專利名稱：一種細(xì)胞核dna染色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細(xì)胞、組織染色技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種適用于DNA定量細(xì)胞學(xué)的細(xì)胞核DNA染色方法。
背景技術(shù)：
DNA定量細(xì)胞學(xué)主要通過對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA進(jìn)行染色，然后運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞核DNA含量進(jìn)行測(cè)定，從而判斷細(xì)胞的生理狀態(tài)和病理改變，它與流式細(xì)胞術(shù)一樣，已廣泛運(yùn)用于科研和臨床工作中，目前已成為國(guó)際上較先進(jìn)的一種癌癥和癌前病變的檢查技術(shù)。
目前，用于DNA定量細(xì)胞學(xué)的DNA染色方法主要是傳統(tǒng)改良Feulgen法以及快速Feulgen法。傳統(tǒng)改良的Feulgen法首先對(duì)標(biāo)本中的細(xì)胞進(jìn)行固定,然后用鹽酸對(duì)其進(jìn)行水解，使細(xì)胞核DNA雙鏈中的戊糖和嘌呤之間的糖苷鍵斷開，戊糖端形成的醛基可以和SchiffJ s試劑(或Thionin染液)發(fā)生特異性的結(jié)合并產(chǎn)成紫紅色(或深藍(lán)色)。通過對(duì)該顏色強(qiáng)度的定量檢測(cè)和細(xì)胞定量分析可用于判斷該細(xì)胞是否發(fā)生癌變。因此，在染色過程中，對(duì)固定、酸解和染色的條件控制非常關(guān)鍵。在傳統(tǒng)改良Feulgen法中，染色全過程均在室溫環(huán)境下進(jìn)行，染液配制在26 ±2°C恒溫箱中，整個(gè)染色全過程需要耗時(shí)接近4個(gè)小時(shí)。而在后來凌玉琴、龔志錦、夏潮涌等報(bào)道過的一些快速Feulgen法中，雖然固定和染色的總時(shí)間控制在了 2小時(shí)以內(nèi)，但酸解和染色的溫度都要求在50 70°C，鹽酸水解過于劇烈，鹽酸和染液揮發(fā)速度很快，試劑只能使用一次，且結(jié)果很不穩(wěn)定，對(duì)操作人員的時(shí)間控制和溫度穩(wěn)定性的要求極高，鹽酸的高揮發(fā)和腐蝕性還會(huì)對(duì)人、設(shè)備(包括自動(dòng)化設(shè)備)、環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，因而這些方法都無法在臨床廣泛推廣，也很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、穩(wěn)定且極易推廣的DNA染色技術(shù)，可從根本上解決傳統(tǒng)改良Feulgen染色方法時(shí)間過長(zhǎng)以及快速Feulgen染法染色結(jié)果不穩(wěn)定，及對(duì)設(shè)備和環(huán)境要求高的缺點(diǎn)，而且還可以和自動(dòng)染色機(jī)聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)染色的高度自動(dòng)化。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種細(xì)胞核DNA染色方法，其特征在于包括如下步驟
步驟I固定將標(biāo)本片依次放入溫度為30°C 40°C的BS固定液中固定20 30min，漂洗；
步驟2水解固定好的標(biāo)本片，在溫度為30°C 40°C的4-6N鹽酸中水解20 30min，漂洗；
步驟3染色水解好后，在30°C 40°C的Thionin染液或Schiff試劑中染色30 40min,漂洗；
步驟4封片染色完后，采用快遞梯度乙醇脫水、封片。
進(jìn)一步，上述的漂洗方法為先用自來水漂洗I 2min,隨后再用蒸懼水漂洗5min。進(jìn)一步，所述的固定、漂洗、染色步驟都在恒溫箱或自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行。進(jìn)一步，Thionin染液或Schiff試劑的配制過程需要在30°C 40°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至30°C 40°C。進(jìn)一步，所述的4-6N鹽酸可反復(fù)使用3-5次,Thionin染液或Schiff試劑可反復(fù)使用2-3次。(注本發(fā)明方法采用的為5N鹽酸，其保護(hù)范圍很小，如果其他濃度也可以達(dá)到相同的結(jié)果，最好提供一個(gè)范圍，另外固定液或染色液的品種請(qǐng)確認(rèn)是否可以提供其他種類的固定液或染色液。)
采用上述方案后，本發(fā)明與傳統(tǒng)細(xì)胞核DNA染色方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn) 1)本發(fā)明采用在30V 40 V條件下進(jìn)行固定、酸解和染色，能同時(shí)減少固定、酸解和染色的時(shí)間，其中，固定時(shí)間比傳統(tǒng)改良Feu I gen染色減少了 20分鐘以上，酸解時(shí)間和染色時(shí)間均減少了 35分鐘以上，整體處理時(shí)間減少了一半以上，由接近4個(gè)小時(shí)減少為不到2小時(shí)；
