專利名稱：定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，具體涉及一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
魚類的發(fā)育分為仔魚期、稚魚期、幼魚期、未成熟期、成魚期和衰老期，各時期的劃分與魚類性腺的發(fā)育有著直接的關(guān)系，對于雌魚而言，其卵巢中主要的物質(zhì)為卵黃蛋白，卵黃蛋白在魚類整個生命周期中起著重要的作用。首先，卵黃蛋白是受精卵的重要物質(zhì)，為魚類胚胎發(fā)育和仔魚早期生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。其次，在卵黃生成期，卵細細胞從血液中攝取卵黃原蛋白，經(jīng)加工后以卵黃粒和油滴的形式儲存于卵母細胞中，卵黃蛋白的含量直接影響胚胎的存活及仔魚的生長發(fā)育。卵黃原蛋白由雌魚的肝臟產(chǎn)生，隨血液循環(huán)到達卵巢，在組織蛋白酶D的作用下，迅速裂解成三種主要卵黃蛋白卵黃脂磷蛋白、卵黃高磷蛋白和P ’組分，儲存于卵黃粒中，其中以卵黃脂磷蛋白的含量最為豐富。與卵黃原蛋白相似，卵黃脂磷蛋白也是一種典型的糖脂蛋白，并且含有少量的磷，在胚胎的生長和發(fā)育過程中具有多種生物學(xué)功能。在卵母細胞的成熟過程中，卵黃脂磷蛋白進一步裂解，釋放出脂質(zhì)，并產(chǎn)生游離氨基酸，為胚胎與稚魚提供蛋白質(zhì)合成的原料和有氧能量生產(chǎn)的主要底物，并且在特定的發(fā)育時期提供所需的脂質(zhì)。目前已經(jīng)研究了黑線鱈、條斑星鰈、雜交鱘等多種魚類卵黃脂磷蛋白在卵母細胞或胚胎發(fā)育過程中變化，并證實卵黃脂磷蛋白通過降解成游離氨基酸，為早期胚胎和稚魚的發(fā)育提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)；卵黃脂磷蛋白還具備調(diào)節(jié)滲透壓的功能，在卵細胞的發(fā)育過程中，浮性卵因吸收水分，體積顯著增大，發(fā)育成熟時，浮性卵中水分含量達到85 95%，卵細胞體積增大:T5倍，為胚胎的發(fā)育提供備用水。在這一過程中，游離氨基酸含量的增加，為產(chǎn)生水分流入所需要的滲透壓起到重要作用，同時，水含量的增加提供了魚卵漂浮在水體中所需的浮力。Reith等(2001)、Reading等(2009)和Ohkubo等(2006)證實，浮性卵中的游離氨基酸主要來源于卵黃脂磷蛋白的重鏈；此外，卵黃脂磷蛋白還具備免疫學(xué)功能，在大多數(shù)情況下，魚類的受精和發(fā)育要在水環(huán)境中進行，而水中往往含有能夠引起多種疾病的病原體，在發(fā)育初期，胚胎和稚魚無法合成足夠的免疫相關(guān)分子，也未形成淋巴器官。因此，在免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟之前，只能依靠母系物質(zhì)抵擋入侵的病原菌。師曉棟(2003)發(fā)現(xiàn)玫瑰無須鈀的卵黃脂磷蛋白能夠抵制多種病原菌的生長；Zhang J和Zhang SC(2011)研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰無須鈀的卵黃脂磷蛋白與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有很強的結(jié)合能力，并能能夠增強巨噬細胞的吞噬能力，推測卵黃脂磷蛋白既能夠識別入侵的病原菌，又能誘發(fā)巨噬細胞消化病原菌，從而保護胚胎和稚魚免受病害?？梢?，研究魚類的卵黃脂磷蛋白對了解魚類早期發(fā)育狀況具有極大幫助。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報道了多種魚類卵黃脂磷蛋白的純化與鑒定方法，但大多采用其含有糖、磷、脂基團的特性，采用特異性染色或者分析其糖、磷、脂含量來確定其是否為卵黃脂磷蛋白。這種方法是費時、費力，并且非常不經(jīng)濟。
鯉科魚類是鯉形目中分布最廣、種類也最多的一群，全世界共有鯉科魚類210屬，2000種以上，都是淡水魚類，在我國各大河流、湖泊中廣泛分布，也是我國自古以來農(nóng)家魚塘中主要的養(yǎng)殖魚種。因此，開發(fā)鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的檢測試劑盒具有廣泛的應(yīng)用前景和科學(xué)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足?！N定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒，包括一個盒體，該盒體內(nèi)裝有1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0. 06%(m/V)3’ - 二氨基聯(lián)苯胺的IOmM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有4)金魚卵黃脂磷蛋白純品I支；5)鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體I支。上述金魚卵黃脂憐蛋白純品為IOOii g/ml金魚卵黃脂憐蛋白溶液。