專利名稱：一種人胱抑素c化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種準(zhǔn)確、靈敏、快速、定量檢測(cè)人血清、血漿和尿液樣本中胱抑素C(CYS-C)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
胱抑素C是一種非糖化的蛋白質(zhì)，是半胱氨酸蛋白酶抑制劑的一種，由122個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為13kDa。它由大多數(shù)有核細(xì)胞以一種恒定的方式產(chǎn)生，由腎小球?yàn)V過，在近曲小管完全沖吸收并分解。其分子量小，生成率穩(wěn)定，由于其在血清中的濃度與腎 小球?yàn)V過率(GFR)有密切的關(guān)系，并且對(duì)腎小球?yàn)V過率比肌酐更為敏感，因此胱抑素C對(duì)測(cè)定腎小球?yàn)V過率有極其重要的意義。胱抑素C完全由近曲小管重吸收，正常情況下不出現(xiàn)在尿液中。如果近曲小管重吸收功能有損害，尿液中胱抑素C濃度會(huì)出現(xiàn)明顯升高。血清和血漿胱抑素C參考值范圍，正常男性(O. 63-1. 25) μ g/ml，正常女性(0· 54-1. 15) μ g/ml，大于50歲正常人(O. 6-1.55) μ g/ml。正常人尿液參考值范圍0. 25-0. 317 μ g/ml。目前檢測(cè)胱抑素C的方法主要有膠乳增強(qiáng)免疫比濁法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等。乳膠增強(qiáng)免疫比濁法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)特異性好、操作簡(jiǎn)單、精密度高、檢測(cè)范圍寬，缺點(diǎn)是靈敏度較低。酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法(申請(qǐng)?zhí)?201010245894. 2)靈敏度很高，但是操作復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)范圍窄，樣本需要預(yù)稀釋處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法。該方法準(zhǔn)確性好、精密度高、靈敏度高，樣本無需預(yù)稀釋，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，檢測(cè)范圍寬。本發(fā)明制備的人胱抑素C (CYS-C)定量測(cè)定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)的試劑組成和試劑主要成分包括試劑I (Rl):含熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CYS-C抗體的溶液；試劑2 (R2):含堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的抗人CYS-C抗體的溶液；磁分離試劑含包被著抗FITC抗體的磁微粒的懸濁液。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下磁分離試劑的制備用碳二亞胺(EDC)作偶聯(lián)劑，將抗FITC抗體共價(jià)連接在含羧基(C00H)的磁微粒的表面，然后用緩沖液稀釋到工作濃度，完成磁分離試劑的制備。試劑I的制備將抗人CYS-C抗體與FITC按摩爾比1:20-1:200在O. 1-0. 2mol/LpH=9. 0-10. O的碳酸鹽緩沖液內(nèi)混合，室溫反應(yīng)超過12h。用G-25凝膠柱將抗人CYS-C抗體-FITC連接物與游離FITC分離，獲得偶聯(lián)有FITC分子的抗人CYS-C抗體濃溶液，然后將該溶液用緩沖液稀釋到工作濃度，完成試劑I的制備。試劑2的制備將抗人CYS-C抗體與ALP用SMCC、2IT作為交聯(lián)劑進(jìn)行連接?？谷薈YS-C抗體與ALP摩爾比為1:1-1: 2。交聯(lián)后用凝膠層析的方法純化，獲得連接ALP的抗人CYS-C抗體濃溶液，將該溶液用緩沖液稀釋到工作濃度完成試劑2的制備。


圖1.血清樣本檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :抗FITC抗體與磁微粒偶聯(lián)，制備磁分離試劑。材料與儀器1.磁微粒含羧基(COOH)活性基團(tuán)，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩爾(mmol),具有超順磁性,直徑在O. 5-2 μ m之間。2.抗FITC抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，純度應(yīng)超過90%，稀釋效價(jià)應(yīng)超過1:100萬。 3. 2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、TRIS和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。操作步驟1.取IOOmg磁微粒,磁分離去上清,用O. 05mol/L, pH=4. 5-5. O的MES緩沖液IOml
重懸；2.加入2-4mg的抗FITC抗體，室溫混懸30_60min ；3.加入O. 5-lml，新鮮配制的10mg/ml的EDC水溶液，室溫混懸2_12h ；4.磁分離，去上清，用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH=8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/ml,完成磁分離試劑的制備。實(shí)施例2 FITC與抗CYS-C抗體連接制備試劑I材料與儀器1.抗人CYS-C單克隆抗體，由北京利德曼生化股份有限公司制備，純度超過95%，濃度超過lmg/ml，以磷酸鹽緩沖液保存；2.異硫氰酸熒光素(FITC)，碳酸鈉等試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；3. G-25凝膠純化柱采購自GE公司。操作步驟1.用 O. 1-0. 2 mol/L pH=9. 0-10. O 的碳酸鹽緩沖液配制 O. 5mg/ml 的 FITC 溶液；2.按照抗人CYS-C抗體與FITC摩爾比為1:20-1:200的比例在抗人CYS-C抗體溶液中加入FITC溶液，混合均勻，室溫靜置超過12h ；3.