2)本發(fā)明方法采用在30°C 40°C恒溫箱或自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行固定、酸解和染色，染色方法操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞核染色效果穩(wěn)定，標(biāo)本片背景干凈，完全滿足DNA定量細(xì)胞學(xué)的細(xì)胞DNA倍體分析的要求；克服了文獻(xiàn)報(bào)道過的快速Feulgen法溫度過高(50 70°C)，染色效果極不穩(wěn)定，一致性和可重復(fù)性較差，以及鹽酸劇烈揮發(fā)對(duì)設(shè)備、環(huán)境條件以及人員帶來的危害。此外，如果使用自動(dòng)染色機(jī)，整個(gè)過程可全部由機(jī)器完成，染色的可重復(fù)性和結(jié)果的一致性更高；
3)本發(fā)明所使用的Thionin染液可反復(fù)使用2_3次,克服了傳統(tǒng)改良Feulgen法以及快速Feulgen法中Thionin染液只能用一次的缺點(diǎn)，大大節(jié)省了昂貴進(jìn)口試劑的成本以及配制染液的人力。綜上所述，與其它Feulgen染色方法相比，本發(fā)明的技術(shù)方案在實(shí)用性、穩(wěn)定性、效率、節(jié)省費(fèi)用、可重復(fù)性以及和自動(dòng)化設(shè)備的兼容性等方面均具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可滿足臨床DNA定量細(xì)胞學(xué)快速診斷的要求。


圖1、4、6分別為實(shí)施例1、4、6中豬肝細(xì)胞涂片經(jīng)本發(fā)明所述方法染色后的顯微鏡下(20X)細(xì)胞核圖像。圖2、3、5分別為實(shí)施例2、3、5中宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片經(jīng)本發(fā)明所述方法染色后的顯微鏡下(20 X )細(xì)胞核圖像。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例I
將豬肝細(xì)胞涂片依次放入BS固定液中固定25min，5N鹽酸中水解20min，Thionin染液30min，每步之間均用自來水漂洗2min，隨后再用蒸餾水漂洗5min，快速梯度乙醇脫水，封片。BS固定液、5N鹽酸和Thionin染液均需先預(yù)置于35°C恒溫箱，Thionin染液的配制過程也在35°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至35°C，BS固定過程、鹽酸水解過程以及染色過程均在35°C恒溫箱中進(jìn)行。染色后的豬肝涂片在顯微鏡下(20X )細(xì)胞核圖像如圖I所示。實(shí)施例2:
將宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片依次放入BS固定液中固定30min，5N鹽酸中水解20min，Thionin染液30min，每步之間均用自來水漂洗2min，隨后再用蒸餾水漂洗5min，快速梯度乙醇脫水，封片。BS固定液、5N鹽酸和Thionin染液均需先預(yù)置于40°C恒溫箱，Thionin染液的配制過程也在40°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至40°C，BS固定過程、鹽酸水解過程以及染色過程均在40°C恒溫箱中進(jìn)行。染色后的宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片在顯微鏡下(20 X )細(xì)胞核圖像如圖2所示。實(shí)施例3
將宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片依次放入BS固定液中固定30min，5N鹽酸中水解25min， Thionin染液40min，每步之間均用自來水漂洗2min，隨后再用蒸餾水漂洗5min，快速梯度乙醇脫水，封片。BS固定液、5N鹽酸和Thionin染液均需先預(yù)置于35°C自動(dòng)染色機(jī)，Thionin染液的配制過程也在35°C自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至35°C，BS固定過程、鹽酸水解過程以及染色過程均在35°C自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行。染色后的宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片在顯微鏡下(20X )細(xì)胞核圖像如圖3所示。實(shí)施例4
將豬肝細(xì)胞涂片依次放入BS固定液中固定25min，5N鹽酸中水解30min，Schiff試劑染色40min，每步之間均用自來水漂洗2min，隨后再用蒸餾水漂洗5min，快速梯度乙醇脫水，封片。BS固定液、5N鹽酸和Schiff試劑均需先預(yù)置于30°C恒溫箱，Schiff試劑的配制過程也在30°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至30°C，BS固定過程、鹽酸水解過程以及染色過程均在30°C恒溫箱中進(jìn)行。染色后的豬肝細(xì)胞涂片在顯微鏡下(20X )細(xì)胞核圖像如圖4所示。實(shí)施例5
將宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片依次放入BS固定液中固定25min，4N鹽酸中水解30min，Thionin染液35min，每步之間均用自來水漂洗2min，隨后再用蒸餾水漂洗5min，快速梯度乙醇脫水，封片。BS固定液、4N鹽酸和Thionin染液均需先預(yù)置于40°C恒溫箱，Thionin染液的配制過程也在40°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至40°C，BS固定過程、鹽酸水解過程以及染色過程均在40°C恒溫箱中進(jìn)行。染色后的宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本片在顯微鏡下(20 X )細(xì)胞核圖像如圖5所示。實(shí)施例6
將豬肝細(xì)胞涂片依次放入BS固定液中固定25min，6N鹽酸中水解20min，Schiff試劑染色40min，每步之間均用自來水漂洗2min，隨后再用蒸餾水漂洗5min，快速梯度乙醇脫水，封片。BS固定液、6N鹽酸和Schiff試劑均需先預(yù)置于35°C恒溫箱，Schiff試劑的配制過程也在35°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至35°C，BS固定過程、鹽酸水解過程以及染色過程均在35°C恒溫箱中進(jìn)行。染色后的豬肝細(xì)胞涂片在顯微鏡下(20X )細(xì)胞核圖像如圖6所示。盡管結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案具體展示和介紹了本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白，在不脫離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)本發(fā) 明做出各種變化，均為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞核DNA染色方法，其特征在于包括如下步驟 步驟I固定將標(biāo)本片依次放入溫度為30°C 40°C的BS固定液中固定20 30min，漂洗； 步驟2水解固定好的標(biāo)本片，在溫度為30°C 40°C的4-6N鹽酸中水解20 30min，漂洗； 步驟3染色水解好后，在30°C 40°C的Thionin染液或Schiff試劑中染色30 40min,漂洗； 步驟4封片染色完后，采用快遞梯度乙醇脫水、封片。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞核DNA染色方法，其特征在于所述的漂洗的方法為先用自來水漂洗I 2min,隨后再用蒸懼水漂洗5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞核DNA染色方法，其特征在于所述的固定、漂洗、染色步驟在恒溫箱或自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞核DNA染色方法,其特征在于Thionin染液或SchifT試劑的配制過程需要在30°C 40°C恒溫箱中進(jìn)行，其配制用水需要提前預(yù)熱至30°C 40°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞核DNA染色方法，其特征在于所述的4-6N鹽酸反復(fù)使用3-5次，Thionin染液或Schiff試劑反復(fù)使用2_3次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞核DNA染色方法，其特征在于包括如下步驟步驟1固定將標(biāo)本片依次放入溫度為30℃～40℃的BS固定液中固定20～30min，漂洗；步驟2水解固定好的標(biāo)本片，在溫度為30℃～40℃的5N鹽酸中水解20～30min，漂洗；步驟3染色水解好后，在30℃～40℃的Thionin染液中染色30～40min，漂洗；步驟4封片染色完后，采用快遞梯度乙醇脫水、封片。綜上所述，與其它Feulgen染色方法相比，本發(fā)明的技術(shù)方案在實(shí)用性、穩(wěn)定性、效率、節(jié)省費(fèi)用、可重復(fù)性以及和自動(dòng)化設(shè)備的兼容性等方面均具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可滿足臨床DNA定量細(xì)胞學(xué)快速診斷的要求。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102967499SQ201210537800
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者唐劍, 黃榮祥 申請(qǐng)人:麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司