專利名稱：抗h9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病毒與動物傳染病學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體在在制備H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的應(yīng)用及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
1975年，Kohler G和Milstein C在Nature雜志上發(fā)表了細胞融合法建立雜交瘤技術(shù)，創(chuàng)建了具有劃時代意義的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)。經(jīng)克隆后產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和各種特性完全相同的高純度抗體，稱為單克隆抗體(Monoclonal Antibody, McAb),簡稱單抗。單克隆抗體技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和使用，對現(xiàn)代生命科學研究的發(fā)展起到了巨大的推動作用，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的一個重要方面。迄今，該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、治療、預(yù)防等方面。禽流感(Avianinfluenza, Al)是由 A 型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的病毒性烈性傳染病，是目前危害世界及我國養(yǎng)禽業(yè)最重要的疫病之一。H9亞型禽流感病毒最早由Hommee and Easterday (1970)從火雞體內(nèi)分離到。1994年，陳伯倫等(陳伯倫等，1994)從病蛋雞體內(nèi)分離到H9亞型AIV。此后，H9亞型AIV在我國廣泛存在，多呈低致病性感染，并呈逐漸蔓延之勢。至1997年，H9亞型AIV廣泛分布于各大洲。韓國、愛爾蘭、意大利等國都有H9禽流感暴發(fā)的報道，說明其已在家禽中建立了穩(wěn)定的種系。1998年從香港的家豬體內(nèi)分離到2株H9亞型流感病毒，這是首次從哺乳動物體內(nèi)分離到H9亞型流感病毒。1999從香港患流感的女孩體內(nèi)分離到兩株H9流感病毒，對這兩株病毒的分析表明其所有的基因片段與AIV — A / Quail / Hong Kong / Gl / 97 (H9)高度同源，是典型的禽源 流感病毒，該毒株是香港人感染H5N1和H9亞型密切相關(guān)的分支代表株。2000-2001年，對中國南方地區(qū)的水禽(主要是家鴨)進行流感病毒監(jiān)測發(fā)現(xiàn)約10%水禽被H9感染，感染率是20世紀70年代的4倍。同樣對這些H9毒株的基因片段進行克隆和測序分析，結(jié)果證明，對于HA和NA基因片段大多數(shù)與DK/ Y280/ 97亞群毒株關(guān)系密切從而證明這些毒株HA和NA基因片段的陸禽起源。而其6個內(nèi)部基因片段遺傳演化上則證實來自水禽并且這6個內(nèi)部基因片段與2001年香港暴發(fā)的H5N1病毒內(nèi)部基因片段關(guān)系緊密。據(jù)報道，A/ Quail/ Hong Kong / Gl/ 97株很可能參與了 H9亞型之間的基因重排從而產(chǎn)生了可感染人類的新型毒株。在豬體內(nèi)也曾分離出了類人型的和類禽亞型的毒株，二者很有可能在豬體內(nèi)發(fā)生基因重排，從而產(chǎn)生更加適應(yīng)人源和禽源的毒株從而能突破種間屏障感染人。盡管還沒有充分的證據(jù)表明H9亞型流感病毒能在人與人之間傳播但其已經(jīng)成為目前嚴重危害人類健康的重要傳染病之一。藏雞是世界上獨一無二的寶貴遺傳資源，近年來，隨著西藏農(nóng)牧業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，藏雞場集約化程度不斷提高，藏雞養(yǎng)殖已經(jīng)成為西藏地區(qū)農(nóng)牧民增收致富的重要途徑之一。但由于缺乏全面、系統(tǒng)的雞病防治技術(shù)，致使雞的各種傳染性疾病發(fā)病率很高，尤其是全球流感暴發(fā)和流行，給藏雞養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失，嚴重挫傷了農(nóng)牧民養(yǎng)殖的積極性。西藏地處我國西南邊疆，邊境線漫長，與多個國家接壤，處在鳥類遷徙路線上，是我國野生鳥類重要聚集地之一，其中有的國家的野鳥中已經(jīng)檢測到AIV，這對西藏地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的威脅。因此，對藏雞、鴨等禽類進行H9亞型AIV分子流行病學調(diào)查及生物特性研究為AIV的預(yù)測預(yù)警提供理論依據(jù)是非常必要的。1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚丙乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,簡稱ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為固相免疫吸附載體，使ELISA方法得以推廣應(yīng)用，使得用于抗原定位的酶標記抗體技術(shù)發(fā)展成為液體標本中微量物質(zhì)的測定方法，并逐漸成為抗原抗體檢測中最為常用的一種方法。它將酶標記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，既保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性，因而極大的提高了靈敏度。同時它又是一種非均相免疫分析方法，即在反應(yīng)的每一步都有洗滌過程，從而除去了未反應(yīng)物和干擾物質(zhì)。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測迅速、非放射性以及可以批量測定等諸多優(yōu)點，使得ELISA方法得到了越來越廣泛的應(yīng)用。