專利名稱：腦多頭蚴熱休克蛋白抗原的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以熱休克(HSP)重組蛋白為抗原，建立動物多頭蝴病免疫金標(biāo)滲濾檢測法。
背景技術(shù)：
腦多頭蝴病(Coenuriasis)又叫腦包蟲病，是由帶科的多頭帶絳蟲(Taenia
multiceps)的中絳期幼蟲-腦多頭蝴(Coenurus cerebralis)寄生于綿羊、山羊、黃牛、
牦牛和駱駝等有蹄動物的腦和脊髓 等處引起的一種寄生蟲病，該病是我國草食動物的常見疾病，每年給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，血清學(xué)診斷技術(shù)已應(yīng)用于腦多頭蝴病的診斷，但由于所用的診斷抗原主要是包囊囊液、多頭蝴原頭節(jié)和囊壁等蟲體天然抗原，它們來源十分有限，不能滿足實(shí)際的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種以熱休克(HSP)重組蛋白為抗原，建立動物多頭蝴病免疫金標(biāo)滲濾檢測法，旨在解決血清學(xué)診斷技術(shù)已應(yīng)用于腦多頭蝴病的診斷，但由于所用的診斷抗原主要是包囊囊液、多頭蝴原頭節(jié)和囊壁等蟲體天然抗原，它們來源十分有限，不能滿足實(shí)際的需要的問題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種腦多頭蝴熱休克蛋白抗原的制備方法，該方法從羊腦多頭蝴原頭節(jié)提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)首次擴(kuò)增出HSP基因序列，該基因的開放閱讀框?yàn)?08bp，編碼136個氨基酸。將此基因克隆到pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-HSP，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)后 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，用 SDS-PAGE 和 Western_blot檢測表達(dá)產(chǎn)物；以純化后的表達(dá)蛋白作為抗原，建立檢測羊腦多頭蝴病抗體的重組蛋白膠體金滲濾法(DIGFA)進(jìn)一步，培養(yǎng)基和常用溶液的配制方法為:利用超純水配制溶液，用0.22 μ m的過濾器過濾配制好的IPTG溶液；將超純水800 mL 混合 Yeast Extract5 g, Trypton、10 gNaCllOg,調(diào)節(jié) pH 值至
7.2，定容至I 000 mL，并于121 °C高壓蒸汽滅菌20 min，再置于4°C保存；將瓊脂粉加入液體LB培養(yǎng)基，于121°C的高壓滅菌鍋滅菌20min，最后將瓊脂粉的濃度調(diào)節(jié)為1.5%(w/v);最后在瓊脂糖培養(yǎng)基溫度降低后加入氨芐青霉素并倒板；利用購買的氨芐青霉素和超純水配制成工作液濃度100mg/mL，再用0.22 μ m濾器過濾除菌，于_20°C保存?zhèn)溆?；?7.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液，最后加超純水定容至 I 000 mL ；將Ig瓊脂糖粉末置于90mL超純水，再加入IOmL的5XTBE，定容至IOOmL ；0.8gN, N' 一亞甲叉雙丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于適量超純水中，定容至lOOmL，于4°C避光保存；將18.17gTris置于超純水中溶解，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存；將12.1lg Tris置于超純水中溶解，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為6.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存；將IOgSDS干粉溶于80mL的滅菌超純水中，同過加熱溶解干粉，最后定容至10OmT,；將Ig過硫酸銨溶于水中，定容至IOmL ；1.6 mL 雙蒸水、2 mL30% 丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (pH8.8)1.3 mL、0% 過硫酸銨
0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL ；10%SDS0.01 mL、0.68 mL 雙蒸水、1.0 mol/L Tris(pH6.8)0.13 mL、30% 丙烯酞胺
0.17 mL、10% 過硫酸銨 0.01 mL、TEMED 0.001 mL ；取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超純水,最后定容至IOOOmL ；緩沖液:將0.1%溴酚藍(lán)、25%甘油、14.4mmol/L 2-巰基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl ；將45mL甲醇，45mL水，IOmL冰乙酸，0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250 ；

90mL 甲醇:水(1:1), IOmL 冰乙酸；將Tris堿5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (電泳級)0.37g，甲醇200mL，加去超純水定容至 IOOOmL ；KH2PO40.24g、Na2HPO4.Η202.9g、0.2gKCl、8.8gNaCl、用超純水定容至 lOOOmL，并
置于高壓滅菌鍋滅菌后4°C保存?zhèn)溆?；將NaC18.8g、lMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入 800mL 超純水充分?jǐn)嚢枞芙?，再加Tween-200.5mL混勻，最后加超純水定容至IOOOmL,并用高壓滅菌鍋滅菌后于4°C保存?zhèn)溆?；PBSlOmL, BSA0.lg，現(xiàn)配先用；6.0mgDAB, 10mT.0.0lM PBS, I μ L H2O2 ；NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58 g, KH2PO4 0.27 g 加去離子水溶解并定容至I OOOmL ；在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混勻；含5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液；臨用前配制0.1 mol/L 檸檬酸(2.1 g/100 mL),0.2 mol/L Na2HPO4.12H20 6.1mL, ddH20 12.5 mL，鄰苯二胺 10 mg，溶解后，加入 30%H202 40 μ L ；終止液采用2 mol/L H2SO4。