名稱：心肌梗死預(yù)警膠體金試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)預(yù)診斷試劑，特別是一種心肌梗死預(yù)警膠體金試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
心肌梗死(Myocardial infarction, MI 或 acute myocardial infarction, AMI),常常發(fā)生在心冠狀動(dòng)脈突然阻塞，造成部分心臟液供應(yīng)突然中斷，產(chǎn)生缺血和氧氣短缺，如不及時(shí)治療就會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。心肌梗死是心血管疾病(又可總稱為冠心病)的終極轉(zhuǎn)歸，具有突發(fā)、無特異性前兆癥狀的特點(diǎn)，導(dǎo)致救治不及造成高死亡率。最近的流行病學(xué)資料顯示，全球每年因冠心病死亡約1700萬人，其中一半以上死于心肌梗死。我國平均每天就有2778人死于心肌梗死，堪稱“第一殺手”。心肌梗死雖然在一瞬間突發(fā)，但起因卻是緣于一系列的病理生理過程。首先是出現(xiàn)心臟冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，血小板聚集和血栓形成，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔漸變狹窄、此時(shí)心肌已經(jīng)出現(xiàn)逐漸加重的缺血和再灌注的損傷。最后極度加厚的內(nèi)膜十分粗糙的動(dòng)脈會(huì)突然閉塞或者動(dòng)脈粥樣硬化斑潰破脫落，導(dǎo)致心肌細(xì)胞驟然毫無血液和氧氣的供應(yīng)而死亡。從臨床角度看，它涵蓋了一組連續(xù)進(jìn)展的病癥，包括不穩(wěn)定心絞痛、非ST段抬高的心肌梗死(NSTEMI)和ST段抬高的心肌梗死(STEMI)。心肌梗死的及時(shí)診斷通常是很困難的，特別是梗死前的心肌缺血階段更是不易。心電圖常首先用來評估因胸部不適就診的病人，但心肌缺血的病人也可多表現(xiàn)為心電圖未見異常，其靈敏度低于50%，致使延誤治療發(fā)展至心肌梗死。目前臨床上常用的血清學(xué)檢查項(xiàng)目，如肌鈣蛋白(tix)pninS:TnI，TnT)、肌紅蛋白(myoglobin,Myo)、酸激酶 MB 同功酶(creatine kinase-MB, CK-MB)和 B-型鈉尿妝(B-typenatriuretic peptide, BNP)等,僅在不可逆的細(xì)胞損害以及細(xì)胞膜的完整性被破壞之后，在血中才會(huì)升高。短期和可逆的缺血發(fā)作,不會(huì)導(dǎo)致這些標(biāo)志物血中水平升高,因此都是心肌已經(jīng)發(fā)生壞死的標(biāo)志物，不能用作預(yù)警指標(biāo)。只有在心肌發(fā)生缺血時(shí)就能高度表達(dá)的標(biāo)志物才能作為即將發(fā)生心肌梗死的預(yù)警信號(hào)，指導(dǎo)患者及時(shí)得到救助，避免心肌梗死的發(fā)生。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)是磷酸脂酶A2超家族中的非鈣離子依賴型磷酸脂酶，最初發(fā)現(xiàn)其可以降解血小板活化因子，曾被稱為血小板活化因子乙酰水解酶。1995年首次被克隆，其編碼基因(PLA2G7)，有12個(gè)外顯子，染色體定位于6p21. 2212，由441個(gè)氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對分子質(zhì)量為50X 103(50kDa)。Lp-PLA2以生物膜磷脂為天然底物優(yōu)先作用于氧化磷脂sn22位上短脂酰鏈中的酯鍵，使水溶性強(qiáng)的磷脂產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂參與磷脂的代謝。Lp-PLA2經(jīng)成熟的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成和分泌，并受炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，主要與低密度脂蛋白LDL結(jié)合，能水解血小板活化因子使之失去活性，又能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物質(zhì)溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，因此具有促炎癥和促動(dòng)脈粥樣硬化的作用。眾多研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥發(fā)展到嚴(yán)重程度，并將要或者已經(jīng)出現(xiàn)向血管內(nèi)腔破裂時(shí)，Lp-PLAJf會(huì)被大量釋放入血液，致使其血液內(nèi)的水平會(huì)大幅提高，因此Lp-PLA2的血液濃度與粥樣斑塊的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，而獨(dú)立于疾病相關(guān)的任何其他危險(xiǎn)因子，因而成為不可被取代的，直接監(jiān)測疾病的演變過程和危險(xiǎn)性的最佳的動(dòng)態(tài)檢測指標(biāo)，尤其對于心肌梗塞的發(fā)生，具有相當(dāng)關(guān)鍵意義的預(yù)警提示作用。與傳統(tǒng)的心肌梗塞標(biāo)記物如肌鈣蛋白，CRP相比，Lp-PLA2能夠更加靈敏的反應(yīng)病人的狀況，而且Lp-PLA2的水平與年齡，病人的身體狀況，是否吸煙，高血壓，收縮壓，舒張壓以及甘油三磷酸無關(guān)，能夠更加特異性地反應(yīng)病人的狀況。