(焦奎等.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M].北京化學工業(yè)出版社，2004，84 141 ;李文敏.酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的技術(shù)進展及應(yīng)用[J].湖北職業(yè)技術(shù)學院學報，2003，4 (6) : 65 69)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個目的是提供抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含所述的單克隆抗體的H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的第四個目的是提供一種H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的申請人:所在的華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室動物病原分離室從雞群中分離得到的H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009，并制備了一種特異性強的單克隆抗體，它是抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白(HA)的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株4D10，已于2012年11月8日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO :C2012152。申請人:利用所述的單克隆抗體制備成雙抗體夾心ELISA核心試劑，建立了一種H9亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA檢測方法，并且組裝了一種用于快速檢測H9亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA試劑盒。本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的辣根過氧化物酶標記的由雜交瘤細胞株4D10所分泌的單克隆抗體作為酶標抗體；用保藏號為CCTCCNO C2012152的雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體包被酶標板，以及樣品處理液、洗滌液、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液，陽性對照樣品和陰性對照樣品組成。更詳細的技術(shù)方案如下所述?？笻9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體的制備，它包括下列步驟
I)以從西藏病雞中分離得到的H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009毒株為抗原，經(jīng)過擴增和純化，對5-8周齡BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)進行免疫。2)細胞融合，取經(jīng)加強免疫后的BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)的脾臟，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛(wèi)生部武漢生物制品所)融合。3)利用血凝抑制法(HI)(肖金暉等.RT-PCR法與血凝抑制法鑒定流感病毒的比較[J].中國熱帶醫(yī)學，2005,5:401 402)，篩選出分泌抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白(HA)的抗體的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(但漢并等.H5亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及鑒定[J].動物醫(yī)學進展，2006，27 (8):67 69)進行克隆、篩選。經(jīng)過3 5次克隆純化，最終篩選出分泌抗H9亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4D10 (保藏編號為CCTCC N0:C2012152)。4)腹水的制備，取5-6周齡雌性BABL/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐劑O. 5ml/只，5天后腹腔注射IX IO6個雜交瘤細胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制(HI)法檢測腹水效價，-70 V保存。5)將單克隆抗體進行純化和標記。上述抗體經(jīng)過純化和標記后可用于制備檢測H9亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA試劑盒。一種H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括辣根過氧化物酶標記的由雜交瘤細胞株4D10所分泌的單克隆抗體作為酶標抗體；用雜交瘤細胞株4D10所分泌的單克隆抗體包被酶標板，以及底物顯色A液、底物顯色B液、終止液、10倍洗滌液、樣品處理液A和樣品處理液B，所述雜交瘤細胞株4D10保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: C2012152，其中底物顯色A液0· 06%H202緩沖液；底物顯色B液取Na2HP0412H20 14. 2g，檸檬酸10. 5g，用ddH20定容至500ml，配成