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種利用上述制備方法制備的腦多頭蝴熱休克蛋白抗原建立檢測羊腦多頭蝴病抗體的重組蛋白膠體金滲濾法，其特征在于，該重組蛋白膠體金滲濾法包括以下步驟:腦多頭蝴總RNA的提取，將保存于液氮的腦包蟲原頭蝴抽屜總RNA，利用總RNA抽提試劑盒，并按照其說明書進(jìn)行總RNA抽提；腦多頭蝴HSP基因的RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)測序完成的多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列為:上游引物:5，-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’下游引物:5，-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT-3，對抽提的RNA，將抽提的腦多頭蝴原頭節(jié)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系同F(xiàn)ABP擴(kuò)增。合成cDNA，加入引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；Tm-HSP基因膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，將RT-PCR擴(kuò)增得到的HSP基因通過膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，將其插入入PMD 18-T載體，并且轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，其具體步驟同Tm-FABP ；pET-32a -Tm-HSP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定；pET-32a_HSP重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)與鑒定；將鑒定正確的pET-32a_HSP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，并且通過SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證，通過免疫印記檢測其反應(yīng)源性，具體操作步驟同F(xiàn)ABP的表達(dá)與鑒定；免疫金標(biāo)滲濾法(DIGFA)的建立；DIGFA 與 ELISA 比較檢測。進(jìn)一步，腦多頭蝴HSP基因的RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室測序完成的多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列為:
上游引物:5，-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’下游引物:5’-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT -3’對抽提的RNA，將抽提的腦多頭蝴原頭節(jié)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系同F(xiàn)ABP擴(kuò)增。合成cDNA，加入引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢查結(jié)果。進(jìn)一步，pET-32a -Tm-HSP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定，根據(jù)測序結(jié)果，通過軟件分析擴(kuò)增出的Tm-HSP基因剛好為一個開放閱讀框,用Primer Primer 5.0軟件重新設(shè)計一對引物，并在上、下游引物的5’端設(shè)計了 Bamh I和Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列為:上游引物P1: 5 ’ -CCGGAATTCATGGGTCTCAAAGAAACAG-3，下游引物 P2:5 ’ -CCGCTCGAGTCAGAATAGAGCCATTAACTC-3，以pMD-Tm-HSP質(zhì)粒為模板，用上述弓I物對基因的閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果，并回收目的片段。將pET-32a(+)質(zhì)粒及上述膠回收的PCR產(chǎn)物分別用Bamh I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒作雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。進(jìn)一步，免疫金標(biāo)滲濾法的建立，最佳抗原包被濃度的確定，在垂直流滲濾法檢測盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5yL，為質(zhì)控點(diǎn)A。周圍四點(diǎn)B、C、D、E點(diǎn)加HSP抗原0.5yL，濃度分別為0.5mg/mL、lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL,干燥后用封閉液封閉4°C保存?zhèn)溆?；金?biāo)試驗(yàn)操作流程，將檢測裝置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μ L，待完全滲入后加洗脫液I滴，洗去未結(jié)合抗體；再加驢抗羊IgG膠體金標(biāo)記物I滴，待滲入后加洗脫液兩滴，肉眼判定結(jié)果；金標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果判定，檢測NC膜中央A點(diǎn)顯色紅色表示檢測有效，周圍四個熱休克抗原包被點(diǎn)顯色為陽性。結(jié)果表示為“ + ”，“++”，“+++”，僅留下白色或粉紅底色為無效檢測；靈敏性試驗(yàn):取陽性混合血清倍比稀釋，用DIGFA檢測；DIGFA檢測血清稀釋為1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160 梯度；特異性試驗(yàn):將制備好的診斷膜檢測健康羊血清與羊腦多頭蝴血清，細(xì)粒棘球蝴血清，細(xì)頸囊尾蝴血清以評估其特異性；重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn):將制備好的診斷膜保存于4°C冰箱，每隔一周取出用于腦多頭蝴血清的隨機(jī)檢測。
