專利名稱：一種9-羰基-10,11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法。
背景技術(shù)：
紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum Spreng)是一種世界性惡性有毒雜草，自20世紀(jì)40年代從緬甸、印度、越南等國邊境傳入我國以來，迅速遍及云南、貴州、廣西、四川、西藏等省區(qū)。紫莖澤蘭的繁殖能力強(qiáng)，傳播速度快，以每年30公里的速度向北、向東推進(jìn)。在國家總局公認(rèn)的首批入侵國內(nèi)的16種外來物種黑名單中，紫莖澤蘭名列第一，被稱為生 物癌癥。其中9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮為紫莖澤蘭的主要致肝臟毒性成分及殺蟲的生物活性成分。因此有必要建立一種能在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的高效提取檢測9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，能快速的提取EUPTOX A，并精確的檢測其純度，為科學(xué)研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。其具體技術(shù)方案為一種9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，包括以下步驟A、樣品預(yù)處理采集紫莖澤蘭葉片在沒有陽光的地方陰干或凍干，然后粉碎；B、甲醇超聲一步提取法稱取上述A步驟樣品，溶于甲醇，置于40MHz超聲提取器或超聲波清洗器，在40°C超生提取30min，提取2_3次，即提取完全，過濾得到濾液；C、減壓蒸干將步驟B所得的濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40°C減壓蒸干，得到浸膏，按浸膏與甲醇的用量比為1: 5溶解，待完全溶解加入蒸餾水至甲醇含量為20%進(jìn)行分散；D、萃取上述C步驟的甲醇水提液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的量為甲醇水提液的1/2，取上層減壓蒸干得到浸膏，為了提取率高可進(jìn)行多次萃??；E、硅膠拌樣，干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析按浸膏與硅膠H的用量比為1:1 I 2，攪拌混合后，加入層析柱后，先用二氯甲烷做洗脫液，洗去低極性雜質(zhì)；再用二氯甲烷乙酸乙酯(98 2, v/v)洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干得到浸膏；F、過樹脂浸膏溶于甲醇水三氯甲烷85 10 5(v/v/v)溶劑中，上XAD-2/DlOl大孔樹脂柱洗脫以除去色素等雜質(zhì)，收集洗脫液，減壓蒸干得到粗品，粗品反復(fù)硅膠層析，并且分時間段收集洗脫液，薄層色譜法對洗脫液進(jìn)行分類及合并同類項(xiàng)，展開劑為石油醚丙酮/12 I (v/v)，Rf值為0. 45的收集液為所提取物質(zhì)；G、HPLC檢測上述F步驟所得物質(zhì)用HPLC進(jìn)行濃度檢測，HPLC條件C18色譜柱規(guī)格為250_X4. 6_，5. Oiim ;流動相為20% -100%的甲醇；流速為ImL mirT1 ;進(jìn)樣量IOuL ;檢測波長為255nm ;柱溫為25°C ;梯度洗脫時間程序?yàn)?-10min。
步驟B中樣品和甲醇的質(zhì)量比為1: 10。步驟E中浸膏與硅膠H的用量比1: 2。步驟G中，梯度洗脫時間程序?yàn)閘Omin。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為1.本提取方法采用的是甲醇超聲一步法提取，避免了提取液的多次轉(zhuǎn)移而造成的污染、損失等誤差，充分保證了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.提取方法涉及的儀器非常簡單。所需的主要設(shè)備器材僅為測定干重時使用的烘箱，分析天平和甲醇提取時使用的超聲提取器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冰箱等等，在普通實(shí)驗(yàn)室均可以操作。3.另外，本提取方法操作簡單，大大減輕了工作強(qiáng)度，大大降低了提取的成本。4.本發(fā)明中采用的HPLC檢測方法可將毒素的保留時間縮短在IOmin內(nèi)。該檢測方法值得在9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮毒素的檢測中廣泛應(yīng)用推廣。