用G-25凝膠柱將抗人CYS-C抗體-FITC連接物與游離FITC分離，獲得偶聯(lián)有FITC分子的抗人CYS-C抗體濃溶液，將該溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) pH=8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到0. 5-1 μ g/ml，完成試劑I的制備。實(shí)施例3 ALP與抗人CYS-C抗體連接制備試劑2材料與儀器1.抗人CYS-C單克隆抗體，由北京利德曼生化股份有限公司制備，純度超過95%，濃度超過5mg/ml,以磷酸鹽緩沖液保存；2.堿性磷酸酶純度應(yīng)超過95%，比活性應(yīng)超過1000 U/mg，濃度超過5mg/ml ；3.偶聯(lián)劑SMCC，2-1T購自THERMO公司，TRIS等化學(xué)試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；4. AKTA-purifier蛋白純化儀和Supperdex200凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。
操作步驟1.取Img抗人CYS-C抗體，加入10mg/ml的偶聯(lián)劑2-1T溶液2-4 μ 1，室溫靜置20min,加入O. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ 1，室溫靜置5min。用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的抗體，2-8 °C保存?zhèn)溆茫?.取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液10-20 μ 1，室溫靜置30min,用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗體，2-8°C保存?zhèn)溆茫?.將上述活化的抗人CYS-C抗體與活化的ALP混合，2_8°C條件下靜置12_24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化偶聯(lián)物，獲得抗人CYS-C抗體-ALP連接物濃溶液，2_8°C保存?zhèn)溆谩?.將抗人CYS-C抗體-ALP連接物濃溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH=8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到O. 5-1 μ g/ml，完成試劑2的制備。 實(shí)施例3 :檢測(cè)的實(shí)施和檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)材料與儀器1.胱抑素C試劑1，胱抑素C試劑2和磁分離試劑，由上述實(shí)施例1、2、3制備。2.胱抑素C校準(zhǔn)品、胱抑素C質(zhì)控品、發(fā)光底物、清洗液、胱抑素C測(cè)定試劑盒(免疫比濁法)由北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)。3. CIlOOO全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀由北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)。4. AU400生化分析儀由奧林巴斯生產(chǎn)。檢測(cè)實(shí)施下述檢測(cè)步驟由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀自動(dòng)完成，也可手工操作完成。1.檢測(cè)管內(nèi)依次加入5 μ I樣本、100 μ I試劑1、100 μ I試劑2、50μ I磁分離試劑，混合均勻，37 ± O. 5 °C條件下反應(yīng)5min ；2.使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入600 μ I的清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸。重復(fù)此操作，共操作3次。3.將磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入100 μ I的發(fā)光底物，去除磁場(chǎng)，充分混懸后檢測(cè)I秒內(nèi)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值(RLU)。靈敏度評(píng)價(jià)檢測(cè)“O”濃度樣本，重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并計(jì)算M+2SD值，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD值帶入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為最低檢測(cè)限。本方法靈敏度彡O. 01 μ g/ml。線性評(píng)價(jià)將(8. 0±1. O) μ g/ml的樣本2倍稀釋為9個(gè)濃度水平。將每一濃度的樣本重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果平均值，將結(jié)果平均值和稀釋比例進(jìn)行直線擬合，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r。本方法在O. 05-8 μ g/ml檢測(cè)范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r彡O. 9990。精密度評(píng)價(jià)用(1. 0±0· 2) μ g/ml和(3· 0±0· 6) μ g/ml的樣本各重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算10次測(cè)量結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式CV=SD/MX 100%計(jì)算變異系數(shù)CV。本方法CV ( 5%。
準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)在I例混合血清樣本和I例混合尿液樣本中添加不同量人CYS-C國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，形成3個(gè)濃度水平的血清或尿液添加樣本，添加物體積小于總體積的10%。檢測(cè)樣本濃度，按下述公式計(jì)算回收率。本方法尿液和血清基質(zhì)回收率在90-115%之間。數(shù)據(jù)參見表1.