進(jìn)一步，DIGFA與ELISA比較檢測，ELISA與DIGFA檢測腦多頭蝴患病動物和健康動物血清34份，其中腦多頭蝴陽性血清6份，健康羊血清20份，細(xì)頸囊尾蝴陽性血清5份，細(xì)粒棘球蝴綿羊血清3份；ELISA試驗(yàn)用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，按每孔100 μ L包被酶標(biāo)板，置4°C過夜；用PH7.6的PBST洗滌酶標(biāo)板3次，加待檢血清100 μ L /孔，37°C孵育Ih ；PBST洗滌三次后加HRP-兔抗羊IgGlOO μ L /孔，37°C孵育Ih ;洗滌3次后加TMB底物溶液，100 μ L /孔。反應(yīng)IOmin后用酶標(biāo)儀于450nm波長處測定吸光值。本發(fā)明采用的是抗原為經(jīng)過篩選的HSPs抗原，是原頭節(jié)發(fā)育過程中應(yīng)對宿主特異的生理環(huán)境而產(chǎn)生的應(yīng)激性蛋白。通過Ni柱純化后的HSP具有很高的特異性，并且由于重組蛋白表達(dá)后處于細(xì)胞裂解液上清，并不需要額外的蛋白復(fù)性操作，使HSP蛋白比較完整的保持了天然構(gòu)像，有利于其保持高度的敏感性。但重組蛋白僅有一種成分，而天然抗原中含有多種蛋白成分，故重組抗原敏感性略低于純化后的天然抗原。本實(shí)驗(yàn)中的膠體金作為標(biāo)記物具有操作簡單，省事，無毒，無致癌性物質(zhì)，無需昂貴儀器等特點(diǎn)。故該檢測板便于攜帶，有利于田間檢測，更適宜在交通不便的偏遠(yuǎn)地區(qū)山羊腦多頭蝴病診斷中進(jìn)行推廣應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明提供的重組克隆質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖，M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，4:RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2，3:質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；圖2.是本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖，M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, I, 23:重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；圖3.是本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳及酶切，M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL4500 ；1:重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；2:重組質(zhì)粒；3:重組質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物；圖4是本發(fā)明提供的圖9.Pet32a-Tm-HSP重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定，M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:重組菌PCR產(chǎn)物；2:雙酶切產(chǎn)物；圖5.是本發(fā)明提供的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE ；圖6.是本發(fā)明提供的IPTG濃度對重組質(zhì)粒pET32a-Tm_HSP表達(dá)效果的影響；圖7.是本發(fā)明提供的表達(dá)蛋白在2mmol/L IPTG條件下，誘導(dǎo)不同時間取樣SDS-PAGE電泳檢測，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:誘導(dǎo)Oh; 2:誘導(dǎo)3h; 3:誘導(dǎo)4h; 4:誘導(dǎo)5h;
圖8是本發(fā)明提供的不同誘導(dǎo)溫度對重組質(zhì)粒表達(dá)效果的影響；圖9.是本發(fā)明提供的重組表達(dá)蛋白免疫印跡；圖10.是本發(fā)明提供的DIGFA檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖1至10及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明通過分子生物學(xué)的方法，人工合成了一種可以用于腦多頭蝴病診斷的重組抗原，并評價了該表達(dá)蛋白在腦多頭蝴病診斷中的應(yīng)用價值。1.材料與方法1.1腦多頭蝴樣品腦多頭蝴樣品取自發(fā)病死亡的山羊腦部，采集的包囊置于配置好的加了雙抗的生理鹽水中。用滅菌的眼科剪剪破包囊，讓原頭蝴破囊而于雙抗生理鹽水中，觀察其活性。反復(fù)用雙抗生理鹽水洗滌后，將活性好的原頭蝴置于液氮中保存?zhèn)溆谩?.2血清陽性血清采自四川某種羊場，自然死亡后剖解證實(shí)有包囊存在的患病羊。陰性血清采自從未發(fā)生過腦多頭蝴病的四川某種羊場健康羊。1.3主要試劑限制性內(nèi)切 酶(BamhI,Xho I),DNA Marker DL2000、T4 DNA Ligase、pMD18_T 載體、DNA Marker 10Kb、DNA Marker III和PCR引物等購自大連寶生生物工程有限公司；總RNA提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；dNTP、質(zhì)粒抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、普通瓊脂糖膠DNA回收試劑盒、MasterMixPCR擴(kuò)增試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司； HRP標(biāo)記兔抗羊IgG購自博士德公司；96孔酶標(biāo)板購自costar公司；膠體金滲濾試驗(yàn)中的驢抗羊IgG膠體金試劑、吸水材料、膠體金耗材套裝等購自上海金標(biāo)生物科技公司；硝酸纖維膜購自博士德生物科技公司。1.4菌株及質(zhì)粒載體大腸桿菌BL21 (DE3)、TaKaRa pMD18_T Vector、E.coli DH5 α 克隆菌購自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)載體pET32a(+)購自invitrogen公司。1.5主要儀器設(shè)備賽多利斯的電子天平(BP301S)、Eppendof公司的PCR儀、高速冷凍離心機(jī)(Eppendof 5804R)、Eppendof公司的微量加樣器；美國Bio-rad公司的凝膠成像系統(tǒng)、FORMA公司的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；Bio-rad公司的酶聯(lián)免疫檢測儀(Mode 1680);北京六一儀器廠的垂直電泳槽(DYCZ-24D型)、恒壓橫流電泳儀(DF-C型)、電泳槽(DYY-1II型)；三洋公司購置的-70°C超低溫冰箱；購置于寧波新芝生物科技股份有限公司超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY92-1I DN);購置于蘇凈集團(tuán)安泰有限公司的超凈工作臺(AIR TECH)。1.6培養(yǎng)基和常用溶液的配制
