專利名稱：一種氣味傳感器檢測水果采后病害的方法
技術領域：
本發(fā)明是一種氣味傳感器檢測水果采后病害的方法，屬于農產品采后品質檢測和控制的技術領域。
背景技術：
·世界水果種類繁多，主要有葡萄、蘋果、梨、桃、李、草莓、杏、柿子、櫻桃、獼猴桃、柑桔、香蕉、菠蘿和無花果等。我國是世界水果生產大國，如蘋果、梨、桃、李和柿子的產量均為世界之首。水果采后在采摘、運銷、以及貯藏過程中因腐爛所造成的損失是巨大的。據(jù)資料報道，發(fā)達國家的果蔬采后因腐爛而造成的損失也在15 24%左右，發(fā)展中國家由于缺乏冷藏設備和衛(wèi)生條件較差，果蔬采后的損失高達50%。腐爛主要歸因于病原微生物的致病作用。由于水果產品組織柔嫩多汁并富含糖分，在采摘、運輸、銷售、貯藏環(huán)節(jié)中容易損傷和變質。病原微生物多從寄生性較低的傷口或死組織入侵，這些病原微生物主要有灰葡萄飽(Botrytis cinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stolonnifer)、青霉屬(Penicilliums spp.)、毛霉屬(Mueorspp.)、鏈格抱(Alternaria spp·)、曲霉(Aspergillus spp.)和軟腐細菌(Erwinia sp.)等等。這些病菌共同的特點是生長繁殖迅速，可侵染水果器官使之迅速腐爛變質。傳統(tǒng)檢驗病原體方法主要依靠具體微生物學和生物化學技術，如利用培養(yǎng)基方法根據(jù)菌落特性和生化反應特點進行檢測，這些方法都能定量或定性分析病原體，但費時、費用大，且需要專業(yè)技術人員。受感染水果發(fā)病呈現(xiàn)較明顯癥狀，水果損失已經(jīng)比較嚴重，而且進入包裝中就會感染臨近果實從而導致嚴重的經(jīng)濟損失。因此，探討快速、精確、無損的水果病害早期檢測方法具有十分重要的意義和應用價值。

發(fā)明內容
技術問題針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種水果采后病害的無損檢測方法，利用氣體傳感器獲得采后水果的氣味信息判斷水果是否感染病原微生物及感染的種類，可以進行非破壞性的檢測，減少經(jīng)濟損失。技術方案一種水果采后病害的無損檢測方法(技術路線見圖I)，是利用氣味傳感器檢測水果感染不同病原微生物后散發(fā)的氣味來確定水果是否感染病害及感染病害的種類，其特征在于它的檢測步驟如下，I)將水果樣品表面去雜、洗凈，用75%酒精浸泡30s，待酒精揮發(fā)完全后進行接種處理，所有樣品分為兩組，一組用于氣味傳感器獲取水果氣味信息，一組用于氣相質譜聯(lián)用儀器測定水果氣味的化學組成和相對含量，其中，水果樣品分別接種該類水果采后易感染的病源微生物，模擬水果采后病原微生物感染，接種每一類病原微生物的水果樣品和代表未感染病害水果樣品數(shù)量均為50-80個；2)將水果樣品進行貯藏，間隔相同時間采用氣味傳感器和氣相質譜聯(lián)用儀器測試水果的氣味，其中氣味傳感器測試時，將水果樣品置于密閉容器中，當頂空氣體達到飽和時，氣味傳感器獲取氣味的響應信號，并進行分析處理，同時，利用氣相質譜聯(lián)用儀器檢測分析氣味的化學組成和相對含量；3)氣體傳感器和氣相質譜聯(lián)用儀檢測結束后，計算腐爛指數(shù)，腐爛指數(shù)大于0，則表明水果已經(jīng)感染病原微生物，其中，按果實腐爛面積大小將果實劃分為3級0級，無腐爛；1級，果面有I 3個黃褐色病斑，且病變組織面積不超過果實總表面積的25% ；2級，果實表面出現(xiàn)菌絲，或病變組織面積達到果實總表面積的25%以上，按下式計算腐爛指數(shù)腐爛指數(shù)=Σ [(腐爛級別X該級果實數(shù))/(最高腐爛級別X總果實數(shù))]Χ100% ；4)分析氣相質譜聯(lián)用儀器的數(shù)據(jù)，根據(jù)氣體成分的組成和含量的差異程度，確定水果氣味差異最大的貯藏時間，同時對獲取的氣味傳感器響應數(shù)據(jù)分別按照貯藏時間和感染病原微生物種類進行主成分分析，綜合氣相質譜聯(lián)用儀器信息和氣味傳感器信息，根據(jù)同時實現(xiàn)盡早判斷水果感染病害和易于區(qū)分感染病原微生物種類的原則，確定較佳的測試時間，結合傳感器響應值的方差顯著性分析結果確定較佳的氣味傳感器組合；·5)在選定的傳感器組合基礎上，建立如下基于馬氏距離的Fisher線性判別分析模型，y0 = b0+a10 X S^a20 X S2+a30 X S3+- +an0 X snY1 = b1+a11 X S^a21 X S2+a31 X S3+··· +anl X Sny2 = b2+a12XS1+a22XS2+a32XS3+...