圖1為本發(fā)明一種9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮毒素的快速提取檢測方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。實(shí)施例IA、樣品預(yù)處理采集紫莖澤蘭葉片在沒有陽光的地方陰干，然后粉碎；B、甲醇超聲一步提取法稱取上述A步驟樣品20g，溶于IOOml的甲醇，置于40MHz超聲波清洗器，40°C超生提取30min，提取2次，即提取完全，過濾得到濾液；C、減壓蒸干將上述濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40°C減壓蒸干，得到浸膏，用5ml甲醇溶解，并加入蒸餾水20ml至甲醇含量為20%進(jìn)行分散；D、萃取上述C步驟的甲醇水提液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的量為15ml，充分搖勻，靜止待萃取完成后取其上層(乙酸乙酯部分)減壓蒸干得到浸膏，如果萃取不完全可以適當(dāng)增加乙酸乙酯的量；E、硅膠拌樣，干法上樣，濕法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析得到上述浸膏大約lg，按浸膏與硅膠H的用量比為1: 1，攪拌混合后，加入層析柱后，先用二氯甲烷30ml做洗脫液，洗去低極性雜質(zhì)；再用二氯甲烷乙酸乙酯(98 2，v/v) 120ml洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干得到浸膏；F、過樹脂浸膏溶于20ml甲醇水三氯甲烷(85 : 10 : 5，v/v/v)溶劑中，上DlOl大孔樹脂柱洗脫以除去色素等雜，收集洗脫液，減壓蒸干得到粗品，粗品反復(fù)硅膠層析，并且每3分鐘收集一次洗脫液，并用薄層色譜法對洗脫液進(jìn)行分類及合并同類項(xiàng)，展開劑為(石油醚丙酮/12 1，V/V)，Rf值為0. 45左右的收集液為所提取物質(zhì)；G、HPLC檢測上述F步驟所得物質(zhì)用HPLC進(jìn)行濃度檢測，HPLC條件C18色譜柱(250mmX 4. 6mm, 5. 0 u m);流動相為甲醇水=(50 : 50, v/v);流速為 ImLmirT1 ;進(jìn)樣量5UL ;檢測波長為255nm ;柱溫為25°C ;梯度洗脫時間程序?yàn)镺min ;進(jìn)樣前待測樣品微濾器過濾，做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的純度。在該梯度洗脫時間程序下沒有出現(xiàn)波峰，把洗脫時間改為無限后波峰在4. 5min出現(xiàn)。實(shí)施例2A、樣品預(yù)處理采集紫莖澤蘭葉片在沒有陽光的地方陰干，然后粉碎；B、甲醇超聲一步提取法稱取上述A步驟樣品20g，溶于200ml的甲醇，置于40MHz超聲波清洗器，40°C超生提取30min，提取3次，即提取完全，過濾得到濾液；C、減壓蒸干將上述濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40°C減壓蒸干，得到浸膏，用12ml甲醇溶解，并加入蒸餾水48ml至甲醇含量為20%進(jìn)行分散；D、萃取上述C步驟的甲醇水提液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的量為30ml (甲醇水提液的1/2)，充分搖勻，靜止待萃取完成后取其上層(乙酸乙酯部分)減壓蒸干得到浸膏，如果萃取不完全可以適當(dāng)增加乙酸乙酯的量或多次萃?。籈、硅膠拌樣，干法上樣，濕法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析得到上述浸膏大約2g，按浸膏與硅膠H的用量比為1: 2，攪拌混合后，加入層析柱后，先用二氯甲烷50ml做洗脫液，洗去低極性雜質(zhì)；再用二氯甲烷乙酸乙酯(98 2，v/v) 150ml洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干得到浸膏；F、過樹脂浸膏溶于20ml甲醇水三氯甲烷(85 : 10 : 5，v/v/v)溶劑中，上DlOl大孔樹脂柱洗脫以除去色素等雜，收集洗脫液，減壓蒸干得到粗品，粗品反復(fù)硅膠層析，并且每5分鐘收集一次洗脫液，并用薄層色譜法對洗脫液進(jìn)行分類及合并同類項(xiàng)，展開劑為(石油醚丙酮/12 1，v/v) ,Rf值為0.45左右的收集液為所提取物質(zhì)；G、HPLC檢測上述F步驟所得物質(zhì)用HPLC進(jìn)行濃度檢測，HPLC條件C18色譜柱(250mmX 4. 6mm, 5. 0 u m);流動相為甲醇:水=(50 : 50, v/v);流速為 ImL .mirT1 ;進(jìn)樣量IOuL ;檢測波長為255nm ;柱溫為25°C;梯度洗脫時間程序?yàn)?min ;進(jìn)樣前待測樣品微濾器過濾，根據(jù)峰面積和進(jìn)樣量做線性回歸分析計(jì)算。但是在該梯度洗脫時間程序下，波峰不夠完整，有的雜峰還沒有出現(xiàn)可能導(dǎo)致誤差偏大。實(shí)施例3A、樣品預(yù)處理采集紫莖澤蘭葉片在沒有陽光的地方陰干，然后粉碎；B、甲醇超聲一步提取法稱取上述A步驟樣品20g，溶于200ml的甲醇，置于50MHz超聲波清洗器，40°C超生提取30min，提取3次，即提取完全，過濾得到濾液；C、減壓蒸干將上述濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50°C減壓蒸干，得到浸膏，用IOml甲醇溶解，并加入蒸餾水40ml至甲醇含量為20%進(jìn)行分散；D、萃取上述C步驟的甲醇水提液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的量為25ml (甲醇水提液的1/2)，充分搖勻，靜止待萃取完成后取其上層(乙酸乙酯部分)減壓蒸干得到浸膏，如果萃取不完全可以適當(dāng)增加乙酸乙酯的量；E、硅膠拌樣，干法上樣，濕法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析得到上述浸膏大約1. 