IPTG (24 mg/mL):利用超純水配制溶液，用0.22 μ m的過濾器過濾配制好的IPTG溶液。LB 培養(yǎng)基:將超純水 800 mL 混合 Yeast Extract (0X0ID 公司)5 g,Trypton (0X0ID 公司)、10 gNaCllOg，調(diào)節(jié) pH值至 7.2，定容至 I 000 mL，并于 121°C高壓蒸汽滅菌20 min，再置于4°C保存。LB瓊脂平板:將瓊脂粉加入液體LB培養(yǎng)基，于121°C的高壓滅菌鍋滅菌20min，最后將瓊脂粉的濃度調(diào)節(jié)為1.5%(w/v)。最后在瓊脂糖培養(yǎng)基溫度降低后加入氨芐青霉素(100 g/mL)并倒板。氨芐青霉素(Amp):利用購買的氨芐青霉素和超純水配制成工作液濃度IOOmg/mL,再用0.22 μ m濾器過濾除菌,于_20°C保存?zhèn)溆?。電泳緩沖液5XTBE:將 27.5 g、硼酸 54g Tris,置于 20 mL 0.5 mol/LEDTA (pH8.0)溶液，最后加超純水定容至I 000 mL。10g/L瓊脂糖凝膠: 將Ig瓊脂糖粉末置于90mL超純水，再加入IOmL的5 X TBE,定容至lOOmL。30%丙烯酰胺母液:0.8gN, N’ 一亞甲叉雙丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于適量超純水中，定容至IOOmL,于4°C避光保存。1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8):將18.17gTris置于超純水中溶解，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH為8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存。lmol/L Tris-HCl (pH6.8):將12.1lg Tris置于超純水中溶解，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH為6.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存。10% SDS:將IOgSDS干粉溶于80mL的滅菌超純水中，同過加熱溶解干粉，最后定容至 10OmT, η10%過硫酸銨:將Ig過硫酸銨溶于水中，定容至10mL。12%SDS聚丙烯酰胺(分離膠)5 mL:1.6 mL雙蒸水、2 mL30%丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 mL、0% 過硫酸銨 0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL。5% SDS 聚丙烯酰胺(濃縮膠)1 mL:10%SDS0.01 mL、0.68 mL 雙蒸水、1.0 mol/LTris(pH6.8)0.13 mL、30% 丙烯酞胺 0.17 mL、10% 過硫酸銨 0.01 mL、TEMED 0.001 mL。Tris-甘氨酸電泳緩沖液(ρΗ8.3):取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超純水，最后定容至1000mL。5XSDS凝膠加樣緩沖液:將0.1%溴酚藍(lán)、25%甘油、14.4mmol/L 2-巰基乙醇、2%SDS 混合于 60mmol/LTris-HCl (ρΗ6.8)考馬斯亮藍(lán)染色液:將45mL甲醇，45mL水，IOmL冰乙酸，0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250。SDS-PAGE 脫色液:90mL 甲醇:水(1:1 )，IOmL 冰乙酸。轉(zhuǎn)膜緩沖液:將Tris堿5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (電泳級)0.37g，甲醇200mL，加去超純水定容至1000mL。0.01mol/L PBS =KH2PO40.24g,Na2HPO4.Η202.9g、0.2gKCl、8.8gNaCl、用超純水定容至lOOOmL，并置于高壓滅菌鍋滅菌后4°C保存?zhèn)溆?。TBST (清洗液):將 NaC18.8g、lMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入 800mL 超純水充分?jǐn)嚢枞芙?，再加Tween-200.5mL混勻,最后加超純水定容至IOOOmL,并用高壓滅菌鍋滅菌后于4°C保存?zhèn)溆谩/oBSA 包被液:PBSlOmL，BSA0.1g,現(xiàn)配先用。顯色液:6.0mgDAB, IOmL0.0lM PBS, I μ L H2O200.01 mol/L ρΗ7.4 PBS (抗原稀釋液):NaCl 8 g，KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58g，KH2PO4 0.27 g加去離子水溶解并定容至I OOOmL。
0.01 mol/L ρΗ7.4 PBST (洗滌液):在上述 PBS 中按 0.05% 加入 Tween-20，混勻。封閉液:含5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液。鄰苯二胺溶液(底物):臨用前配制0.1 mol/L檸檬酸(2.1 g/100 mL)，0.2 mol/LNa2HPO4.12H20 (7.163 g/1OOmL) 6.1 mL, ddH20 12.5 mL，鄰苯二胺 10 mg，溶解后，加入30%H202 40 μ L。終止液(2mol/L H2SO4)。1.7主要生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和計算機(jī)軟件BLASTx (http://www.ncb1.nlm.gov/BLAST) BLAST 檢測；NCBI (GenBank)數(shù)據(jù)庫:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLASTn ;2試驗(yàn)方法2.1腦多頭蝴總RNA的提取將保存于液氮的腦包蟲原頭蝴抽提總RNA，利用上海舜華生物科技公司的總RNA抽提試劑盒，并按照其說明書進(jìn)行總RNA抽提。