專利名稱：用于檢測肺炎支原體抗體的方法、檢測用的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測肺炎支原體抗體的方法、采用此方法進(jìn)行檢測的試劑盒、以及該試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)是人類原發(fā)性非典型肺炎的病原體，還可以引起其他呼吸道感染性疾病甚至機(jī)體其它組織疾病，且發(fā)病率日益增加并有流行趨勢。由于Mp無細(xì)胞壁，故其引起感染的治療與其它細(xì)菌和病毒感染在治療方法上有所不同，因此，Mp感染的病原學(xué)診斷對于疾病的及時正確治療有重要意義。目前檢測肺炎支原體的方法雖然很多，但缺乏更為快速簡易而又可靠的方法。X線征象均缺乏特異性，且須與病毒性肺炎、軍團(tuán)菌肺炎相鑒別，只能通過實驗室檢查病原體分離陽性和血清學(xué)試驗進(jìn)行鑒別診斷、確診。血清中特異性IgM及IgG抗體可通過冷凝集試驗(CAT)、明膠顆粒凝集實驗(PLA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、金標(biāo)免疫斑點法(DIM)等方法進(jìn)行測定。CAT特異度和敏感度均為最低，因此其臨床診斷價值不大；金標(biāo)斑點法雖操作簡便快捷，但敏感度略低，有漏診的可能；明膠顆粒凝集試驗試劑準(zhǔn)備與操作過程較為繁瑣費(fèi)時，且需要專業(yè)操作人員。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有特異、敏感和簡便等優(yōu)點，已用于檢查各種抗體或抗原，但此方法存在以下問題(1)每一批試驗從加樣、溫育及洗板等步驟較多，操作繁瑣，時間較長，且需專門操作人員及專用儀器，難以在基層醫(yī)療單位開展。(2)檢測中需分別加入顯色成分A液與B液，一定程度上增加了勞動強(qiáng)度與試劑盒成本。專利申請?zhí)?00710075306. 3公開了一種可在一定時間使生色物與過氧化物內(nèi)共存的顯色體系，但此體系中的關(guān)鍵組分一生色物保護(hù)劑硫代硫酸鈉，在此發(fā)明的PH低于6. O的酸性環(huán)境下不利于長期的穩(wěn)定，溶液體系若存在C02、微生物或長期暴露在光照環(huán)境下也都不利于硫代硫酸鈉的穩(wěn)定，因此不能對生色物如TMB等起到有效的抗氧化保護(hù)作用。其中用于吸收紫外線的巴松-1789雖可以起到對紫外線的防護(hù)作用，但它遇金屬離子即變紅，干擾試驗結(jié)果，因此增加了配制過程中對試劑純度及操作的額外要求。(3) ELISA法無法做到對兩種抗體的快速同時檢測。目前利用HRP標(biāo)記抗體技術(shù)大多采用的過碘酸鈉法，少數(shù)學(xué)者利用HRP標(biāo)記抗原的技術(shù)過程與標(biāo)記抗體過程基本類似，但此標(biāo)記過程存在以下問題(1)標(biāo)記中需反復(fù)調(diào)節(jié)pH，且pH值調(diào)節(jié)范圍較寬，不可避免地影響酶活性；(2)標(biāo)記過程繁瑣、操作耗時；(3)標(biāo)記過程中不可避免發(fā)生酶自身的交聯(lián)；(4)標(biāo)記物不夠穩(wěn)定不易保存，反復(fù)凍融又會使標(biāo)記物活性下降。因此，以此傳統(tǒng)標(biāo)記方法制備的肺炎支原體檢測試劑盒的質(zhì)量與穩(wěn)定性不能得到保證。目前常規(guī)的酶標(biāo)記物稀釋緩沖液對酶標(biāo)記物不能起到最大限度的保護(hù)作用，濃度較高的酶標(biāo)記物在低溫下相對穩(wěn)定，但制備工作液時需復(fù)溶或再稀釋，稀釋后保存期較短，且增加了工作量。如果在運(yùn)輸過程中遇到持續(xù)高溫氣候，試劑盒中免疫酶標(biāo)記物的活性將受到很大影和從而影響到試劑盒的質(zhì)量，造成經(jīng)濟(jì)損失。專利申請?zhí)?00910143637. 5公開了一種維護(hù)酶標(biāo)記物穩(wěn)定性的稀釋液，但此溶液系統(tǒng)中所添加的木糖是一種帶有醛基的還原性糖，同時此系統(tǒng)中還存在大量帶有氨基基團(tuán)的甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、酶及其其它生物分子，此種混合溶液中易發(fā)生美拉德反應(yīng)一即羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))間的反應(yīng)，經(jīng)過復(fù)雜的歷程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或稱擬黑素，所以又稱羰胺反應(yīng)(法國化學(xué)家L.C. Maillard在1912年提出)。美拉德反應(yīng)在高溫條件下進(jìn)行較快，但在長期室溫儲存條件下也可以緩慢進(jìn)行這種非酶促反應(yīng)；且此稀釋液諸多添加物都是動物源性，使用非動物源性的穩(wěn)定劑以減少動物源性原輔料的潛在危害已引起生產(chǎn)廠家的廣泛關(guān)注。因此以上保護(hù)性稀釋液不利于長期保存酶標(biāo)記物。某些診斷試劑盒的保存緩沖液出于商業(yè)原因等并未給出具體組分，給試劑盒的開發(fā)應(yīng)用帶來不便。因此應(yīng)根據(jù)酶標(biāo)抗原的分子量、酸堿性質(zhì)、疏水性等尋找有效的保存緩沖液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測肺炎支原體抗體的方法、試劑盒及其制備方法，使酶標(biāo)抗原的過程更加快速高效，提高靈敏度，延長酶標(biāo)記物及試劑盒的有效期。