O.1mol · L磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH5. 0，按終濃度為20mg/L添加聯(lián)苯二胺；終止液40%氫氟酸625 μ L，用ddH20定容至IOOmL ；10 倍洗滌液NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO412H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 lOOOmL，pH7. 4 ；樣品處理液A :取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml，調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121 °C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后分裝，置4°C貯存，用于處理內(nèi)臟組織；樣品處理液B :取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml,調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121 °C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混勻后分裝，置4°C貯存，用于處理喉頭拭子。本發(fā)明進一步提供了一種H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法，包括以下步驟 (I)用H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009作為免疫原；(2)用步驟(I)的免疫原制備保藏號為CCTCC NO: C2012152的雜交瘤細胞株4D10 ；
(3)用步驟(2)的雜交瘤細胞株4D10制備單克隆抗體；(4)用辣根過氧化物酶標記步驟(3)得到的單克隆抗體，作為酶標抗體；(5)將待檢測樣品用樣品處理液A或B進行處理得到待檢測物；(6)對步驟(5)所述的待檢測物進行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測，其中樣品處理液A 的配制取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20800ml，調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121 °C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后分裝，置4°C貯存，用于處理內(nèi)臟組織；樣品處理液B 的配制取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20800ml,調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121 °C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混勻后分裝，置4°C貯存，用于處理喉頭拭子。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明的試劑盒和檢測方法能直接對H9亞型流感病毒進行檢測，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短，檢測樣品范圍寬(雞胚尿囊液、內(nèi)臟組織勻漿液)的特點。2、本發(fā)明的試劑盒和檢測方法適用于對H9亞型流感病毒進行檢測，而對其它亞型的流感病毒，如經(jīng)典Hl亞型、H3亞型、H5亞型的流感病毒則不反應(yīng)，具有很好的特異性。

3、本發(fā)明將所需的 各種試劑組裝成試劑盒，操作簡單易行，不需由專業(yè)人員操作。本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定性好、保存期長，在4°C條件下放置半年不會影響其敏感性。4、本發(fā)明一次能同時處理多個樣本，非常適合H9亞型禽流感病毒的臨床大規(guī)模檢測。并能夠滿足試驗要求，也可作為科研使用。5、目前市場上還沒有檢測H9亞型禽流感病毒抗原的試劑盒。酶標記抗體技術(shù)是ELISA檢測方法的關(guān)鍵技術(shù)，本發(fā)明中所用的酶標記抗體是本實驗室自行生產(chǎn)研制的抗H9亞型流感病毒血凝素單克隆抗體，經(jīng)過辣根過氧化物酶(簡稱HRP)標記，具有很高的酶活性，產(chǎn)量高及成本低。


圖1 :是本發(fā)明總體技術(shù)路線圖。圖2 :是SP2/0細胞染色體計數(shù)。圖3 :4D10細胞染色體計數(shù)。圖4 :抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白(HA)單克隆抗體間接免疫熒光檢測圖。其中圖4A為抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白(HA)單克隆抗體間接免疫熒光檢測圖；圖4B為陰性對照。
具體實施例方式實施例1 H9亞型流感病毒的制備一、H9亞型流感病毒的分離1、分離過程用滅菌的咽拭子采集病雞樣，置于滅菌磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS，配方=Na2CO31. 59g, NaHCO3 2. 93g,用ddH20定容至1000ml)中，隨后將咽拭子樣本液O. 2ml接種9日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司)，置35°C下孵育72h，收獲尿囊液做血凝定性試驗，血凝試驗為陽性的樣本，再經(jīng)過RT-PCR試驗定型。2、鑒定依據(jù)=RT-PCR檢測為陽性的樣本，擴增HA，送上海生工生物工程有限公司測序，對所得DNA序列與網(wǎng)上公布的序列(http://blast. ncb1. nlm. nih. gov/ )進行比對，以確定病毒亞型。3、H9亞型流感病毒株的病毒學特征經(jīng)過HA-DNA序列比對，得出與藏雞HA-NA核酸的同源性為99 %，氨基酸同源達99%，因此確定了我們獲得的流感病毒為H9亞型流感病毒。二、H9亞型流感病毒的擴增、滅活及純化1、將 H9 亞型流感病毒 A/Chicken / Tibet / Sl/2009 進行擴增；(I)嚴格篩選9 10日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司)