其中其具體步驟為:(I)預(yù)先配置RD溶液，將TCL和Phenol等體積于滅菌空瓶中混合置于4°C保存。(2)于液氮中取出保存的原頭蝴，并用0.01%的DEPC水反復(fù)沖洗，置于0.01%的DEPC水處理過后的研缽中，加入ImLRD后進(jìn)行充分研磨。研磨結(jié)束后將勻漿吸至1.5mL無RNase的離心管中，最后用注射器抽打10次裂解物。(3)高速震蕩裂解物2min，再于室溫靜置5min后，通過顛倒離心管的方式充分混勻，再靜置2 5min,接著利用高速離心機(jī)12000r/min離心5min,去除沉淀后,將水相移至1.5mL離心管中。(4)接著加入相當(dāng)于提取水相一半體積的W3，顛倒混勻兩種溶液，接著移入平衡好的吸附柱，利用高速離心機(jī)9000r/min離心30sec，再將吸附柱裝入剛才的收集管中。(5)接著在收集管中加入500 μ LRP液,利用高速離心機(jī)9000r/min離心30sec后，再將吸附柱移入下一個干凈的收集管中。(6)在新的收集管中加入500μ LW3液，并于室溫下靜置lmin，接著通過高速離心機(jī)9000r/min離心15sec，倒掉收集管中離心廢液，再將吸附柱裝入同一個收集管。(7)接著往收集管中加入500 μ Lff3液,通過高速離心機(jī)9000r/min離心15sec,倒掉收集管中的廢液，最后將吸附柱裝入同一個收集管中。(8)高速離心機(jī)離心lmin。(9)將離心后的吸附柱放入另外一個無菌的1.5mL離心管中，接著在吸附柱吸附膜中央加入50 μ L純水，靜置lmin，再高速離心lmin，即為得到總RNA，再將總RNA放入液氮。2.2腦多頭蝴HSP基因的RT-PCR擴(kuò)增根據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室測序完成的多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列為:上游引物:5’ -CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3 ’下游引物:5，-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT-3，對抽提的RNA，將抽提的腦多頭蝴原頭節(jié)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系同F(xiàn)ABP擴(kuò)增。合成cDNA，加入引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C退火30s，72。。延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢查結(jié)果。2.3 Tm-HSP基因膠回收、連接、轉(zhuǎn)化將RT-PCR擴(kuò)增得到的HSP基因通過膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，將其插入入pMD 18_T載體，并且轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，其具體步驟同Tm-FABP。2.4 pET-32a -Tm-HSP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定根據(jù)測序結(jié)果，通過軟件分析擴(kuò)增出的Tm-HSP基因剛好為一個開放閱讀框，用Primer Primer 5.0軟件重新設(shè)ii^一對引物,并在上、下游引物的5’端設(shè)計了 Bamh I和XhoI酶切位點(diǎn)。以pMD-Tm-HSP質(zhì)粒為模板，用上述弓I物對基因的閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果，并回收目的片段。將pET-32a(+)質(zhì)粒及上述膠回收的PCR產(chǎn)物分別用Bamh I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒作雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

2.5 pET-32a_HSP重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)與鑒定將鑒定正確的pET-32a_HSP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，并且通過SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證，通過免疫印記檢測其反應(yīng)源性，具體操作步驟同F(xiàn)ABP的表達(dá)與鑒定。2.6免疫金標(biāo)滲濾法(DIGFA)的建立最佳抗原包被濃度的確定在垂直流滲濾法檢測盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5 μ L，為質(zhì)控點(diǎn)Α。周圍四點(diǎn)B、C、D、E點(diǎn)加HSP抗原0.5 μ L，濃度分別為0.5mg/mL、lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL,干燥后用封閉液(ph7.4,0.0lmolPBS, 1%BSA,0.05%Tween_20)封閉4 °C保存?zhèn)溆?。金?biāo)試驗(yàn)操作流程將檢測裝置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μ L，待完全滲入后加洗脫液(ph7.4,0.0lmolPBS, 0.05%Tween-20) I滴，洗去未結(jié)合抗體；再加驢抗羊IgG膠體金標(biāo)記物I滴，待滲入后加洗脫液兩滴，肉眼判定結(jié)果。金標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果判定檢測NC膜中央A點(diǎn)顯色紅色表示檢測有效，周圍四個熱休克抗原包被點(diǎn)顯色為陽性。結(jié)果表示為“ + ”，“++”，“+++”，僅留下白色或粉紅底色為無效檢測。靈敏性試驗(yàn):取陽性混合血清倍比稀釋，用DIGFA檢測。DIGFA檢測血清稀釋為1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160 梯度。特異性試驗(yàn):將制備好的診斷膜檢測健康羊血清與羊腦多頭蝴血清，細(xì)粒棘球蝴血清，細(xì)頸囊尾蝴血清以評估其特異性。重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn):將制備好的診斷膜保存于4°C冰箱，每隔一周取出用于腦多頭蝴血清的隨機(jī)檢測。
