專利名稱：一種測量糖化血紅蛋白的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液檢測領(lǐng)域，更具體地講，涉及離體血液中糖化血紅蛋白的檢測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
目前臨床上常用的糖化血紅蛋白檢測方法有高效液相色譜、免疫法、酶法、離子交換層析、化學發(fā)光法等。高效液相色譜、離子交換層析需要使用大型儀器，且儀器價格昂貴；免疫法需要使用大量抗體，且需要使用大型儀器才能進行檢測，如生化分析儀等；酶法需要使用多種酶配合進行反應才能得到最終結(jié)果，最終結(jié)果也需要大型儀器檢測。以上各種方法均需要分別檢測總血紅蛋白和糖化血紅蛋白兩個指標后，通過計算糖化血紅蛋白占總血紅蛋白的百分比才能得到最終結(jié)果，兩次檢測帶來的直接后果就是檢測結(jié)果準確性不高，且現(xiàn)有技術(shù)操作復雜，必須有專業(yè)人士操作才能進行。另外，現(xiàn)有技術(shù)使用的儀器價格昂貴且體積龐大。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統(tǒng)ELISA方法，抗原、抗體的結(jié)合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法，抗原、抗體的結(jié)合反應也是在近似液相的條件下進行，因而反應快速、徹底，與傳統(tǒng)ELISA相比具有靈敏度高、檢測用時少的優(yōu)點。中國專利申請?zhí)腔t蛋白定量測定試劑盒及其檢測方法(申請?zhí)?01110257757. 5)即是利用了傳統(tǒng)的磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，磁性粒子標記抗糖化血紅蛋白抗體，測量糖化血紅蛋白總量，而糖化血紅蛋白總量在臨床上并沒有意義，臨床上需要的是糖化血紅蛋白與總血紅蛋白的比值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是，提供一種操作簡單、只需一個動作即可檢測出糖化血紅蛋白百分含量的定量檢測方法。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是，提供一種操作簡單、只需一個動作即可檢測出糖化血紅蛋白百分含量的試劑盒。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是，提供測量糖化血紅蛋白的試劑盒的使用方法。為了解決上述第一個技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種非疾病治療目的的測量糖化血紅蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，將固定量的磁性粒子懸液加入裂解后的樣本中，磁性粒子吸附血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗，并重懸于磷酸鹽緩沖液中；
(2)在重懸液中加入經(jīng)過熒光標記或酶標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，吸附糖化血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗，所述可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)是指抗糖化血紅蛋白抗體或者間氨基苯硼酸中的一種或兩種；
(3)沖洗完成后，用熒光標記的，放入熒光檢測儀中讀數(shù)；用酶標記的，加入底物和終止液,反應終止后放入酶標儀中讀數(shù)。作為一個優(yōu)選方案，步驟(I)所述的磁性粒子表面為高分子聚合物，通過靜電吸附血紅蛋白，所述高分子聚合物指聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、纖維素、瓊脂糖中的一種；或者磁性粒子表面為官能團，磁性粒子預先包被抗血紅蛋白抗體之后再加入樣本中，通過抗血紅蛋白抗體捕獲血紅蛋白，所述官能團指羧基、巰基、環(huán)氧基、氨基或者醛基中的一種。步驟(2)所述熒光標記的標記物是羅丹明B、硒化鎘量子點、鑭配合物中的一種。步驟(2)所述酶標記的標記物是辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酶中的一種，加入辣根過氧化物酶的標記物磷酸鹽緩沖液沖洗后加入底物過氧化氫溶液和四甲基聯(lián)苯胺溶液，溫育后，加入硫酸溶液終止；加入堿性磷酸酶的標記物磷酸鹽緩沖液沖洗后加入底物對硝基苯磷酸鹽溶液，溫育后，加入碳酸鈉溶液終止。