專利名稱：用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于高效凝膠排阻色譜(HPSEC)測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，以及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素是哺乳動物體內(nèi)存在的一種糖胺聚糖，由己糖醛酸和葡萄糖胺通過1，4_糖苷鍵連接形成，其相對分子量主要分布在300010000之間，是一種混合物。自1937年起，肝素就被作為抗凝劑應(yīng)用于臨床治療。大量研究表明，肝素的多種生理活性及其體內(nèi)過程都有分子量依賴性。首先，肝素的抗凝活性具有分子量依賴性。肝素分子內(nèi)存在的一種五糖結(jié)構(gòu)能特異性地催化AT III與 凝血因子FXa的結(jié)合，從而抑制FXa的活性。而AT III對凝血因子FIIa的抑制，除上述五糖結(jié)構(gòu)外，還需要至少13個(gè)單糖殘基，即需要至少含18個(gè)單糖殘基的肝素分子。因此，分子量較大的肝素的抗凝活性優(yōu)于分子量較小的肝素，但同時(shí)前者引發(fā)出血的風(fēng)險(xiǎn)也高于后者。正是基于這一機(jī)制，低分子肝素被開發(fā)并應(yīng)用于臨床，其安全性得到顯著提高。第二，肝素的體內(nèi)清除機(jī)制也與其分子量密切相關(guān)。肝素進(jìn)入血液后，可與多種血漿蛋白和血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，進(jìn)而通過巨噬細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，這一清除機(jī)制與肝素的分子量及劑量有關(guān)，一般來說，高分子量的肝素更容易被清除。因此，肝素的分子量和分子量分布也是影響其代謝的重要因素。第三，肝素在臨床應(yīng)用過程中可能會引發(fā)
的重要副反應(yīng)-血小板減少癥(heparin-1nduced thrombocytopenia, HIT)也與肝素的
分子量有關(guān)。肝素在人體內(nèi)與血小板因子4 (platelet factor4, PF4)形成復(fù)合物,會引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生肝素依賴性抗體，進(jìn)而導(dǎo)致血小板活化，引起強(qiáng)烈的血小板聚集，最終造成血小板減少和血栓形成。有研究證明，未分級肝素的免疫原性遠(yuǎn)大于低分子肝素。第四，肝素被硫酸魚精蛋白中和的能力也具有分子量依賴性。在使用肝素過程中若發(fā)生出血，則需采用硫酸魚精蛋白進(jìn)行中和。隨著肝素分子量減小，魚精蛋白的中和能力也隨之下降。綜上所述，肝素的分子量和分子量分布是其重要的質(zhì)控指標(biāo)，有必要進(jìn)行常規(guī)的監(jiān)控?，F(xiàn)行的美國藥典、英國藥典、歐洲藥典及中國藥典主要對肝素的鑒別、效價(jià)、相關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、重金屬含量等項(xiàng)目做出了規(guī)定，而對于肝素的分子量及分子量分布未作出規(guī)定，亦未給出檢測方法。因此，制定肝素的分子量和分子量分布質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，探索肝素分子量及分子量分布的測定方法對于提高肝素的質(zhì)量水平具有重要意義。目前用于測定肝素類分子相對分子量及分子量分布的方法主要有以下幾種高效分子排阻色譜法(HPSEC )、多角度激光光散射儀法(SEC-MALLS )、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、質(zhì)譜法及核磁共振法。其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳法耗時(shí)較長，操作繁瑣，且小分子量的組分往往因難以著色而被忽略，因此測定結(jié)果偏大；質(zhì)譜法由于離子化過程中容易導(dǎo)致硫酸根的中性化，因此難以得到準(zhǔn)確的分子量信息；核磁共振法同樣存在準(zhǔn)確度差的問題；多角度激光光散射儀法無需分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，檢測快速準(zhǔn)確，但是儀器較為昂貴；高效分子排阻色譜法經(jīng)濟(jì)快速，重現(xiàn)性也較好，且能同時(shí)測出分子量分布信息，但是需要肝素相對分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，且該標(biāo)準(zhǔn)品的分子量范圍必須涵蓋供試品中各組分的分子量。目前已上市的可用于肝素分子量測定的是heparin polysaccharide1-VI,其分子量分別為5000Da、7000Da、9000Da、12000Da、15000Da和20000Da。但其分子量范圍無法覆蓋所有的肝素分子，因此測定結(jié)果并不準(zhǔn)確。也有文獻(xiàn)報(bào)道以普魯蘭作為標(biāo)準(zhǔn)品測定肝素的相對分子量，但是由于普露蘭的結(jié)構(gòu)與肝素存在本質(zhì)的區(qū)別，因此測定的相對分子量并不準(zhǔn)確。綜上所述，制備可用于肝素相對分子量及分子量分布測定的標(biāo)準(zhǔn)品至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提出了一種寬分布的肝素相對分子量校正對照品，包括其制備、相對分子量和分子量分布測定方法。本發(fā)明具有較高的實(shí)用價(jià)值，相關(guān)方法嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)，具有良好的推廣應(yīng)用前景。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，由肝素鈉及其分子量寬分布標(biāo)樣表構(gòu)成，肝素鈉為固體形式，其經(jīng)HPSEC-MALLS測定的分子量范圍是3000 40000。所述對照品的平均分子量在15000 20000。 上述對照品的制備方法如下(I)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝素的分子量范圍一般在3000 30000，據(jù)此，選擇若干批注射級肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000的肝素樣品作為對照品。(2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對照品寬分布標(biāo)樣表，即肝素分子量與其色譜峰累積面積百分比的對應(yīng)表。本發(fā)明的對照品，可以用于測定肝素供試品的相對分子量及分子量分布，以對肝素及其鹽進(jìn)行質(zhì)量控制。一種測定肝素供試品的相對分子量及分子量分布的方法，步驟如下(I)選擇若干批注射級肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000、平均分子量在15000 20000的肝素樣品作為對照品；(2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對照品寬分布標(biāo)樣表，即肝素分子量與其色譜峰累積面積百分比的對應(yīng)表;(3)對肝素供試品進(jìn)行HPSEC測定，并計(jì)算相對分子量及分子量分布，以進(jìn)行質(zhì)量控制①HPSEC分析分別對上述對照品及肝素供試品進(jìn)行HPSEC分析，得色譜圖；②分子量校正曲線的制備根據(jù)步驟(2)制作的對照品的寬分布標(biāo)樣表，從HPSEC測定的肝素對照品的色譜圖依次讀出相應(yīng)特征色譜峰累積峰面積百分比所對應(yīng)的保留時(shí)間，并以這一系列保留時(shí)間對其在寬分布標(biāo)樣表中對應(yīng)分子量的對數(shù)值進(jìn)行常規(guī)3次曲線方程擬合(EmpOWer2.0自動擬合)，得到校正曲線；