上述定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒制備方法，包括以下步驟1)制備金魚卵黃脂磷蛋白純品；2)利用步驟I)得到的金魚卵黃脂磷蛋白純品制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體；3)將步驟I)得到的金魚卵黃脂磷蛋白純品I支、步驟2)得到的鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗血清I支、PVDF膜2張，以及封閉液、洗滌液、顯色液和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗I支共同裝入盒體，得到鯉科魚類卵黃脂磷蛋白定性檢測的試劑盒。上述試劑盒在定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白中的應(yīng)用。目前國內(nèi)外鑒定魚類卵黃脂磷蛋白大多采用其含有糖、磷、脂基團的特性，采用特異性染色、氨基酸組成分析或者分析其糖、磷、脂含量來鑒定純化的蛋白是否為卵黃脂磷蛋白，這種方法是費時、費力，并且非常不經(jīng)濟。此外氨基酸組成分析和糖、磷、脂含量測定對儀器的要求較高，操作復(fù)雜。而本發(fā)明的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合能力，能夠靈敏、方便地定性檢測鯉科魚類(包括金魚、鯉魚、鯽魚、斑馬魚等)卵巢或仔魚體內(nèi)的卵黃脂磷蛋白，并且檢出敏感度要明顯高于以上方法。研究魚類的卵黃脂磷蛋白對了解魚類早期發(fā)育狀況具有極大幫助，本發(fā)明能夠為評價魚類的生長和生殖狀況提供重要參考。


圖1為本發(fā)明的金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體對金魚卵黃脂磷蛋白的檢測結(jié)果；圖2為本發(fā)明的金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體對鯉魚卵黃脂磷蛋白的檢測結(jié)果；圖3為本發(fā)明的金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體對鯽魚卵黃脂磷蛋白的檢測結(jié)果；圖4為本發(fā)明的金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體對斑馬魚卵黃脂磷蛋白的檢測結(jié)果。
具體實施例方式一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒，包括一個盒體，該盒體內(nèi)裝有1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0. 06%(m/V) 3’ - 二氨基聯(lián)苯胺的IOmM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有4)金魚卵黃脂磷蛋白純品I支；5)鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體I支。上述金魚卵黃脂磷蛋白純品為IOOii g/ml金魚卵黃脂磷蛋白溶液。上述試劑盒中的4)金魚卵黃脂磷蛋白純品，是以如下方法制備的取卵黃形成后期的雌性金魚卵巢組織，去除結(jié)締組織，收集魚卵，加入3倍體積4°C預(yù)冷的勻漿緩沖液(25mM Tris-HCl,內(nèi)含 70mM NaCl, IOmM EDTA和 ImM PMSF，pH7. 5)混合，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，40C，IOOOOg離心20分鐘，收集上清液；向上清液中緩緩加入(NH4)2SO4粉末至70%的飽和度，鹽析過液；10小時后，在4°C下，以8000g離心10分鐘，棄去上清，將沉淀重新溶解于25mM Tris-HCl (內(nèi)含0. 07M NaCl，pH7. 5)，獲得卵勻漿提取液；取Iml卵勻漿提取液加入S印hacryl S-300層析柱，用含0. 07M NaCl的25mM Tris-HCKpH 7.5)洗脫，收集含有金魚卵黃脂磷蛋白的樣品用于離子交換層析(DEAE-Sepharose FastFlow),用分別含 0. 07M、0. 1M、0. 2M、0. 3M 和1. OM NaCl 的 Tris-HCl緩沖液(25mM, pH 7. 5)進行不連續(xù)洗脫，收集0. 2M脫組分，鑒定為金魚卵黃脂磷蛋白純品，_80°C保存。上述試劑盒中的5)鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體，是以如下方法制備的采用腹腔注射雄性小鼠的方式，每只小鼠注射純化的金魚卵黃脂磷蛋白50y g，注射前將等體積抗原與弗氏完全佐劑充分混勻；此后，在第14、21、28、35、38天分別注射，注射劑量為50 yg，注射前將等體積抗原與弗氏完全佐劑充分混勻；第40天采血，采血前一天停食。采用眼眶取血法取血，獲得抗血清用于制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體；采用硫酸銨沉淀的方法制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體首先將鼠抗血清與陰性對照血漿2:1混合，4°C搖晃過夜，離心去除非特異性的抗體，然后加入(NH4)2SO4粉末至20%的飽和度，4°C搖晃2個小時，離心除去纖維蛋白；加50%的飽和硫酸銨，4°C搖晃2個小時，離心除去白蛋白；加33%的飽和硫酸銨，4°C搖晃2個小時；4°C,8000g離心10分鐘，即獲得鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體，_80°C保存。