每批雞胚經(jīng)過嚴格篩選。外檢共4項白殼、大小、破損及臟胚，內(nèi)檢共9項去除沙殼、偏氣室、游氣室、倒置胚、無精蛋、終止胚、弱胚、污染胚、裂縫胚。(2)接種病毒(A/Chicken / Tibet / Sl/2009)于雞胚尿囊腔選用9 10日齡SPF雞胚，畫出氣室和胚位，在氣室接近胚位處涂抹碘酊和酒精進行消毒，用鋼錐穿一小孔，隨后將Iml注射器針頭沿此小孔插入(避開血管)，接種H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009。最后用石蠟封口，并置35°C下孵育72h。每天檢查雞胚生長情況，每12h翻卵并檢卵一次。24h內(nèi)死亡的雞胚，認為是非特異死亡并棄去，72h收取雞胚，4°C下放置過夜。(3)含H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009尿囊液的收獲用75%濃度的酒精消毒雞胚氣室端，用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，在絨毛尿囊膜無大血管處穿破。用無菌移液管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。將雞胚收獲液3000r/min離心5min去除血液和細胞。然后進行紅細胞凝集實驗，確定雞胚尿囊液血凝效價。2、H9 亞型流感病毒 A/Chicken / Tibet / Sl/2009 的滅活將含病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009尿囊液凍融3次后，按終濃度O. 8%的甲醛緩慢加入甲醛溶液，充分混合均勻，37°C滅活24小時，每隔6小時振搖I次。每個病毒滅活容器應(yīng)立即取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗。滅活容器的H9亞型流感病毒的尿囊液經(jīng)檢定合格。8000r/min,離心lOmin。棄去沉淀,上清備用。3、H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009濃縮及純化(I)將H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009進行濃縮，方法是將H9亞型流感病毒雞胚尿囊液于27000r/min，離心2h，棄去上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，充分混勻備用。(2) H9 亞型流感病毒 A/Chicken / Tibet / Sl/2009 純化在超速離心管中依次加入609^45^^30^^20%濃度蔗糖溶液形成密度梯度。將重懸好的病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009樣品平鋪于最上層，于32000r/min，離心lh。離心后取出45 %、30 %之間層面樣品，用PBS重懸45%、30%之間層面樣品取出樣品，32000r/min,離心lh,取沉淀(即得所述的病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009)進行蛋白質(zhì)含量測定。以此作為免疫原。實施例2抗H9亞型流感血凝素蛋白單克隆抗體的制備1、以純化并滅活的H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009原毒株為抗原，加弗氏佐劑乳化(首免選用弗氏完全佐劑，二、三免選用弗氏不完全佐劑)免疫5-8周齡BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)。首免劑量為20 μ g/只，每只小鼠頸背部皮下多點注射。二周后用相同劑量加強免疫一次，二周后再加強免疫一次，劑量為40 μ g/只，二周后斷尾采集少量小鼠血，收集血清，用血凝抑制法檢測小鼠抗體效價。待小鼠抗體達到試驗要求，再經(jīng)腹腔注射滅活及純化的H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009，注射劑量為40 μ g/只免疫一次。三天后，即可取免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛(wèi)生部武漢生物制品所)按實驗室常規(guī)方法進行融合。2、細胞融合，取經(jīng)過加強免疫的BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%濃度酒精中浸泡IOmin消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛(wèi)生部武漢生物制品所)按I X IO7個SP2/0與IO8個免疫細胞(個數(shù)比1:10)的比例于50ml離心管中混勻，1500r/min，離心lOmin。棄去上清，管壁用滅菌的濾紙吸干，輕震管底，使細胞沉淀略有松動。將裝有細胞混合物的離心管放置于37°C恒溫水浴中。然后在Imin內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37°C的50%聚乙二醇(PEG) O. 8ml (購自sigma公司),邊加邊輕輕用吸管尖攪拌,繼續(xù)攪拌lmin。然后慢慢加入預(yù)溫至37°C的1640 (購自sigma公司)細胞培養(yǎng)液40ml。融合具體步驟如下第一分鐘逐滴滴入50%聚乙二醇(PEG)O. 8 ml，靜置O. 5min ;第二分鐘加1640細胞培養(yǎng)液lml，靜置O. 5min (重復(fù)一次)；第四分鐘加1. 5ml，靜置O. 5min (重復(fù)一次)；第六分鐘加5ml，靜置O. 5min (重復(fù)一次);第八分鐘加10ml，靜置O. 5min (重復(fù)一次);每次加時需緩慢加入，并不斷輕輕地攪拌。靜置lmin, 1000r/min離心IOmin,棄上清，于37°C環(huán)境中放置8min。用HAT培養(yǎng)基(購自Sigma公司)懸浮，同時也用HAT培養(yǎng)基懸浮制備好的飼養(yǎng)脾細胞并與融合后的細胞混合，根據(jù)需要補加適量的HAT培養(yǎng)基，分種于96孔培養(yǎng)板中，約200 μ I/孔。一次融合可接種4 8塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細胞數(shù)計算，每孔接種量約含IO4左右個SP2/0細胞。于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后第二天開始觀察96孔板內(nèi)細胞有無污染，于第4天用HT培養(yǎng)基換HAT培養(yǎng)基IOOyl0待融合細胞集落長至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基略變黃時，進行抗體效價檢測。