③利用上述得到的校正曲線，將供試品的保留時(shí)間代入該校正曲線，對供試品的色譜圖中的肝素色譜峰進(jìn)行積分，即可獲得供試品的相對分子量和分子量分布；質(zhì)量是否合格的判斷根據(jù)測定的結(jié)果，判斷肝素供試品的質(zhì)量是否符合要求。所述步驟(I)中，HPSEC-MALLS的色譜條件如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，其特征在于由肝素鈉及其分子量寬分布標(biāo)樣表構(gòu)成，肝素鈉為固體形式，其經(jīng)HPSEC-MALLS測定的分子量范圍是 3000 40000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，其特征在于所述對照品的平均分子量在15000 20000。
3.權(quán)利要求1或2所述的用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品的制備方法，其特征在于步驟如下 (1)選擇若干批注射級肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000的肝素樣品作為對照品； (2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對照品寬分布標(biāo)樣表。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，HPSEC-MALLS的色譜條件如表I所示 表I
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，肝素對照品寬分布標(biāo)樣表的具體制作方法為根據(jù)步驟(I)選定的肝素對照品的分子量范圍，從MALLS測定的最小分子量開始，到分子量累積百分比為99%的分子量為止，根據(jù)分子量分布累積百分比取5 20個(gè)點(diǎn)，分別讀出其對應(yīng)的分子量，建立起肝素分子量-累積面積百分比的對應(yīng)表，即肝素對照品寬分布標(biāo)樣表。
6.權(quán)利要求1或2所述的用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品在測定肝素供試品的相對分子量及分子量分布中的應(yīng)用。
7.一種測定肝素供試品的相對分子量及分子量分布的方法，其特征在于步驟如下 (1)選擇若干批注射級肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000、平均分子量在15000 20000的肝素樣品作為對照品； (2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對照品寬分布標(biāo)樣表，即肝素分子量與其色譜峰累積面積百分比的對應(yīng)表；(3)對肝素供試品進(jìn)行HPSEC測定，并計(jì)算相對分子量及分子量分布，以進(jìn)行質(zhì)量控制 ①HPSEC分析分別對上述對照品及肝素供試品進(jìn)行HPSEC分析，得色譜圖； ②分子量校正曲線的制備根據(jù)步驟(2)制作的對照品的寬分布標(biāo)樣表，從HPSEC測定的肝素對照品的色譜圖依次讀出相應(yīng)特征色譜峰累積峰面積百分比所對應(yīng)的保留時(shí)間，并以這一系列保留時(shí)間對其在寬分布標(biāo)樣表中對應(yīng)分子量的對數(shù)值進(jìn)行3次曲線方程擬合，得到校正曲線； ③利用上述得到的校正曲線，將供試品的保留時(shí)間代入該校正曲線，對供試品的色譜圖中的肝素色譜峰進(jìn)行積分，即可獲得供試品的相對分子量和分子量分布。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測定方法，其特征在于所述步驟(I)中，HPSEC-MALLS的色譜條件如表I所示 表I
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測定方法，其特征在于所述步驟(2)中，肝素對照品寬分布標(biāo)樣表的具體制作方法為根據(jù)步驟(I)選定的肝素對照品的分子量范圍，從MALLS測定的最小分子量開始，到分子量累積百分比為99%的分子量為止，根據(jù)分子量分布累積百分比取5 20個(gè)點(diǎn)，分別讀出其對應(yīng)的分子量，建立起肝素分子量-累積面積百分比的對應(yīng)表，即肝素對照品寬分布標(biāo)樣表。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測定方法，其特征在于所述步驟(3)①中，HPSEC分析的色譜條件如表2所示 表全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，由肝素鈉及其分子量寬分布標(biāo)樣表構(gòu)成，肝素鈉為固體形式，其經(jīng)HPSEC-MALLS測定的分子量范圍是3000～40000。本發(fā)明還公開了一種測定肝素供試品的相對分子量及分子量分布的方法，步驟如下(1)選擇分子量在3000～40000的肝素樣品作為對照品；(2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作；(3)對肝素供試品進(jìn)行HPSEC測定，并計(jì)算相對分子量及分子量分布，以進(jìn)行質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的對照品及利用該對照品測定肝素供試品的相對分子量及分子量分布的方法，為國內(nèi)外首次，其具有較高的實(shí)用價(jià)值，方法嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)，測定方法簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確、精確，具有良好的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號G01N30/02GK103018364SQ20121052527
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者崔慧斐, 趙娜, 曹吉超 申請人:山東大學(xué)