+an2XSn......yk = bk+alk X S^a2k X S2+a3k X S3+- ·· +Bnk X Sn (I)上式中，S是氣味傳感器的響應值，是根據(jù)傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后的電阻量G與傳感器在經(jīng)過標準活性碳過濾氣體的電阻量Gtl的比值GAV下標為傳感器對應編號，取
值從1、2、3......n ;b和a分別為判別式的常數(shù)項和自變量系數(shù)，y的下標代表感染病原微
生物的類型，其中O代表沒有感染病原微生物；6)將未知水果樣品放入封閉容器，采用氣味傳感器獲取響應值，代入式(I)中，比較所有I值，y值最大的組其下標代表該水果感染的病原微生物類型。有益效果本發(fā)明利用氣味傳感器獲得水果采后的氣味信息，能夠不破壞水果完整性的情況下，通過水果散發(fā)出的氣味信息，判斷出采后水果是否已經(jīng)感染病原微生物以及感染的種類，能夠提前快速獲得水果采后的質量信息，對采后水果病害情況進行及時預警，為操作者進一步處理提供有效信息，避免嚴重的經(jīng)濟損失。相對于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測等方法，不僅節(jié)省時間，而且避免了化學試劑的使用。技術和方法新穎，研究成果不僅可以用于實驗室的快速分析和檢測，而且可以通過開發(fā)在線檢測設備和便攜式儀器，用于水果采后加工、貯藏和銷售等各個環(huán)節(jié)。
四

圖I :技術路線圖2 :腐爛指數(shù)；圖3 :不同處理組草莓果實響應值PCA分析圖，其中(a)對照組草莓響應信號的主成分分析圖，(b)接種灰霉病草莓響應信號的主成分分析圖，(c)接種擴展青霉草莓響應信號的主成分分析圖，(d)接種根霉草莓響應信號的主成分分析圖；圖4 :不同處理草莓傳感器響應值PCA分析結果，其中(a)第O天不同處理組響應信號的主成分分析圖，(b)第2天不同處理組響應信號的主成分分析圖
五具體實施例方式—種氣味傳感器檢測水果病害的方法，以草莓為例，具體實施方式
如下I.試驗材料實驗所用草莓品種為“紅顏”。2012年4月14日采摘于南京江心洲草莓園，選擇色澤均勻、大小一致，無表面損傷的草莓。
選擇草莓采后感染常見的三種病原菌灰霉(Botrytis sp.,BC)、擴展青霉(Penicillium sp.，PE)和根霉(Rhizopus sp.，RH),使用前在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potatodextrose agar, PDA)上24°C、85%相對濕度條件下活化7d。2.儀器便攜式電子鼻(AIRSENSE，PEN3)。所用電子鼻傳感器陣列包含10個傳感器，分別為WlC^S1 :對芳香型化合物敏感，檢測限IOppm)、W5S (S2 :對氮氧化物敏感，檢測限Ippm)、W3C (S3 :對氨類、芳香型化合物敏感，檢測限IOppm)、W6S(S4 :對氫氣敏感，檢測限IOOppm)、W5C(S5 :對烷烴、芳香型化合物敏感，檢測限lppm)、WlS (S6 :對烴類物質敏感，檢測限IOOppm)、W1W(S7 :對硫化氫、萜烯類敏感，檢測限lppm)、W2S(S8 :對醇類、部分芳香型化合物敏感，檢測限IOOppm)、W2ff(S9 :對芳香成分，對有機硫化物敏感，檢測限lppm)、W3S(S10 對濃度、烷烴敏感，并具有選擇性，檢測限IOOppm)。測定時，傳感器涂層吸附樣品中的揮發(fā)性物質產生電導率變化，記錄傳感器吸附樣品揮發(fā)物后的電阻率G與傳感器吸附經(jīng)活性碳過濾的空氣電導率Gtl的比值GAV響應氣體濃度越大，G/G0的值越偏離I (大于或者小于I)，如果濃度低于檢測限或者沒有感應氣體，則該比值接近甚至等于I。3.試驗方法將挑選出的草莓平均分為4組。75%酒精浸泡30s，待酒精揮發(fā)完全后進行接種處理。