權(quán)利要求
1.一種人胱抑素C的化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法，其特征在于其是一種基于磁微粒分離技術(shù)和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)的雙抗體夾心一步反應(yīng)法免疫檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包含了免疫反應(yīng)、洗滌和加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的步驟，使用的試劑盒主要由試劑1、試劑2和磁分離試劑組成，其中試劑I為含熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人胱抑素C抗體的緩沖液，試劑2為含堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的抗人胱抑素C抗體的緩沖液，磁分離試劑為含包被有抗FITC抗體的磁微粒的緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)步驟包含1)免疫反應(yīng)將待測(cè)樣本原液與試劑1、試劑2和磁分離試劑混勻，溫育；2)洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩，磁分離，再去除上清，此步驟重復(fù)2-3次；3)加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度在檢測(cè)管中加入堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物，震蕩，檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)步驟包含1)免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入2-10μ I待測(cè)樣本原液，然后加入100-200 μ I試劑1，100-200 μ I試劑2，20-100 μ I磁分離試劑，混勻，37± 1°C條件下溫育2_15min ；2)洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入300-1000μ I的清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；此步驟重復(fù)2-3次；3)加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度在檢測(cè)管中加入100-300μ I堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物，震蕩使磁微粒充分混懸，檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于主要由試劑1、試劑2和磁分離試劑組成，其中試劑I為含熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人胱抑素C抗體的緩沖液，試劑2為含堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的抗人胱抑素C抗體的緩沖液，磁分離試劑為含包被有抗FITC抗體的磁微粒的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，磁分離試劑由下述方法制備用碳二亞胺(EDC)作偶聯(lián)劑，將抗FITC抗體共價(jià)連接在含羧基的磁微粒的表面，然后用緩沖液稀釋到工作濃度；試劑I由下述方法制備將抗人CYS-C抗體與FITC混合，室溫反應(yīng)，將抗人CYS-C抗體-FITC連接物與游離FITC分離，稀釋分離得到的溶液；試劑2由下述方法制備將抗人CYS-C抗體與ALP進(jìn)行交聯(lián)，純化，將獲得的連接ALP的抗人CYS-C抗體濃溶液稀釋。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，磁分離試劑由下述方法制備用碳二亞胺(EDC)作偶聯(lián)劑，將抗FITC抗體共價(jià)連接在含羧基的磁微粒的表面，然后用緩沖液稀釋到工作濃度；試劑I由下述方法制備將抗人CYS-C抗體與FITC按摩爾比1:20-1:200在O. 1-0. 2mol/L pH=9. 0-10. O的碳酸鹽緩沖液內(nèi)混合，室溫反應(yīng)超過12h，用G-25凝膠柱將抗人CYS-C抗體-FITC連接物與游離FITC分離，獲得偶聯(lián)有FITC分子的抗人CYS-C抗體濃溶液，然后將該溶液用緩沖液稀釋到工作濃度；試劑2由下述方法制備將抗人CYS-C抗體與ALP用SMCC、2IT作為交聯(lián)劑進(jìn)行連接，抗人CYS-C抗體與ALP摩爾比為1:1_1: 2，交聯(lián)后用凝膠層析的方法純化，獲得連接ALP的抗人CYS-C抗體濃溶液，將該溶液用緩沖液稀釋到工作濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人胱抑素C的定量檢測(cè)方法。該方法將磁微粒分離技術(shù)和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，采用雙抗體夾心一步反應(yīng)法原理，可用于血清、血漿和尿液樣本中人胱抑素C的含量測(cè)定，輔助各種腎功能損害疾病的診斷和治療。該方法靈敏度≤0.01μg/L，定量檢測(cè)范圍0.05-8μg/L,分析內(nèi)精密度＜5%，檢測(cè)用時(shí)10min，血清和尿液添加回收率在90-115%之間，與膠乳增強(qiáng)免疫比濁法試劑血清測(cè)值相關(guān)分析R2=0.9862。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103018465SQ20121054571
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月16日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:北京利德曼生化股份有限公司