美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)Lp-PLA2測定作為預(yù)警心肌梗塞的標(biāo)志物，用于臨床診斷。其后大量的臨床實(shí)踐證明Lp-PLA2對心肌梗塞預(yù)警有極高的靈敏度和特異性。綜上所述，心肌梗死是一個(gè)炎性反應(yīng)的過程，Lp-PLA2是血管內(nèi)炎性標(biāo)志物，是預(yù)警心肌梗塞最理想、最可靠的早期標(biāo)志物。將上述血管內(nèi)炎性標(biāo)志物L(fēng)p-PLA2制作成適于臨床使用的心肌梗死近期預(yù)警試劑盒是心血管病患者的福音。以酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的檢測試紙，測試卡或類似的檢測反應(yīng)裝置技術(shù)非常成熟，其主要依賴抗體抗原特異性結(jié)合反應(yīng)原理、層析技術(shù)來捕獲并分離目標(biāo)物質(zhì)。并通過化學(xué)發(fā)光或膠體金顯色等技術(shù)來觀察結(jié)果。膠體金顯色具有簡便易于操作等優(yōu)點(diǎn)，但是，膠體金顯色需要將膠體金標(biāo)記蛋白來包被在檢測反應(yīng)載體上，每種包被的蛋白都有其自身特性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這一工藝流程是檢測反應(yīng)試紙等裝置是否能靈敏特異地完成檢測的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于上述領(lǐng)域的空白及存在的缺陷，通過制備方法的改進(jìn)提供了兩種快速檢測全血中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)的膠體金檢測試劑盒。一種用于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液，其特征在于，在膠體金標(biāo)記蛋白溶液中還加入有O. 24mg/ml的PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖，O. 5%(w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二燒基磺酸鈉SDS。所述膠體金標(biāo)記蛋白溶液指膠體金標(biāo)記脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單抗所得的溶液。一種心肌梗死預(yù)警試劑盒的制備方法，包括制備膠體金標(biāo)記脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單抗的膠體金標(biāo)記蛋白溶液以及檢測反應(yīng)載體，其特征在于在膠體金標(biāo)記蛋白溶液中還加入有 O. 24mg/ml 的 PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖，O. 5% (w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二燒基磺酸鈉SDS。所述檢測反應(yīng)載體為鋪有膜材料的試紙條，所述試紙條從點(diǎn)樣端開始依次為膠體金結(jié)合區(qū)域、測試區(qū)域、手持端，所述膠體金結(jié)合區(qū)域的膜材料為玻璃纖維紙，測試區(qū)域的膜材料為硝酸纖維膜，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有質(zhì)控線和測試線，測試線上包被有Img/ml的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體，質(zhì)控線包被有l(wèi)mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，其特征在于所述玻璃纖維紙上包被有所述膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液，所述測試區(qū)域采用孔徑為5um的硝酸纖維素膜。所述檢測反應(yīng)載體為滲濾盒，所述滲濾盒內(nèi)部為吸水墊料，滲濾盒上表面設(shè)置有一個(gè)開闊的通孔為檢測反應(yīng)區(qū)，所述通孔下墊有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜下表面與所述吸水墊料緊貼著，上表面使所述通孔封閉，所述通孔中心位置對應(yīng)的硝酸纖維素膜上設(shè)置有呈十字交叉狀的質(zhì)控線和檢測線，測試線上包被有l(wèi)mg/ml的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體，質(zhì)控線包被有l(wèi)mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，所述硝酸纖維素膜的孔徑為 5 um ο所述制備方法，還包括配制全血處理液，所述全血處理液為含有3mg/mlEDTA_ZK，
O.5% (w/w) TritonX-100,0. 6% (w/w)脫氧膽酸鈉，0· 05% (w/w) ProClin300 的 pH 值 7· 4的PBS溶液。上述任一制備方法得到的心肌梗死預(yù)警試劑盒。本發(fā)明利用血管內(nèi)炎性標(biāo)志物脂蛋白相關(guān)磷脂酶Α2，制作出了成適于臨床使用的檢測患者脂蛋白相關(guān)磷脂酶Α2水平以預(yù)警心肌梗死的試劑盒。本發(fā)明的貢獻(xiàn)在于試劑盒制備方法上的改進(jìn)，這些改進(jìn)使制備得到的試劑盒的靈敏性，穩(wěn)定性，特異性都得以提高。本發(fā)明的第 一個(gè)改進(jìn)在于提供了專門適合于脂蛋白相關(guān)磷脂酶Α2與膠體金偶聯(lián)的穩(wěn)定液配方，使兩者結(jié)合更快，更緊密穩(wěn)定共價(jià)鍵。本發(fā)明的制備方法的第二個(gè)改進(jìn)在于，制備的檢測反應(yīng)載體如試紙條上采用孔徑為5um的硝酸纖維素膜，可以有效的減少雜波。本發(fā)明的制備方法的第三個(gè)貢獻(xiàn)在于，還提供了制備全血處理液的配方。該全血處理液對待測學(xué)清進(jìn)行預(yù)處理，可使檢測更靈敏，結(jié)果更準(zhǔn)確。