處理組果實分別于4X IO5個/mL的灰霉(BC)、青霉(PE)和根霉(RH)的孢子懸浮液中浸泡30s，對照組用無菌水(CK)處理，晾干后每3顆果實(50±5g)為I組，置于IOOmL紙杯中5°C冷藏。將裝有草莓的紙杯自冰箱取出放入150mL燒杯中，于24°C、85%相對濕度條件下敞口回溫2h，使果實內部溫度達到24°C，用錫紙封口于24°C中靜置lOmin。試驗參數(shù)為流速120mL/min，測定時間60s，洗氣時間80s，樣品準備時間5s，自動調零時間5s。試驗發(fā)現(xiàn)傳感器響應值在25s左右趨于穩(wěn)定，選擇30s處的響應值用于數(shù)據(jù)分析。按果實腐爛面積大小將果實劃分為3級0級，無腐爛；1級，果面有I 3個黃褐色病斑，且病變組織面積不超過果實總表面積的25% ;2級，果實表面出現(xiàn)菌絲，或病變組織面積達到果實總表面積的25%以上。按下式計算腐爛指數(shù)腐爛指數(shù)=Σ [(腐爛級別X該級果實數(shù))/(最高腐爛級別X總果實數(shù))]X 100%。氣相質譜聯(lián)用(GC-MS)測定揮發(fā)性物質每個處理組取5顆草莓，切碎混勻，液氮處理后-18°C存放待用。將固相微萃取裝置插入并推出纖維頭進行老化；取IOg果漿于20mL樣品瓶中，40°C水浴,用老化過的萃取裝置萃取40min。氣質聯(lián)用(GC-MS)測定參照ThomasRH等[27]的研究方法。氣相色譜儀進樣口溫度設為240°C，PDMS萃取頭于進樣口解析3min ;柱溫:50°C保持5min，然后以2°C每分鐘升至200。。，保持IOmin ；FID檢測器，240°C ；離子源溫度230°C;載氣He，流速lmL/min ;掃描范圍m/z30-450。各組分經(jīng)NIST譜庫檢索確定，僅選擇匹配度大于80%的組分，相對含量以峰面積占檢出氣體總峰面積百分比表示。4.傳感器對草莓揮發(fā)性物質的響應電子鼻響應信號在測定初始階段相對電導率快速上升，一定時間后逐漸趨于平緩，另外，S3 (對氨類、芳香型化合物敏感)、S5 (對烷烴、芳香型化合物敏感)、S6 (對烴類物質敏感)、S7 (對硫化氫、萜烯類敏感)、S8 (對醇類、部分芳香型化合物敏感)較其他傳感器有更高的相對電導率。通過電子鼻傳感器對草莓果實揮發(fā)性物質的響應試驗可知，電子鼻對草莓果實的揮發(fā)性物質有明顯的響應，且每一個傳感器對其響應值各不相同。基于病害影響草莓果實揮發(fā)性風味物質的假設，表明利用PEN3電子鼻系統(tǒng)識別草莓病害可行。5.病害對貯藏期草莓腐爛指數(shù)的影響 不同病原菌處理的草莓貯藏期腐爛指數(shù)的變化如圖2所示，從圖中可以看出隨貯藏時間的延長，各組果實的腐爛指數(shù)逐漸變大。CK組草莓發(fā)病最遲，第4天時仍無病害發(fā)生，貯藏末期的腐爛指數(shù)最小，而處理組果實在冷藏2d后即開始發(fā)病，且貯藏末期腐爛指數(shù)遠高于CK組。6.不同處理的草莓果實傳感器響應值主成分分析不同處理組的草莓果實主成分分析(PCA)分析結果見圖3，可以看出，各組果實第一、第二主成分累計貢獻率均在90%以上，能夠代表原始變量大部分的信息。CK組果實貯藏第4d時的樣品點分布與貯藏前期(0、2d)、后期(6、8、10d)均有明顯差異；各處理組的主成分分析結果相似，貯藏0d、2d天的樣品點分布有別于貯藏后期(4、6、8、10d)，貯藏2d時的樣品點分布與貯藏后期差別最大。7.電子鼻對草莓病害種類的區(qū)分利用PCA分別對處理后0d、2d的果實傳感器響應值進行分析，結果如圖4所示。由圖可知，在處理結束后立刻進行檢測，無法區(qū)分其病原菌種類，而處理后5°C貯藏2d后，不同處理樣品點聚集在不同位置。表明在處理后短期內病原菌對果實揮發(fā)性物質的影響不足以用于其種類的區(qū)分，而處理后2d其差異性就表現(xiàn)出來，在發(fā)病早期即可區(qū)分，因此，利用主成分分析進行草莓病害的早期判別是可行的。PCA分析結果可以直觀的顯示出各組之間的差異，要精確說明其差異需進行方差分析。Wilks' Lambda是組內平方和與總平方和之比。當所有觀測的組均值相等時，Wilks' Lambda值為I ;當組內變異與總變異相比小時,Wilks' Lambda值接近于O。因此，Wilks' Lambda值大,表示各個組的均值基本相等！Wilks' Lambda小表示組間有差異[28],利用F檢驗分析差異的顯著性水平(P <0.05)。由表I分析結果可知，第2天時，對照組與處理組間響應值間差異顯著，不同病原菌處理組間響應值也有顯著差異。表I處理后2d不同病害草莓的傳感器響應值方差分析