為了解決上述第二個技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種測量糖化血紅蛋白的試劑盒，包括盒體、試劑瓶、瓶墊、合頁和盒蓋，盒體通過合頁與盒蓋連接，其特征在于，所述試劑瓶為至少四個，分別放置磁性粒子懸液，紅細胞裂解液，沖洗液和信號，所述磁性粒子懸液吸附血紅蛋白，所述紅細胞裂解液為純水或者表面活性劑溶液，通過將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，所述沖洗液是磷酸鹽緩沖液，所述信號為經(jīng)過熒光標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，所述熒光標記的標記物是羅丹明B、硒化鎘量子點、鑭配合物中的一種，所述可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)是指抗糖化血紅蛋白抗體或者間氨基苯硼酸中的一種或兩種。為了解決上述第二個技術(shù)問題，本發(fā)明亦提供了一種測量糖化血紅蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶為至少六個，分別放置磁性粒子懸液，紅細胞裂解液，沖洗液、信號、底物和終止液，所述磁性粒子懸液吸附血紅蛋白，所述紅細胞裂解液為純水或者表面活性劑溶液，將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，所述沖洗液是磷酸鹽緩沖液，所述信號為經(jīng)過酶標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，所述底物為特異的針對信號的放大系統(tǒng)，根據(jù)酶標的不同可以有不止一樣底物，所述酶標記的標記物是辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酶中的一種，當標記物是辣根過氧化物酶時，底物為過氧化氫溶液和四甲基聯(lián)苯胺溶液，終止液為硫酸溶液，當標記物是堿性磷酸酶時，底物為對硝基苯磷酸鹽溶液，終止液為碳酸鈉溶液，所述可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)是指抗糖化血紅蛋白抗體或者間氨基苯硼酸中的一種或兩種。作為一個優(yōu)選方案，所述磁性粒子表面為高分子聚合物，通過靜電吸附血紅蛋白，所述高分子聚合物指聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、纖維素、瓊脂糖中的一種；或者磁性粒子表面為官能團，磁性粒子預先包被抗血紅蛋白抗體之后再加入樣本中，通過抗血紅蛋白抗體捕獲血紅蛋白，所述官能團指羧基、巰基、環(huán)氧基、氨基或者醛基中的一種。為了解決上述第三個技術(shù)問題，本發(fā)明提供了上述測量糖化血紅蛋白的試劑盒的使用方法，其特征在于，將全血樣本置于反應容器中，倒入紅細胞裂解液將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，加入固定量的磁性粒子懸液，磁性粒子吸附血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗，并重懸于磷酸鹽緩沖液中；然后在重懸液中加入經(jīng)過熒光標記或酶標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，吸附糖化血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗；沖洗完成后，用熒光標記的，放入熒光檢測儀中讀數(shù)；用酶標記的，加入底物和終止液，反應終止后放入酶標儀中讀數(shù)。包被有抗血紅蛋白抗體的磁珠只能捕獲血紅蛋白，包括糖化血紅蛋白與非糖化血紅蛋白總量；而不包被的磁珠能捕獲樣本中的所有蛋白包括血紅蛋白和樣本中其他蛋白，其他蛋白含量較少。所以，不管包被與否的磁性粒子，只要能捕獲血紅蛋白均能實現(xiàn)本發(fā)明目的，但是包被后的靈敏度與抗干擾性要比不包被的好，這樣準確度也會提高。磁珠在本發(fā)明中是以懸浮液的形式存在，只要加入固定體積固定濃度磁珠懸浮液就可以保證加入的磁珠量是固定的。本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明可以稱為“一步法”，基于這樣一個全新的思路，由于樣本中游離的糖化血紅蛋白和非糖化血紅蛋白的比例是固定的，這樣載體與樣本反應時就能夠?qū)颖局械奶腔t蛋白和非糖化血紅蛋白按比例捕獲到載體表面。本發(fā)明使用能夠定量捕捉樣本中的糖化血紅蛋白和非糖化血紅蛋白的磁性顆粒，只需要檢測磁性顆粒上糖化血紅蛋白的含量，再與標準工作曲線做對照就能計算出樣本中糖化血紅蛋白占總血紅蛋白的百分比。