5g，按浸膏與硅膠H的用量比為1: 2，攪拌混合后，加入層析柱后，先用二氯甲烷40ml做洗脫液，洗去低極性雜質(zhì)；再用二氯甲烷乙酸乙酯(98 2，v/v) 150ml洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干得到浸膏；F、過樹脂浸膏溶于20ml甲醇水三氯甲烷(85 : 10 : 5，v/v/v)溶劑中，上DlOl大孔樹脂柱洗脫以除去色素等雜，收集洗脫液，減壓蒸干得到粗品，粗品反復(fù)硅膠層析，并且每5分鐘收集一次洗脫液，并用薄層色譜法對洗脫液進(jìn)行分類及合并同類項(xiàng)，展開劑為(石油醚丙酮/12 1，v/v)，Rf值為0. 45左右的收集液為所提取物質(zhì)；G、HPLC檢測上述F步驟所得物質(zhì)用HPLC進(jìn)行濃度檢測，HPLC條件C18色譜柱(250mmX 4. 6mm, 5. 0 u m);流動相為甲醇水=(50 : 50, v/v);流速為 ImLmirT1 ;進(jìn)樣量IOuL ;檢測波長為255nm ;柱溫為25°C ;梯度洗脫時間程序?yàn)镮Omin ;進(jìn)樣前待測樣品微濾器過濾，根據(jù)峰面積和進(jìn)樣量做線性回歸分析計(jì)算。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 A、樣品預(yù)處理采集紫莖澤蘭葉片在沒有陽光的地方陰干或凍干，然后粉碎； B、甲醇超聲一步提取法稱取上述A步驟樣品，溶于甲醇，置于40MHz超聲提取器或超聲波清洗器，在40°C超生提取30min，提取2_3次，即提取完全，過濾得到濾液； C、減壓蒸干將步驟B所得的濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40°C減壓蒸干，得到浸膏，按浸膏與甲醇的用量比為I : 5溶解，待完全溶解加入蒸餾水至甲醇含量為20%進(jìn)行分散； D、萃取上述C步驟的甲醇水提液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的量為甲醇水提液的1/2，取上層減壓蒸干得到浸膏； E、硅膠拌樣，干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析按浸膏與硅膠H的用量比為I: I I : 2，攪拌混合后，加入層析柱后，先用二氯甲烷做洗脫液，洗去低極性雜質(zhì)；再用二氯甲烷乙酸乙酯98 2(v/v)洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干得到浸膏； F、過樹脂浸膏溶于甲醇水三氯甲烷85 10 5 (v/v/v)溶劑中，上XAD-2/DlOl大孔樹脂柱洗脫以除去色素等雜質(zhì)，收集洗脫液，減壓蒸干得到粗品，粗品反復(fù)硅膠層析，并且分時間段收集洗脫液，薄層色譜法對洗脫液進(jìn)行分類及合并同類項(xiàng)，展開劑為石油醚丙酮/12 I (V/V)，Rf值為O. 45的收集液為所提取物質(zhì)； G、HPLC檢測上述F步驟所得物質(zhì)用HPLC進(jìn)行濃度檢測，HPLC條件C18色譜柱規(guī)格為250mmX4. 6mm，5. O μ m ;流動相為20% -100%的甲醇；流速為ImL · mirT1 ;進(jìn)樣量10 μ L ;檢測波長為255nm ;柱溫為25°C ;梯度洗脫時間程序?yàn)?-10min。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，其特征在于，步驟B中樣品和甲醇的質(zhì)量比為I : 10。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，其特征在于，步驟E中浸膏與硅膠H的用量比I : 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，其特征在于，步驟G中，梯度洗脫時間程序?yàn)閘Omin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的快速提取檢測方法，其步驟A、樣品預(yù)處理采集紫莖澤蘭葉片陰干，粉碎；B、甲醇超聲一步提取法稱取上述A步驟樣品，溶于甲醇，在超聲提取器中提取，過濾得到濾液；C、減壓蒸干將上述濾液減壓蒸干，得到浸膏，用少量甲醇溶解，用水分散；D、萃取上述C步驟的甲醇溶液用乙酸乙酯萃取，取上層減壓蒸干得到浸膏；E、硅膠柱層析；G、HPLC檢測。本發(fā)明可靠性高、所用儀器簡單、操作方便、檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)，適于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)毒素的制備和分析工作。
文檔編號G01N30/06GK102980956SQ20121051035
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月18日
發(fā)明者胡延春, 廖飛, 王云飛, 舒剛 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)