專利名稱：超靈敏黃曲霉毒素B₁酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析檢測(cè)試劑領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備、使用方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一種極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，已被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，普遍存在于霉變的糧食、詞料及其制品中。黃曲霉毒素BpByG1及G2是糧食和食品中黃曲霉毒素主要存在形式，其中黃曲霉毒素B1的毒性和致癌性最強(qiáng)。由于自然界黃曲霉產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的毒素以AFB1的為主，而且其毒性和致癌性最大，因此，在檢驗(yàn)中通常都以AFB1作為分析指標(biāo)。黃曲霉毒素B1的分子式為C17H12O6，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫檢測(cè)超靈敏試劑盒，所述試劑盒包括黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，固相載體，酶標(biāo)記物，底物顯色液，樣品稀釋液，終止液及濃縮洗滌液，其特征在于，所述固相載體為微孔板，且所述微孔板由黃曲霉毒素BI單克隆抗體包被，所述酶標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素BI完全抗原，所述底物顯色液含四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，終止液含硫酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體是黃曲霉毒素BI的特異性高親和力單克隆抗體，間接ELISA效價(jià)達(dá)1: 32萬(wàn)；所述酶標(biāo)抗原是黃曲霉毒素BI完全抗原與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物；酶與完全抗原的偶聯(lián)比是3 I 8 :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)抗原含有 黃曲霉毒素BI完全抗原 辣根過(guò)氧化物酶 所述黃曲霉毒素BI完全抗原的黃曲霉毒素BI與蛋白偶聯(lián)比是8 I 14 :1 所述酶與抗體的偶聯(lián)比是3 I 8 :1
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液含有 NaCL10 25% (重量) Proclin-3000.1 1. 0% (重量) 吐溫200. 05 0. 15% (體積) 磷酸緩沖液0. 05 0. 40mol/L PH 7. 2 7. 6
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液含有 NaCL15%(重量) Proclin-3000. 1% (重量)吐溫200. 05% (體積)磷酸緩沖液0.1 mo I/L PH 7. 4
6.一種檢測(cè)黃曲霉毒素BI的酶聯(lián)免疫檢測(cè)超靈敏試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 A、制備固相載體將0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH值為9. 0-9. 6)與曲霉毒素BI的特異性高親和力單克隆抗體或完全抗原以適當(dāng)比例混合，將混合液負(fù)載于載體上，用含0. 05%吐溫20(體積)的磷酸鹽緩沖液洗滌后，用保護(hù)液封閉保護(hù)上述洗滌后的載體； B、制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素BI的完全抗原或單克隆抗體采用改進(jìn)過(guò)的高碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素BI的完全抗原或單克隆抗體，采用棋盤滴定法選擇最佳的酶標(biāo)記物的工作濃度。酶標(biāo)抗原或抗體溶于酶稀釋液中以制備抗原或抗體工作溶液； C、制備底物顯色液 a)顯色A溶液的制備以DMSO為稀釋液配制成較低濃度的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液即成。
b)顯色B溶液的制備以去離子水為稀釋液配制成一定濃度的一水合檸檬酸、過(guò)氧化氫尿素和十二水磷酸一氫鈉混合液即成。D、制備濃縮洗滌液 濃縮洗滌液中含有 NaCL5 20% (重量)Proclin-3000.1 1.0% (重量) 吐溫200. 05 0. 15% (體積)憐酸緩沖液0. 05 0. 40mol/L pH 7. 0 7. 6E、制備黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)溶液用黃曲霉毒素BI的純品配制，分裝0、0.1,0. 3,0. 9、.2.7,8.1ng/mL共6瓶，過(guò)濾除菌、分裝、低溫避光保存。
F、制備終止液 終止液含有 硫酸15% (質(zhì)量) G、制備樣品提取液 所述樣品提取液含有 甲醇50 80% (體積) NaCL2 10% (重量)
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述濃縮洗滌液含有 NaCl8% Proclin-3000. 1% Tween200.5%磷酸緩沖液0.1mol/L pH 7.4 所述樣品提取液含有 甲醇 70% (體積) NaCL 4% (重量)
8.—種檢測(cè)黃曲霉毒素BI的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)樣品的前處理 將所述樣品粉碎成粉末，與樣品提取液按1: 5比例混合，過(guò)篩后取上清液4°C保存，使用時(shí)用樣品稀釋液1:9體積稀釋為樣品液。
2)使用前述兩種試劑盒任一種所述試劑盒及微孔板酶標(biāo)分析儀檢查定量樣品液黃曲霉毒素BI的含量。
其中，所述步驟2)包括 A.加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品30 60uL到對(duì)應(yīng)微孔板中，加AFBl酶標(biāo)物30 60uL/孔，震蕩搖勻，用蓋板膜蓋板后室溫或37°C反應(yīng)20 60min。
B.洗板揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液200 300uL/孔，充分洗滌數(shù)次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
C.顯色加入顯色液50 150uL/孔，蓋板后置室溫或37°C避光反應(yīng)10 20min。
D.測(cè)定加入終止液20 60uL/孔，震蕩搖勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450檢測(cè)，測(cè)定每孔OD值。E.結(jié)果判定在微孔板酶標(biāo)儀上測(cè)量OD值，與根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，確定樣品液中黃曲霉毒素BI的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中反應(yīng)溫度為37°C ;所述黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品或樣品液的加入體積為50uL/孔，所述酶標(biāo)記物的加入體積50uL/孔，所述顯色液的體積IOOuL/孔，所述洗滌工作液體積300uL/孔，所述終止液體積50uL/孔。溫育時(shí)間為40min,避光反應(yīng)時(shí)間為15min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種超靈敏黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，固相載體，酶標(biāo)記物，底物顯色液，樣品稀釋液，終止液及濃縮洗滌液，其中，所述固相載體為微孔板，由黃曲霉毒素B1單克隆抗體包被，所述酶標(biāo)記物是有辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的黃曲霉毒素B1蛋白偶聯(lián)物，底物顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。本發(fā)明還公開(kāi)了一種超靈敏黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法及檢測(cè)黃曲霉B1的方法。使用本發(fā)明制備的試劑盒黃曲霉毒素B1，具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性好，線性好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103018458SQ20121051798
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者時(shí)國(guó)慶, 孫清, 楊敬臣, 李谷豐 申請(qǐng)人:北京普贊生物技術(shù)有限公司