操作簡單只需一個動作即可完成糖化血紅蛋白百分含量的定量檢測。本發(fā)明可以不需使用抗體等生物原料，價格低廉，容易實現(xiàn)檢測儀器小型化。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例11、磁珠包被抗血紅蛋白抗體。將磁珠(默克公司出品，粒徑為3um，表面有羧基)用0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋至100mg/ml,調(diào)節(jié)pH至7. 2。取IOOml稀釋后的磁珠加入0.1g碳二亞胺和0.1g羥基琥珀酰亞胺混合均勻后，37攝氏度溫育30分鐘。溫育完成后，用0.1M磷酸鹽緩沖液沖洗。沖洗完成后將磁珠重懸于0.1M磷酸鹽緩沖液中，加入IOmg抗血紅蛋白抗體混合均勻后溫育30分鐘。溫育完成后,用0.1M磷酸鹽緩沖液沖洗。最后重懸于IOOml
0.1M磷酸鹽緩沖液中，待用。2、全血樣本裂解。將IOOul壓積紅細胞加入IOml純水中裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白。3、磁珠吸附血紅蛋白。將IOul裂解后的樣本加入到IOul包被有抗血紅蛋白抗體的磁珠中，混合均勻后溫37攝氏度溫育2分鐘后，用0.1M磷酸鹽緩沖液沖洗。最后重懸于20ul0.1M磷酸鹽緩沖液中。4、信號的加入。將IOul辣根過氧化物酶與抗糖化血紅蛋白抗體相結(jié)合的結(jié)合物溶液加入到吸附有血紅蛋白的磁珠重懸液中。溫育2分鐘。溫育結(jié)束后用0.1M磷酸鹽緩沖液沖洗后，加入0.1M過氧化氫溶液和0.1M四甲基聯(lián)苯胺溶液，溫育2分鐘后，加入0.1M硫酸終止。5、讀數(shù)。將終止后的反應，放入酶標儀中讀數(shù)。所得結(jié)果帶入工作曲線即可得到樣本中糖化血紅蛋白所占的百分比。工作曲線的制作如下
配制 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14% 一系列質(zhì)控品。使用本發(fā)明試劑檢測上述質(zhì)控品后，將所得信號與質(zhì)控品標準值做工作曲線。使用本實施例中的試劑、市售生化試劑(兩步法)、高效液相色譜法(HPLC)所作對t匕，結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種非疾病治療目的的測量糖化血紅蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，將固定量的磁性粒子懸液加入裂解后的樣本中，磁性粒子吸附血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗，并重懸于磷酸鹽緩沖液中；(2)在重懸液中加入經(jīng)過熒光標記或酶標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，吸附糖化血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗，所述可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)是指抗糖化血紅蛋白抗體或者間氨基苯硼酸中的一種或兩種；(3)沖洗完成后，用熒光標記的，放入熒光檢測儀中讀數(shù)；用酶標記的，加入底物和終止液,反應終止后放入酶標儀中讀數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病治療目的的測量糖化血紅蛋白的方法，其特征在于，步驟(I)所述的磁性粒子表面為高分子聚合物，通過靜電吸附血紅蛋白，所述高分子聚合物指聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、纖維素、瓊脂糖中的一種；或者磁性粒子表面為官能團，磁性粒子預先包被抗血紅蛋白抗體之后再加入樣本中，通過抗血紅蛋白抗體捕獲血紅蛋白，所述官能團指羧基、巰基、環(huán)氧基、氨基或者醛基中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病治療目的的測量糖化血紅蛋白的方法，其特征在于，步驟(2)所述熒光標記的標記物是羅丹明B、硒化鎘量子點、鑭配合物中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病治療目的的測量糖化血紅蛋白的方法，其特征在于，步驟(2 )所述酶標記的標記物是辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酶中的一種，加入辣根過氧化物酶的標記物磷酸鹽緩沖液沖洗后加入底物過氧化氫溶液和四甲基聯(lián)苯胺溶液，溫育后，加入硫酸溶液終止；加入堿性磷酸酶的標記物磷酸鹽緩沖液沖洗后加入底物對硝基苯磷酸鹽溶液，溫育后，加入碳酸鈉溶液終止。