圖1.試紙條檢測結(jié)果示意圖。圖2.滲濾盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖3.試紙條對比試驗(yàn)結(jié)果，其中左I為測試試紙條，右I的對照組。圖4.試紙條對比試驗(yàn)結(jié)果，其中左I邊為測試試紙條，右2 4試紙條為對照。圖5.滲濾盒對比試驗(yàn)結(jié)果，上I為本發(fā)明的測試滲濾盒，下4為對照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、免疫膠體金層析法檢測Lp-PLA2本發(fā)明應(yīng)用雙抗體夾心法檢測人血清或血漿中的Lp-PLA2，采用基因工程表達(dá)并純化的Lp-PLA2蛋白制作的單抗包被硝酸纖維素膜，用膠體金標(biāo)記另一株單抗或多抗均勻涂布于玻璃纖維紙上，運(yùn)用紙層析技術(shù)及免疫金的顯色反應(yīng)達(dá)到檢測Lp-PLA2的目的。特點(diǎn)整個(gè)操作時(shí)間約20分鐘，既可以由專業(yè)的醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)人員操作使用，也可以由檢測人獨(dú)立使用。本發(fā)明的試劑盒組成=Lp-PLA2測試卡，說明書I份，樣品稀釋液一瓶步驟1.各種試劑的配制1.樣品稀釋液用SOOmL蒸餾水溶解O. 2g氯化鉀(KCl)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)，1. 44g十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO415 12H20)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)和
O.24 二水合磷酸二氫鉀(KH2PO4。2H20)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)，用鹽酸(HCl)(北京化學(xué)試劑公司，500ml/瓶)調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L，搖勻。2.磷酸鹽緩沖液(PBS):用800mL蒸餾水溶解8g氯化鈉(NaCl)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)，0· 2g氯化鉀(KCl)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)，1. 44g十二水合磷酸氫二鈉(Na2HP04。12H20)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)和O. 24g 二水合磷酸二氫鉀(KH2PO4. 2H20)(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)，用鹽酸(HCl)(北京化學(xué)試劑公司，500ml/瓶)調(diào)節(jié)溶液的PH值至7. 4，加水至1L，搖勻。3.硝酸纖維素膜Whatman ImmunoporeFP, 2. 5cm*50m 帶背襯，孔徑 5um。4.質(zhì)控線條包被用抗體(簡稱C抗體)羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)抗體，購自Abnova。用PBS稀釋，搖勻，使溶液中多克隆抗體重量百分比濃度為lmg/mL。5.全血處理劑3mg/mlEDTA — ZK (Sigma500g/ 瓶)，0· 5%TritonX_100 (北京化學(xué)試劑公司，500ml/瓶)，O. 6%脫氧膽酸鈉(北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)，O. 05%ProClin300(Sigma500g/瓶)加入pH值7. 4的PBS溶液。6.檢測線條包被用抗體(簡稱T抗體)鼠抗人單克隆抗體，購自Abnova。用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋Lp-PLA2單克隆抗體，搖勻，優(yōu)選濃度為lmg/ml，制得T抗體溶液。步驟2.制備Lp-PLA2金標(biāo)單克隆抗體反應(yīng)溶液1.制備膠體金溶液濃度為萬分之一，直徑10nm，購自北京華美公司。用重量百分比濃度為1%的碳酸鉀(K2CO3)(北京化學(xué)試劑公司，500ml/瓶)，水溶液調(diào)節(jié)pH至8. 9。2.鼠抗人Lp-PLA2單克隆抗體，購自Abnova。用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋Lp-PLA2單克隆抗體，搖勻，優(yōu)選重量百分比濃度為O. l-0.2mg/mL。鼠抗人Lp-PLA2單克隆抗體只與血液中相應(yīng)的Lp-PLA2抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，從而決定了本檢測技術(shù)的特異性。3.標(biāo)記蛋白最適膠體金溶液穩(wěn)定量的測定未加入蛋白或加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金溶液的試管，即 呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的試管則膠體金溶液的紅色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定Iml膠體金溶液的必須蛋白量，在此基礎(chǔ)上加上20%的量，即為穩(wěn)定Iml膠體金溶液所需蛋白的實(shí)際用量。實(shí)驗(yàn)如表I所示。管1、2、3、4中 ，有明顯藍(lán)色聚沉現(xiàn)象，管5略有淡紅色沉淀，管6、7、8穩(wěn)定，無聚沉現(xiàn)象，由此確定，25mg/L為穩(wěn)定膠體金溶液的蛋白最小用量，在此基礎(chǔ)上加20%，即30mg/L為穩(wěn)定膠體金溶液的抗人Lp-PLA2單克隆抗體的實(shí)際用量。表I標(biāo)記蛋白最適膠體金溶液穩(wěn)定量實(shí)驗(yàn)表