2.7 DIGFA 與 ELISA 比較檢測ELISA與DIGFA檢測腦多頭蝴患病動物和健康動物血清34份，其中腦多頭蝴陽性血清6份，健康羊血清20份，細(xì)頸囊尾蝴陽性血清5份，細(xì)粒棘球蝴綿羊血清3份。ELISA試驗(yàn)用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原(20 μ g/ml )，按每孔100 μ L包被酶標(biāo)板，置4°C過夜。用PH7.6的PBST洗滌酶標(biāo)板3次，加待檢血清(1:200稀釋)100 μ L /孔，37°C孵育Ih0 PBST洗滌三次后加HRP-兔抗羊IgG (1:1000稀釋)100 μ L /孔，37°C孵育lh。洗滌3次后加TMB底物溶液，IOOyL /孔。反應(yīng)IOmin后用酶標(biāo)儀于450nm波長處測定吸光值。3.試驗(yàn)結(jié)果3.1多帶絳蟲原頭蝴Tm-HSP基因的克隆3.1.1原頭蝴Tm-HSP基因的PCR擴(kuò)增通過1.22步驟中的引物設(shè)計等過程進(jìn)行的腦包蟲多頭蝴Tm-FABP基因的RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀測結(jié)果顯示:其擴(kuò)增出來的目標(biāo)條帶大小約400bp (圖1)，與預(yù)期的片段大小相符。3.1.2重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定將抽提的重組質(zhì)粒通過PCR鑒定，其通過1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示于400bp左右出現(xiàn)了電泳條帶，與預(yù)期的目標(biāo)條帶大小一致。3.1.3重組克隆質(zhì)粒的序列鑒定經(jīng)過PCR鑒定而出現(xiàn)特異 大小條帶的陽性重組質(zhì)粒被送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。3.1.4重組克隆質(zhì)粒的序列分析利用分析軟件DNAMAN和DNASTAR對測序結(jié)果進(jìn)行分析,本次擴(kuò)增序列全長408bp，其ORF框?yàn)?05bp，編碼氨基酸135個。將該序列登陸到GenBank上，登錄號為⑶205474。通過將該序列與到GenBank已知的登陸序列比較，可知該序列細(xì)粒棘球蝴HSP部分序列(DQ678104.1，AF450087.1)的同源性為 97%。3.2 Tm-HSP基因的亞克隆3.2.1加酶切位點(diǎn)引物的PCR擴(kuò)增根據(jù)測序結(jié)果,通過軟件分析HSP基因的開放閱讀框,用Primer Primer 5.0軟件重新設(shè)計一對引物，并在上、下游引物的5 ’端設(shè)計了 BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增出約400bp大小的片段。3.2.2重組質(zhì)粒的PCR與酶切鑒定通過設(shè)計的酶切位點(diǎn)引物對重組的pMD18-T-HSP質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小相符合的片段，初步說明該基因已經(jīng)成功插入了載體。3.3 Tm-FABP基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定3.3.1重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定將上一步驟中酶切亞克隆質(zhì)粒而產(chǎn)生的Tm-HSP片段通過膠回收后與原核表達(dá)載體pET-32a (+)連接，構(gòu)建pET32a (+) -Tm-HSP重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21，通過單個菌落PCR鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng)。將培養(yǎng)菌液離心后抽取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，隱約看到約400bp的目標(biāo)片段(圖5)3.4重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
將構(gòu)建好的pET32a(+)-Tm_HSP 轉(zhuǎn)入 E.coli BL21(DE3)后，利用 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，一定時間后利用SDS-PAGE電泳表達(dá)菌菌液獲得約34KDa大小的蛋白，表明多頭蝴脂肪酸結(jié)合蛋白已經(jīng)在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成功(圖6)。3.5重組質(zhì)粒表達(dá)條件的優(yōu)化3.5.1 IPTG濃度的優(yōu)化將含有pET32a(+)-Tm-HSP質(zhì)粒的BL21表達(dá)菌在IPTG濃度為0.2 mmol/L、0.4mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L> 1.0 mmol/L 和 2.0 mmol/L 的條件下分別進(jìn)行誘導(dǎo) 3 小時。通過濃度比較得知2 mmol/L的IPTG濃度為最佳的誘導(dǎo)條件，可以選為誘導(dǎo)表達(dá)的工作濃度。3.5.2誘導(dǎo)時間的優(yōu)化將含有pET32a(+)-Tm-HSP質(zhì)粒的BL21表達(dá)菌在2mmol/L條件下經(jīng)過3 h、4 h、5h、6h不同誘導(dǎo)時間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示在5h時間表達(dá)量最佳(圖7)。3.5.3誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化將含有pET32a(+)-Tm_HSP轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌在選取25 °C >30 1:和37 V溫度,
0.4 mmol/LIPTG條件下經(jīng)過5h的誘導(dǎo)。經(jīng)過SDS-PAGE電泳顯示結(jié)果37 °C的誘導(dǎo)表達(dá)量最大。(圖8)。3.6重組蛋白的純化將菌液通過Ni柱純化后，按照不同的洗脫峰收集過柱液，最后經(jīng)過SDS-PAGE進(jìn)行電泳，尋找最純的洗脫峰。3.7融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物Western-Blotting檢測經(jīng)過Ni柱純化后的蛋白在經(jīng)過PAGE電泳后，按照1.2.10步驟進(jìn)行免疫印記檢測。結(jié)果顯示，通過融合表達(dá)的Tm-HSP能夠與山羊腦多頭蝴患羊血清發(fā)生反應(yīng)，該蛋白具有反應(yīng)源性。見圖9.