5.一種測量糖化血紅蛋白的試劑盒，包括盒體、試劑瓶、瓶墊、合頁和盒蓋，盒體通過合頁與盒蓋連接，其特征在于，所述試劑瓶為至少四個，分別放置磁性粒子懸液，紅細胞裂解液，沖洗液和信號，所述磁性粒子懸液吸附血紅蛋白，所述紅細胞裂解液為純水或者表面活性劑溶液，通過將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，所述沖洗液是磷酸鹽緩沖液，所述信號為經(jīng)過熒光標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，所述熒光標記的標記物是羅丹明B、硒化鎘量子點、鑭配合物中的一種，所述可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)是指抗糖化血紅蛋白抗體或者間氨基苯硼酸中的一種或兩種。
6.一種測量糖化血紅蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶為至少六個，分別放置磁性粒子懸液，紅細胞裂解液，沖洗液、信號、底物和終止液，所述磁性粒子懸液吸附血紅蛋白，所述紅細胞裂解液為純水或者表面活性劑溶液，將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，所述沖洗液是磷酸鹽緩沖液，所述信號為經(jīng)過酶標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，所述底物為特異的針對信號的放大系統(tǒng)，根據(jù)酶標的不同可以有不止一樣底物，所述酶標記的標記物是辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酶中的一種，當標記物是辣根過氧化物酶時，底物為過氧化氫溶液和四甲基聯(lián)苯胺溶液，終止液為硫酸溶液，當標記物是堿性磷酸酶時，底物為對硝基苯磷酸鹽溶液，終止液為碳酸鈉溶液，所述可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)是指抗糖化血紅蛋白抗體或者間氨基苯硼酸中的一種或兩種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的一種測量糖化血紅蛋白的試劑盒，其特征在于，所述磁性粒子表面為高分子聚合物，通過靜電吸附血紅蛋白，所述高分子聚合物指聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、纖維素、瓊脂糖中的一種；或者磁性粒子表面為官能團，磁性粒子預先包被抗血紅蛋白抗體之后再加入樣本中，通過抗血紅蛋白抗體捕獲血紅蛋白，所述官能團指羧基、巰基、環(huán)氧基、氨基或者醛基中的一種。
8.權(quán)利要求5或6所述測量糖化血紅蛋白的試劑盒的使用方法，其特征在于，將全血樣本置于反應容器中，倒入紅細胞裂解液將全血樣本裂解以釋放出紅細胞中的血紅蛋白，加入固定量的磁性粒子懸液，磁性粒子吸附血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗，并重懸于磷酸鹽緩沖液中；然后在重懸液中加入經(jīng)過熒光標記或酶標記的可特異性識別糖化血紅蛋白的物質(zhì)，吸附糖化血紅蛋白后用磷酸鹽緩沖液沖洗；沖洗完成后，用熒光標記的，放入熒光檢測儀中讀數(shù)；用酶標記的，加入底物和終止液，反應終止后放入酶標儀中讀數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測量糖化血紅蛋白的方法及試劑盒，試劑盒包括盒體、試劑瓶、瓶墊、合頁和盒蓋，盒體通過合頁與盒蓋連接，試劑瓶為至少四個，分別放置磁性粒子懸液，紅細胞裂解液，沖洗液和信號。本發(fā)明使用能夠定量捕捉樣本中的糖化血紅蛋白和非糖化血紅蛋白的磁性顆粒，只需要檢測磁性顆粒上糖化血紅蛋白的含量，再與標準工作曲線做對照就能計算出樣本中糖化血紅蛋白占總血紅蛋白的百分比。本發(fā)明操作簡單只需一個動作即可完成糖化血紅蛋白百分含量的定量檢測。本發(fā)明可以不需使用抗體等生物原料，價格低廉，容易實現(xiàn)檢測儀器小型化。
文檔編號G01N33/72GK102998463SQ20121049766
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者江應玲, 肖江群, 王保丹, 鐘乾興, 曹大燁, 汪大明 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司