采用滅活H9亞型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009作為篩選抗原，利用血凝抑制法(肖金暉等.RT-PCR法與血凝抑制法鑒定流感病毒的比較[J].中國熱帶醫(yī)學，2005，5:401 402)篩選出分泌抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白(HA)抗體的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(但漢并等.H5亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及鑒定[J].動物醫(yī)學進展，2006，27 (8):67 69)進行克隆、篩選。經(jīng)過3 5次克隆純化，最終篩選出分泌抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白(HA)的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4D10，于2012年11月8日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為 CCTCC NO C2012152o 3、腹水的制備，選用5-6周齡雌BABL/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐劑O. 5ml/只，5天后腹腔注射I X IO6個雜交瘤細胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法(HI)檢測腹水效價，-70 V保存。4、腹水抗體的純化辛酸-硫酸銨法具體步驟如下(I)將上述步驟3制備的腹水1000r/min離心10 min,用O. 45Mm濾膜過濾,濾液邊攪拌邊加入用4倍體積60mmol/L醋酸緩沖液(pH=4. 5)；(2)邊攪拌邊逐滴加入正辛酸至終濃度為33μ1/πι1，室溫條件下攪拌30min，8000r/min離心30min,棄沉淀收集上清；(3)將步驟(2)的上清液經(jīng)濾紙過濾一次，濾液pH調(diào)制7. 4 ；(4)向步驟(3)所得的濾液邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液(硫酸銨體積/總體積蘭45%)，待濾液呈白色渾濁液時，繼續(xù)攪拌30min，然后于4°C靜置5h。再于4°C條件12000r/min 下離心 30mi n ；(5)棄上清，沉淀用 IOmmol pH=9. O Tris-HCl 重懸；在 100 倍體積的 IOmmolpH=9. O的Tris-HCl中，于4°C條件下磁力攪拌透析,透析36h,期間3次(12h/次)更換新鮮Tris-HCl液。透析結(jié)束后，取上清，用SDS-PAGE電泳的方法鑒定抗體的純度，用紫外分光光度計測定抗體濃度，分裝、凍存。上述純化抗體試驗中所用試劑按照以下配方配制醋酸緩沖液(60mmol/L)=C2H3NaO2 2. 463g，用 ddH20 定容至 500 ml (ρΗ=4· 5)；飽和硫酸銨溶液每IOOml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加熱至80°C溶解，趁熱濾紙過濾，降至室溫即有結(jié)晶析出，所得帶有結(jié)晶濾液即為飽和硫酸銨溶液。用25%氨水調(diào)pH值至7. 2，備用。5、辣根過氧化物酶(HRP)標記單克隆抗體(I)取辣根過氧化物酶(HRP) 5. O mg溶于5 ml ddH20，溶液呈棕紅色；隨后滴加NaIO4 (60mmol/L) O. 5ml，使溶液呈草綠色，4°C條件放置30min ;滴加乙二醇(160mmol/L)
O.5ml,終止氧化反應(yīng),室溫下避光放置30min,溶液呈棕黃色；(2)取本發(fā)明制備的單克隆抗體5ml (mg /ml)與上述步驟(I)所處理好的液體混合，IOmmol pH=9. 5碳酸鹽緩沖液,4°C條件下磁力攪拌透析過夜。(3)向完成透析液體中加新鮮配制的濃度為5 mg /ml的NaBH4O. 2ml，于4°C下放置2h ;然后等體積加入飽和硫酸銨,于4°C下靜置30min, 7000r/min離心lOmin,棄去上清。PB溶液(20mmol/L pH=7. 4，配制方法如后所述)3ml重懸，在1000倍體積的PB (20mmol/LpH=7. 4)中，4°C條件下磁力攪拌透析，透析36h，期間3次(12h/次)換液。(4)標記抗體完成透析后，加PB (20mmol/L ρΗ=7· 4)、甘油(終濃度30%)定容至5ml，于-20°C保存。標記抗體試驗中所用試劑按以下配方配制NaIO4 (60mmol/L) =NaIO41. 283g，用 ddH20 定容至 IOOml ；乙二醇(160mmol/L):乙二醇13. 4μ1，用 ddH20 稀釋至1. 5ml ；碳酸鹽緩沖液IOmmol pH=9. 5 =Na2CO31. 59g, NaHCO3 2. 93g,用 ddH20 定容至1000ml (pH=9. 5)；NaBH4 (5 mg /ml) =NaBH4O. 05g,用 ddH20 定容至 IOml，現(xiàn)配現(xiàn)用；
飽和硫酸銨溶液 每100ml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加熱至80°C溶解，趁熱濾紙過濾，降至室溫即有結(jié)晶析出，所得帶有結(jié)晶濾液即為飽和硫酸銨溶液。用25%氨水調(diào)pH值至7. 2，備用；PB (20mmol/L pH=7. 4) =Na2HPO412H20 3. 58g, NaH2PO41. 56 g，用 ddH20 定容至1000ml (pH=7. 4)；醋酸緩沖液(60mmol/L)C2H3NA022. 463g，用 ddH20 定容至 500ml (pH=4. 5)。實施例3抗H9亞型流感血凝素蛋白單克隆抗體的鑒定1、HI效價的鑒定采用本發(fā)明分離得到的H9亞型流感病毒作為抗原用血凝抑制法測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水的效價。結(jié)果見表I。表1:利用血凝抑制法(HI)測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水的效價