3.8免疫膠體金滲濾結(jié)果(DIGFA)本方法對陽性患病動物檢出率為83.3%(5/6)，有5%(1/20)的假陽性出現(xiàn)，其特異性較差，與細(xì)頸囊尾蝴陽性血清有40%(2/5)的交叉反應(yīng)，與細(xì)粒棘球蝴血清有66.7%(2/3)的交叉反應(yīng)。重組Tm-HSP蛋白的最佳包被濃度根據(jù)DIGFA檢測患病家畜血清的顯色結(jié)果如圖10,判定當(dāng)抗原濃度為2mg/mL為最佳顯色濃度“+++”, 0.5mg/mL、lmg/mL、1.5mg/mL也有顯色反應(yīng)(圖10)。3.9 DIGFA 與 ELISA 比較檢測ELISA與DIGFA檢測患病動物血清結(jié)果比較兩法均為陽性的有5份，兩法均為陰性19份，符合率為92.3% (24/26)，如表I所示。表I DIGFA與ELISA檢測結(jié)果比較Tablel Comparison of results of by DIGFA and ELISA
權(quán)利要求
1.一種腦多頭蝴熱休克蛋白抗原的制備方法，其特征在于，該方法從羊腦多頭蝴原頭節(jié)提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)首次擴(kuò)增出HSP基因序列，該基因的開放閱讀框?yàn)?08bp，編碼136個氨基酸；將此基因克隆到pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_HSP，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western_blot檢測表達(dá)產(chǎn)物；以純化后的表達(dá)蛋白作為抗原，建立檢測羊腦多頭蝴病抗體的重組蛋白膠體金滲濾法。
2.如權(quán)利要求1所述的腦多頭蝴熱休克蛋白抗原的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)基和常用溶液的配制方法為: 利用超純水配制溶液，用0.22 μ m的過濾器過濾配制好的IPTG溶液； 將超純水 800 mL 混合 Yeast Extract5 g, Trypton、10 gNaCllOg,調(diào)節(jié) pH 值至 7.2,定容至I 000 mL，并于121°C高壓蒸汽滅菌20 min，再置于4°C保存； 將瓊脂粉加入液體LB培養(yǎng)基，于121°C的高壓滅菌鍋滅菌20min，最后將瓊脂粉的濃度調(diào)節(jié)為1.5%(w/v);最后在瓊脂糖培養(yǎng)基溫度降低后加入氨芐青霉素并倒板； 利用購買的氨芐青霉素和超純水配制成工作液濃度100mg/mL，再用0.22 μ m濾器過濾除菌，于_20°C保存?zhèn)溆茫? 將27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mo I/L EDTA溶液，最后加超純水定容至1000 mL ； 將Ig瓊脂糖粉末置于90mL超純水，再加入IOmL的5XTBE，定容至IOOmL ； .0.8gN, N' 一亞甲叉雙丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于適量超純水中，定容至IOOmL,于4°C避光保存； 將18.17gTris置于超純水中溶解，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為8.8，最后定容至IOOmL,并于4°C保存； 將12.1lg Tris置于超純水中溶解，利用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為6.8，最后定容至lOOmL，并于4°C保存； 將IOgSDS干粉溶于80mL的滅菌超純水中，同過加熱溶解干粉，最后定容至IOOmL ； 將1g過硫酸銨溶于水中，定容至IOmL ；.1.6 mL 雙蒸水、2 mL30% 丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris (ρΗ8.8) 1.3 mL、0% 過硫酸銨 0.05mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL ； 10%SDS0.01 mL、0.68 mL雙蒸水、1.0 mol/L Tris (pH6.8)0.13 mL、30%丙烯酞胺0.17mL、10% 過硫酸銨 0.01 mL、TEMED 0.001 mL ； 取14.4g甘氨酸、3gTris混合IgSDS溶解于超純水,最后定容至IOOOmL ； 緩沖液:將0.1%溴酚藍(lán)、25%甘油、14.4mmol/L 2-巰基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl ； 將45mL甲醇，45mL水，1OmL冰乙酸，0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250 ；90mL甲醇:水(1:1), 1OmL冰乙酸； 將Tris堿5.8g，甘氨酸2.9g，SDS (電泳級).0.37g，甲醇200mL，加去超純水定容至1OOOmL ； KH2PO40.24g、Na2HPO4.H202.9g、.0.2gKCl、.8.8gNaCl、用超純水定容至 lOOOmL，并置于高壓滅菌鍋滅菌后4°C保存?zhèn)溆茫? 將NaC18.8g、IMTris-HCl (pH8.0) 20mL、加入800mL超純水充分?jǐn)嚢枞芙?，再加Tween-200.5mL混勻，最后加超純水定容至lOOOmL，并用高壓滅菌鍋滅菌后于4°C保存?zhèn)溆茫? PBSlOmL, BSA0.lg，現(xiàn)配先用；.6.0mgDAB, IOmL0.0lM PBS, I μ L H2O2 ； NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4.12 H2O 3.58 g, KH2PO4 0.27 g 加去離子水溶解并定容至 I OOOmL ； 在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混勻；含 5%FBS 的 0.01 mol/L ρΗ7.4 PBS 溶液； 臨用前配制 0.1 mol/L 檸檬酸(2.1 g/100 mL),0.2 mol/L Na2HPO4.12H20 6.1 mL,ddH20 12.5 mL,鄰苯二胺 10 mg,溶解后，加入 30%H202 40 μ L ； 終止液采用2 mol/L H2SO4。
3.一種利用權(quán)利要求1所述制備方法制備的腦多頭蝴熱休克蛋白抗原建立檢測羊腦多頭蝴病抗體的重組蛋白膠體金滲濾法，其特征在于，該重組蛋白膠體金滲濾法包括以下步驟: 腦多頭蝴總RNA的提取，將保存于液氮的腦包蟲原頭蝴抽屜總RNA，利用總RNA抽提試劑盒，并按照其說明書進(jìn)行總RNA抽提； 腦多頭蝴HSP基因的RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)測序完成的多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)討對引物； 對抽提的RNA，將抽提的腦多頭蝴原頭節(jié)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系同F(xiàn)ABP擴(kuò)增；合成cDNA，加入引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增； Tm-HSP基因膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，將RT-PCR擴(kuò)增得到的HSP基因通過膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，將其插入入PMD 