權(quán)利要求
1.一種用于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液，其特征在于，在膠體金標(biāo)記蛋白溶液中還加入有O. 24mg/ml的PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖,0. 5% (w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二燒基磺酸鈉SDS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液，所述膠體金標(biāo)記蛋白溶液指膠體金標(biāo)記脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單抗的溶液。
3.—種心肌梗死預(yù)警試劑盒的制備方法，包括制備膠體金標(biāo)記脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單抗的膠體金標(biāo)記蛋白溶液以及檢測反應(yīng)載體，其特征在于所述膠體金標(biāo)記蛋白溶液中加有 O. 24mg/ml 的 PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖，O. 5% (w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二燒基磺酸鈉SDS。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述檢測反應(yīng)載體為鋪有膜材料的試紙條，所述試紙條從點(diǎn)樣端開始依次為膠體金結(jié)合區(qū)域、測試區(qū)域、手持端，所述膠體金結(jié)合區(qū)域的膜材料為玻璃纖維紙，測試區(qū)域的膜材料為硝酸纖維膜，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有質(zhì)控線和測試線，測試線上包被有l(wèi)mg/ml的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體，質(zhì)控線包被有Img/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，其特征在于所述玻璃纖維紙上包被有權(quán)利要求2所述的膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液，所述測試區(qū)域采用孔徑為5um的硝酸纖維素膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述檢測反應(yīng)載體為滲濾盒，所述滲濾盒內(nèi)部為吸水墊料，滲濾盒上表面設(shè)置有一個(gè)開闊的通孔為檢測反應(yīng)區(qū)，所述通孔下墊有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜下表面與所述吸水墊料緊貼著，上表面使所述通孔封閉，所述通孔中心位置對應(yīng)的硝酸纖維素膜上設(shè)置有呈十字交叉狀的質(zhì)控線和檢測線，測試線上包被有l(wèi)mg/ml的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體,質(zhì)控線包被有l(wèi)mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，所述硝酸纖維素膜的孔徑為5um。
6.根據(jù)權(quán)利要求3 5任一所述的制備方法，還包括配制全血處理液，所述全血處理液為含有 3mg/mlEDTA-ZK，0. 5% (w/w) TritonX-100,0. 6% (w/w)脫氧膽酸鈉，O. 05% (w/w)ProCl in300 的 pH 值 7· 4 的 PBS 溶液。
7.權(quán)利要求3 6任一制備方法得到的心肌梗死預(yù)警試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明“心肌梗死預(yù)警膠體金試劑盒及其制備方法”，涉及醫(yī)學(xué)檢測裝置。一種心肌梗死預(yù)警試劑盒及其制備方法，包括制備膠體金標(biāo)記脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單抗的膠體金標(biāo)記蛋白溶液以及檢測反應(yīng)載體，其特征在于所述膠體金標(biāo)記蛋白溶液中加有0.24mg/ml的PEG20000，1.5%(w/w)BSA，3%(w/w)的蔗糖，0.5%(w/w)的海藻糖，1%(w/w)的酪蛋白和2%(w/w)的十二烷基磺酸鈉SDS。本發(fā)明通過制備方法的改進(jìn)提供了兩種快速檢測全血中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)的膠體金檢測試劑盒，還提供了使該試劑盒性能優(yōu)化的膠體金標(biāo)記蛋白溶液。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103048457SQ20121049159
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者吳凡, 焦守恕, 滿慧娟 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司