經(jīng)過以上操作，得到的定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒具體組成如下I) PVDF膜2張；2)金魚卵黃脂磷蛋白純品I支，使用前用PBS稀釋至I U g/ml ；3)鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體I支，使用前用封閉液按1:300的體積比稀釋；4)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗I支，使用前用封閉液按1:500的體積比稀釋；5)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST (IOOmM Tris-HCl、150mMNaCl、0. 05%Tween_20，pH7. 5);封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含0.06%(m/V)3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的IOmM Tris-HCl，使用前向顯色液中加入0. 05%(v/v)雙氧水。本發(fā)明的試劑盒可用于鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的定性檢測。利用本發(fā)明的試劑盒定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的方法，具體包括以下步驟I)將試劑盒中的金魚卵黃脂磷蛋白純品和待測的樣品稀釋后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述的待測的樣品包括從魚類卵巢中純化的蛋白、雌魚卵巢勻漿液或者仔魚的勻漿液；2)把電流凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜；3)用封閉液封閉PVDF膜的非特異性結(jié)合位點，4°C孵育過夜，棄去封閉液；4)加入用封閉液稀釋的鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體(1:300)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次；5)加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1:500)，室溫下震蕩孵育，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次；6)加入顯色液，待蛋白質(zhì)條帶清晰后，棄去顯色液，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)，PVDF膜拍照后于避光處保存；7)在樣品中發(fā)現(xiàn)有顯色條帶，表明純化的蛋白為魚類卵黃脂磷蛋白，顏色的深淺及條帶的寬度代表了樣品中卵黃脂磷蛋白的含量多少；此外，可以利用光密度測定軟件半定量分析各樣品中卵黃脂磷蛋白的含量。如附圖1-4所示，其結(jié)果依次為圖1對金魚卵黃脂磷蛋白的檢測；圖2對鯉魚卵黃脂磷蛋白的檢測；圖3對鯽魚卵黃脂磷蛋白的檢測；圖4對斑馬魚卵黃脂磷蛋白的檢測?？梢钥吹皆赑VDF膜上均出現(xiàn)了明顯的條帶，即本發(fā)明的試劑盒及其檢測方法在定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白方面有很好的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒，包括一個盒體，該盒體內(nèi)裝有1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗I支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各I支，所述的洗滌液為TBST ;封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST ;顯色液為含O. 06%(m/V) 3’ - 二氨基聯(lián)苯胺的IOmM Tris-HCl ;其特征在于該盒體還裝有4)金魚卵黃脂磷蛋白純品I支；5)鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體I支。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的金魚卵黃脂磷蛋白純品為100 μ g/ml金魚卵黃脂磷蛋白溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的鑒定與定性檢測魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒，其特征在于所述的金魚卵黃脂磷蛋白純品的制備方法如下取卵黃形成后期的雌性金魚卵巢組織，去除結(jié)締組織，收集魚卵，加入3倍體積4°C預(yù)冷的勻漿緩沖液混合，在冰浴條件下用玻璃勻漿器勻漿，4°C，IOOOOg離心20分鐘，收集上清液；向上清液中緩緩加入(NH4)2SO4粉末至70%的飽和度，鹽析過液；10小時后，在4°C下，以8000g離心10分鐘，棄去上清，將沉淀重新溶解于25mM Tris-HCl (內(nèi)含O. 07M NaCl，pH7.5)，獲得卵勻漿提取液；取Iml卵勻漿提取液加入S印hacryl S-300層析柱，用含O. 07M NaCl的25mMTris-HCKpH 7.5)洗脫；收集含有金魚卵黃脂磷蛋白的樣品進行離子交換層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分別含 O. 07Μ、0· 1Μ、0· 2Μ、0· 3Μ和1. OM NaCl 的 Tris-HCl緩沖液(25mM，pH 7. 5)進行不連續(xù)洗脫，收集O. 2M脫組分，鑒定為金魚卵黃脂磷蛋白純品。