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種用于檢測肺炎支原體抗體的方法，將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，力口入待檢血清，待檢血清中的肺炎支原體抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，力口入酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果；所述酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液采用辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液，并采用以下步驟制備(1)將1g辣根過氧化物酶溶于25ml 30ml的0. 0lM磷酸鹽緩沖液中，加入70 85mg乙二胺，用0.1M鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至5. 0，所得溶液再與115 125mgl-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽混合，室溫振蕩反應(yīng)后，采用0. 0lM磷酸鹽緩沖液對所得溶液進(jìn)行透析，制得氨基化辣根過氧化物酶溶液；(2)將步驟(1)制得的溶液配制成1ml、濃度為5 5. 2mg/ml的氨基化辣根過氧化物酶溶液，再向所得溶液內(nèi)加入60 85 μ I交聯(lián)劑，混勻后于室溫下反應(yīng)25 35min ；(3)將所述反應(yīng)物加入截留分子量為1OK的超濾管，并對反應(yīng)物進(jìn)行離心處理8 12min，再以0. 0lM的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶滯留結(jié)合物至1ml，再以同樣離心力離心8 12min,以除去過量的交聯(lián)劑，并再次復(fù)溶滯留物至1ml ；(4)加入700 900 μ I濃度為1. 6mg/ml的肺炎支原體抗原溶液,并于室溫下反應(yīng)
25 35min ；(5)使步驟(4)制得的溶液通過SephadexG-200層析柱,收集第一峰的產(chǎn)物，即為酶標(biāo)肺炎支原體抗原溶液。優(yōu)選的，所述膜為硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。優(yōu)選的，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原所用交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.一種用于檢測肺炎支原體抗體的方法，其特征在于將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的肺炎支原體抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果；所述酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液采用辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液，并采用以下步驟制備(1)將Ig辣根過氧化物酶溶于25ml 30ml的O.OlM磷酸鹽緩沖液中，加入70 85mg乙二胺，用O.1M鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至5. 0，所得溶液再與115 125mgl-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽混合，室溫振蕩反應(yīng)后，采用O. OlM磷酸鹽緩沖液對所得溶液進(jìn)行透析，制得氨基化辣根過氧化物酶溶液；(2)將步驟(I)制得的溶液配制成1ml、濃度為5 5.2mg/ml的氨基化辣根過氧化物酶溶液，再向所得溶液內(nèi)加入60 85 μ I交聯(lián)劑，混勻后于室溫下反應(yīng)25 35min ；(3)將所述反應(yīng)物加入截留分子量為IOK的超濾管，并對反應(yīng)物進(jìn)行離心處理8 12min，再以O(shè). OlM的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶滯留結(jié)合物至1ml，再以同樣離心力離心8 12min,以除去過量的交聯(lián)劑，并再次復(fù)溶滯留物至Iml ；(4)加入700 900μ I濃度為1. 6mg/ml的肺炎支原體抗原溶液，并于室溫下反應(yīng)25 35min ；(5)使步驟(4)制得的溶液通過SephadexG-200層析柱，收集第一峰的產(chǎn)物，即為酶標(biāo)肺炎支原體抗原溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，所述膜為硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。
3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原所用交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)如下
4.如權(quán)利要求1所述的用于檢測肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，所述顯色液為包括四甲基聯(lián)苯胺、過氧化脲、抗氧化劑綠原酸、還原劑抗壞血酸、紫外線吸收劑2-氰基-3，3- 二苯基丙烯酸異辛酯和pH5. O的乙酸鈉緩沖溶液體系。