權(quán)利要求
1.一種抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC NO:C2012152的雜交瘤細胞株4D10所分泌的。
2.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株4D10，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO C2012152。
3.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的應(yīng)用。
4.包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
5.—種H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括辣根過氧化物酶標記的由雜交瘤細胞株4D10所分泌的單克隆抗體作為酶標抗體、用雜交瘤細胞株4D10所分泌的單克隆抗體包被酶標板，以及底物顯色A液、底物顯色B液、終止液、10倍洗滌液、樣品處理液A和樣品處理液B，所述雜交瘤細胞株4D10保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: C2012152，其中 底物顯色A液0. 06%H202緩沖液； 底物顯色B液取Na2HPO4-12H20 14. 2g，檸檬酸10. 5g，用ddH20定容至500ml,配成O.lmol/L磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH5. 0，按終濃度為20mg/L添加聯(lián)苯二胺； 終止液40%氫氟酸625 μ L，用ddH20定容至IOOmL ；10 倍洗滌液NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用 ddH20定容至 IOOOmL, pH7. 4 ；樣品處理液 A :取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml，調(diào) pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121°C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后分裝，置4°C貯存，用于處理內(nèi)臟組織；樣品處理液 B :取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml，調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121°C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混勻后分裝，置4°C貯存，用于處理喉頭拭子。
6.權(quán)利要求4或5所述的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒在H9亞型流感病毒檢測中的應(yīng)用。
7.一種H9亞型流感病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法，包括以下步驟 (1)用H9亞型流感病毒A/Chicken/ Tibet / S1/2009作為免疫原； (2)用步驟(I)的免疫原制備保藏號為CCTCCNO: C2012152的雜交瘤細胞株4D10 ； (3)用步驟(2)的雜交瘤細胞株4D10制備單克隆抗體； (4)用辣根過氧化物酶標記步驟(3)得到的單克隆抗體，作為酶標抗體； (5)將待檢測樣品用樣品處理液A或B進行處理得到待檢測物； (6)對步驟(5)所述的待檢測物進行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測， 其中 樣品處理液 A 的配制取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g，H3BO3 16. 08g，NaCl 8. 5g, ddH20800ml，調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至1000ml，在121 °C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后分裝，置4°C貯存，用于處理內(nèi)臟組織；樣品處理液 B 的配制取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20800ml，調(diào)pH值為8. 4后用蒸餾水定容至IOOOml，在121 °C，高壓蒸汽滅菌30分鐘后加入5gN-乙 酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混勻后分裝，置4°C貯存，用于處理喉頭拭子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC NO: C2012152的雜交瘤細胞株4D10所分泌的。本發(fā)明還公開了一種H9亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明試劑盒以抗H9亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體為二抗，公開了H9亞型流感病毒的分離、擴增、滅活和純化方法及H9亞型流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及純化方法。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法能直接對H9亞型流感病毒進行檢測，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短，檢測樣品范圍寬等特點。
文檔編號G01N33/569GK103059132SQ201210550329
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者周紅波, 金梅林, 陳煥春, 程艷青, 但漢并, 郭學波, 張艷, 黃慧敏, 劉小坤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學