4.如權(quán)利要求3所述的鑒定與定性檢測魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒，其特征在于所述的鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體的制備方法如下采用腹腔注射雄性小鼠的方式，每只小鼠注射純化的金魚卵黃脂磷蛋白50μ g，注射前將等體積抗原與弗氏完全佐劑充分混勻；此后，在第14、21、28、35、38天分別注射，注射劑量為50μ g，注射前將等體積抗原與弗氏不完全佐劑充分混勻；第40天采血，采血前一天停食；采用眼眶取血法取血，獲得抗血清用于制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體；采用硫酸銨沉淀的方法制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體首先將鼠抗血清與陰性對照血漿2:1混合，4°C搖晃過夜，離心去除非特異性的抗體，然后加入(NH4)2SO4粉末至20%的飽和度，4°C搖晃2個小時，離心除去纖維蛋白；加50%的飽和硫酸銨，4°C搖晃2個小時，離心除去白蛋白；加33%的飽和硫酸銨，4°C搖晃2個小時；4°C,8000g離心10分鐘，即獲得鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1所述的鯉科魚類卵黃脂磷蛋白定性檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒在鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的鑒定中的應(yīng)用。
6.利用權(quán)利要求1所述的試劑盒定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)將試劑盒中的金魚卵黃脂磷蛋白純品和待測的樣品稀釋后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述的待測的樣品包括從魚類卵巢中純化的蛋白、雌魚卵巢勻漿液或者仔魚的勻漿液；2)把電泳凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜；3)用封閉液封閉PVDF膜的非特異性結(jié)合位點，4°C孵育過夜，棄去封閉液；4)加入用封閉液按1:300的體積比稀釋的鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體，室溫下震蕩孵育4小時，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次；5)加入用封閉液按1:500的體積比稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，室溫下震蕩孵育4小時，棄去溶液，用洗滌液洗滌PVDF膜3次；6)加入顯色液，待蛋白質(zhì)條帶清晰后，棄去顯色液，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)，PVDF膜拍照后于避光處保存； 7)在樣品中發(fā)現(xiàn)有顯色條帶，表明純化的蛋白為魚類卵黃脂磷蛋白，顏色的深淺及條帶的寬度代表了樣品中卵黃脂磷蛋白的含量；或者利用光密度測定軟件半定量分析各樣品中卵黃脂磷蛋白的含量。
全文摘要
定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應(yīng)用。其試劑盒含有金魚卵黃脂磷蛋白純品與鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體。其制備方法為首先純化出金魚卵黃脂磷蛋白，通過免疫小鼠制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗血清，進一步純化獲得鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體。本試劑盒可以用于鯉科魚類卵巢和仔魚體內(nèi)卵黃脂磷蛋白的鑒定和定性分析，避免了傳統(tǒng)的糖、磷、脂染色、氨基酸組成分析等復(fù)雜方法，在一定程度上減少了財力、時間和工作量，并在提高工作效率的基礎(chǔ)上，極大得提高了檢測敏感度，最低檢出限約為100ng/ml。
文檔編號G01N33/68GK103033630SQ201210557080
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者汝少國, 王軍, 王蔚, 田華 申請人:中國海洋大學(xué)