5.如權(quán)利要求4所述的用于檢測肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，所述顯色液采用如下方法制得⑴將8. 3 8. 5g三水合乙酸鈉晶體溶于600ml超純水中，振蕩混勻，并調(diào)整溶液pH至5. O ；⑵再將O. 4 1. Og四甲基聯(lián)苯胺溶于3ml無水乙醇中，制得四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液；⑶將上述兩種溶液混合，振蕩混勻；⑷分別將70 90mg綠原酸與70 90mg抗壞血酸、8 12ml2_氰基-3，3- 二苯基丙烯酸異辛酯、2. 5 2. 9g磷酰甘氨酸及O. 2 O. 8g過氧化脲加入到步驟(3)所得到的混合溶液中，振蕩混勻，得到所述顯色液。
6.如權(quán)利要求1所述的用于檢測肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原使用前，加入酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液，所述酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液采用以下方法制備⑴褐藻提取物的制備新鮮海藻樣品采集后，除去附生生物，用蒸餾水反復(fù)沖洗后取藻體頂部，稱量后用組織搗碎機(jī)破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液除去乙醇，加入磷酸鹽緩沖液，離心后取上清液，即制得褐藻提取物；⑵酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液的配制向0. 0lM的磷酸鹽生理鹽水緩沖液中加入0. 02 0.04wt%的甲基異噻唑啉酮與0. 04 0. 08wt%診斷試劑防腐劑PR0CLIN300，然后依次加入2 8wt%海藻糖、0. 01 0. 07wt%黃原膠、0. 9wt%甘氨酸與0. 7wt%絲氨酸,混勻后再加入0.3 1. 2wt%褐藻提取物、0.1 0. 6wt%基因重組的類人膠原蛋白，最后加入1. 8wt%的硫酸鎂與0. 9wt%氯化鋅、0. 1%維生素BI及3%體積比的甘油，混合均勻，得到所述酶標(biāo)記物穩(wěn)定性緩沖液。
7.用于檢測肺炎支原體抗體的試劑盒，其特征在于，包括設(shè)置在所述試劑盒內(nèi)的檢測盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液瓶、洗滌液瓶和顯色液瓶，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液采用如權(quán)利要求1所述方法制備，所述檢測盒內(nèi)設(shè)有包被膜，所述包被膜上包被有兩個檢測點與質(zhì)控點，所述兩個檢測點上分別包被有抗人IgM與抗人IgG抗體,所述質(zhì)控點包被有抗肺炎支原體抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的用于檢測肺炎支原體抗體的試劑盒，其特征在于，所述包被膜為硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。
9.制備如權(quán)利要求7所述的用于檢測肺炎支原體抗體的試劑盒的方法，其特征在于，采用以下步驟制備⑴采用如權(quán)利要求1所述方法制備辣根過氧化物酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液；⑵制備包被膜選用適合孔徑的包被膜，裁成方片備用；⑶制備包被抗體將抗人1gM、抗人1gG與抗肺炎支原體抗體離心備用；⑷組裝檢測盒將盒蓋、包被膜、吸水墊和盒體按照從上到下的順序組裝并扣緊，使上蓋的窗口扣在包被膜中心位置，組成檢測盒；(5)包被用添加了3wt％海藻糖的0. 0lM磷酸鹽緩沖液稀釋離心后的各抗體至100 500 μ g/ml，在包被膜的檢測點位置分別包被O. 5 μ I濃度為0.1 1. Omg/ml的抗人IgM、0.5 μ I濃度為0.1 1. 0mg/ml抗人1gG,質(zhì)控點位置包被0. 6 μ I濃度為0. 5 1. Omg/ml的抗肺炎支原體抗體；(6)干燥檢測盒在濕度10% 40%的環(huán)境下室溫干燥I小時；(7)包裝干燥后的檢測盒用鋁箔帶包裝，并在袋內(nèi)放置干燥劑，封口。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體一種檢測肺炎支原體抗體的方法、采用此方法進(jìn)行檢測的試劑盒，以及該試劑盒的制備方法，將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的肺炎支原體抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記肺炎支原體抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果。本發(fā)明可使酶標(biāo)肺炎支原體抗原的過程快速高效，延長試劑盒的保質(zhì)期，提高檢測靈敏度，降低試劑盒成本。
文檔編號G01N33/569GK103033615SQ201210568379
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者楊致亭, 楊金紅, 鄧旭, 李升香, 武國威, 石中強(qiáng), 丁兆明, 尚永明 申請人:青島漢唐生物科技有限公司