權利要求
1 . 一種水果采后病害的快速無損檢測方法，是利用氣味傳感器檢測水果感染不同病原微生物后散發(fā)的氣味來確定水果是否感染病害及感染病害的種類，其特征在于它的檢測步驟如下， 1)將水果樣品表面去雜、洗凈，用75%酒精浸泡30s，待酒精揮發(fā)完全后進行接種處理，所有樣品分為兩組，一組用于氣味傳感器獲取水果氣味信息，另一組用于氣相質譜聯(lián)用儀器測定水果氣味的化學組成和相對含量，其中，水果樣品分別接種該類水果采后易感染的病源微生物，模擬水果采后病原微生物感染，接種每一類病原微生物的水果樣品和代表未感染病害水果樣品數(shù)量均為50-80個； 2)將水果樣品進行貯藏，間隔相同時間采用氣味傳感器和氣相質譜聯(lián)用儀器測試水果的氣味，其中氣味傳感器測試時，將水果樣品置于密閉容器中，當頂空氣體達到飽和時，通過氣味傳感器獲取氣味響應信號，并進行分析處理，同時，利用氣相質譜聯(lián)用儀器分析檢測氣味的化學組成和相對含量； 3)氣體傳感器和氣相質譜聯(lián)用儀檢測結束后，計算腐爛指數(shù)，腐爛指數(shù)大于0，則表明水果已經(jīng)感染病原微生物，其中，按果實腐爛面積大小將果實劃分為3級0級，無腐爛；1級，果面有I 3個黃褐色病斑，且病變組織面積不超過果實總表面積的25%;2級，果實表面出現(xiàn)菌絲，或病變組織面積達到果實總表面積的25%以上，按下式計算腐爛指數(shù)腐爛指數(shù)=Σ [(腐爛級別X該級果實數(shù))/(最高腐爛級別X總果實數(shù))]Χ100% ； 4)分析氣相質譜聯(lián)用儀器的數(shù)據(jù)，根據(jù)氣體成分的組成和含量的差異程度，確定水果氣味差異最大的貯藏時間，同時對獲取的氣味傳感器響應數(shù)據(jù)分別按照貯藏時間和感染病原微生物種類進行主成分分析，綜合氣相質譜聯(lián)用儀器信息和氣味傳感器信息，根據(jù)同時實現(xiàn)盡早判斷水果感染病害和易于區(qū)分感染病原微生物種類的原則，確定較佳的測試時間，結合傳感器響應值的方差顯著性分析結果確定較佳的氣味傳感器組合； 5)在選定的傳感器組合基礎上，建立如下基于馬氏距離的Fisher線性判別分析模型， Io — b0+a10 X Sfa20 X S2+a30 X S3+...+an0 X SnYi = Va11 X S^a21 X S2+a31 X S3+…+anl X Sn 12 — b2+a22 X Sfa22 X S2+a22 X S3+…+an2 X SnYk = bk+alkX S^a2kX S2+aaX S3+...+ankX Sn(I) 上式中，S是氣味傳感器的響應值，是根據(jù)傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后的電阻量G與傳感器在經(jīng)過標準活性碳過濾氣體的電阻量Gtl的比值GAV下標為傳感器對應編號，取值為1、2、3......n ;b和a分別為判別式的常數(shù)項和自變量系數(shù)，y的下標代表感染病原微生物的類型，其中O代表沒有感染病原微生物； 6)將未知水果樣品放入封閉容器，采用氣味傳感器獲取響應值，代入式⑴中，比較所有y值，y值最大的組其下標代表該水果感染的病原微生物類型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水果采后病害快速無損檢測方法，屬于農產品采后質量控制領域。該技術將選定的金屬氧化物氣味傳感器獲取水果采后的氣味響應信號，代入構建的判別模型中，可以得到水果是否感染病原微生物以及感染的種類信息。本方法能夠快速和非破壞檢測水果采后是否感染病害以及病害的類型，操作簡單，快速準確，減少人工檢測的費用，降低水果采后貯藏的損失，可以用于水果采后的流通、貯藏和銷售過程中的檢測和監(jiān)測。
文檔編號G01N27/12GK102944585SQ201210520700
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權日2012年12月7日
發(fā)明者潘磊慶, 屠康, 朱娜, 張偉 申請人:南京農業(yè)大學