18-T載體，并且轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，其具體步驟同Tm-FABP ； pET-32a -Tm-HSP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定；pET-32a_HSP重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)與鑒定； 將鑒定正確的pET-32a-HSP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21 (DE3)進(jìn)行表達(dá)，并且通過SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證，通過免疫印記檢測其反應(yīng)源性，具體操作步驟同F(xiàn)ABP的表達(dá)與鑒定；免疫金標(biāo)滲濾法(DIGFA)的建立； DIGFA與ELISA比較檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白膠體金滲濾法，其特征在于，腦多頭蝴HSP基因的RT-PCR擴(kuò)增,根據(jù)測序完成的多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，由大連寶生物工程有限公司合成； 對抽提的RNA，將抽提的腦多頭蝴原頭節(jié)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系同F(xiàn)ABP擴(kuò)增。合成cDNA，加入引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C退火30s，72。。延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢查結(jié)果。
5.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白膠體金滲濾法，其特征在于，pET-32a-Tm-HSP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定，根據(jù)測序結(jié)果，通過軟件分析擴(kuò)增出的Tm-HSP基因?yàn)橐粋€開放閱讀框，用Primer Primer 5.0軟件重新設(shè)計一對引物, 并在上、下游引物的5’端設(shè)計了 Bamh I和Xho I酶切位點(diǎn)； 以pMD-Tm-HSP質(zhì)粒為模板，用上述弓I物對基因的閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果，并回收目的片段。將pET-32a(+)質(zhì)粒及上述膠回收的PCR產(chǎn)物分別用Bamh I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒作雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。
6.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白膠體金滲濾法，其特征在于，免疫金標(biāo)滲濾法的建立，最佳抗原包被濃度的確定，在垂直流滲濾法檢測盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5 μ L，為質(zhì)控點(diǎn)Α。周圍四點(diǎn)B、C、D、E點(diǎn)加HSP抗原0.5 μ L，濃度分別為0.5mg/mL、lmg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL，干燥后用封閉液封閉4°C保存?zhèn)溆茫? 金標(biāo)試驗(yàn)操作流程，將檢測裝置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μ L，待完全滲入后加洗脫液I滴，洗去未結(jié)合抗體；再加驢抗羊IgG膠體金標(biāo)記物I滴，待滲入后加洗脫液兩滴，肉眼判定結(jié)果； 金標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果判定，檢測NC膜中央A點(diǎn)顯色紅色表示檢測有效，周圍四個熱休克抗原包被點(diǎn)顯色為陽性；結(jié)果表示為“ + ”，“++”，“+++”，僅留下白色或粉紅底色為無效檢測； 靈敏性試驗(yàn)，取陽性混合血清倍比稀釋，用DIGFA檢測；DIGFA檢測血清稀釋為1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160 梯度； 特異性試驗(yàn)，將制備好的診斷膜檢測健康羊血清與羊腦多頭蝴血清，細(xì)粒棘球蝴血清，細(xì)頸囊尾蝴血清以評估其特異性； 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，將制備好的診斷膜保存于4°C冰箱，每隔一周取出用于腦多頭蝴血清的隨機(jī)檢測。
7.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白膠體金滲濾法，其特征在于，DIGFA與ELISA比較檢測，ELISA與DIGFA檢測腦多頭蝴患病動物和健康動物血清34份，其中腦多頭蝴陽性血清6份，健康羊血清20份，細(xì)頸囊尾蝴陽性血清5份，細(xì)粒棘球蝴綿羊血清3份；ELISA試驗(yàn)用PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，按每孔100 μ L包被酶標(biāo)板，置4°C過夜；用pH7.6的PBST洗滌酶標(biāo)板3次，加待檢血清100 μ L /孔，37°C孵育Ih ；PBST洗滌三次后加HRP-兔抗羊IgGlOOyL /孔，37°C孵育Ih ;洗滌3次后加TMB底物溶液，100 μ L /孔。反應(yīng)IOmin后用酶標(biāo)儀于450nm波長處測定吸光值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦多頭蚴熱休克蛋白抗原的制備方法，該方法從羊腦多頭蚴原頭節(jié)提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)首次擴(kuò)增出HSP基因序列，該基因的開放閱讀框?yàn)?08bp，編碼136個氨基酸。將此基因克隆到pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-HSP，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE和Western-blot檢測表達(dá)產(chǎn)物；以純化后的表達(dá)蛋白作為抗原，建立檢測羊腦多頭蚴病抗體的重組蛋白膠體金滲濾法(DIGFA)。本發(fā)明通過分子生物學(xué)的方法，人工合成了一種可以用于腦多頭蚴病診斷的重組抗原，并評價了該表達(dá)蛋白在腦多頭蚴病診斷中的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/68GK103205447SQ20121056452
公開日2013年7月17日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者楊光友, 聶華明, 彭雪蓉, 古小彬 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)