專利名稱：檢測α-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體內(nèi)酶含量的檢測試劑，尤其涉及一種檢測a-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑及其制備方法，屬于a -L-巖藻糖苷酶的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
a -L-巖藻糖苷酶(a -L-Fucosidase, AFU)是一種溶酶體酸性水解酶，分類名為a-L-巖藻糖苷巖藻糖水解酶(EC3. 2. 1.51)。它主要存在于人體內(nèi)的各種組織、細(xì)胞及體液中，如肝、胰、腦、肺、腎纖維細(xì)胞等的溶酶體內(nèi)，以肝腎含量最高。在血清、尿液、唾液、淚液和垂體液中均含此酶。基本生理功能是催化含巖藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷的分解代謝。巖藻糖苷貯積癥患者的腦、肝、腎、肺、尿內(nèi)都有該酶的缺乏，導(dǎo)致在這些器官內(nèi)出現(xiàn)異常的沉積物。在腦、肝等組織的沉積物是一種含有巖藻糖的糖脂，主要以巖藻糖為終末部分的四己糖基及五己糖基神經(jīng)酰胺為主，特別是腦內(nèi)此特征最為明顯。因此可能這是巖藻糖苷貯積癥的發(fā)病機(jī)制。本病分幼兒型和成人型，他們有共同的特征如全身肌張力低下、出汗過多、體態(tài)短小、進(jìn)行性智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩等。幼兒型一般在一歲左右出現(xiàn)明顯臨床癥狀，多死于10歲以內(nèi)。a -L-巖藻糖苷酶升高多見于肝臟受損患者、妊娠與卵巢腫瘤等情況。早在1977年，Bauer等就在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到鼠肝癌組織中AFU活力較正常肝臟高7倍，提示AFU可作為一項(xiàng)肝癌非特異性標(biāo)志物；1980年Deugnier等首先在人肝癌患者血清中發(fā)現(xiàn)AFU活性明顯高于正常人，正式為診斷原發(fā)性肝癌(PHC)提供了新的指標(biāo)。肝癌患者血清AFU升高的原因目前暫不清楚，可能機(jī)制是①肝癌細(xì)胞合成酶增加并大量釋放入血。②血清AFU破壞減少，正常時(shí)肝枯否細(xì)胞從血清中清除AFU，推測肝癌患者由于細(xì)胞免疫功能低下或其他原因使枯否細(xì)胞清除AFU的能力下降，而表現(xiàn)為酶活性升高。③含巖藻糖的糖蛋白和糖脂的代謝紊亂。目前臨床診斷早期肝癌的主要生化指標(biāo)是甲胎蛋白(AlphaFetal Protein,AFP)，它是胚胎時(shí)期肝細(xì)胞合成的一種特殊糖蛋白，可促進(jìn)胚胎肝組織迅速增殖，故胎血中含量高，在胎兒出生后約I 4周基本消失，成人血中含量非常少。當(dāng)肝癌組織只有O. I O. 2厘米的癌塊時(shí)，患者血液中就能檢測到AFP的升高，而此時(shí)用B超、CT、磁共振等的影像學(xué)檢查還難以發(fā)現(xiàn)。診斷早期肝癌，AFP比影像學(xué)檢查要早數(shù)月至I年左右，這能為患者贏得寶貴的治療時(shí)間。原發(fā)性肝細(xì)胞癌中，70 90%的患者AFP呈陽性。臨床上對AFP的檢測均使用免疫的方法，不可避免會(huì)有假陽性和假陰性的結(jié)果。而作為對早期原發(fā)性肝癌診斷的有力補(bǔ)充，AFU具有較大的優(yōu)勢。國內(nèi)對24例肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行血清AFU和AFP相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)AFU診斷敏感為87%，特異性為78%，而AFP則分別為65%和89% (診斷界限為，20ug/L)。提示AFU診斷的敏感性好，而特異性較AFP低。血清AFU的檢測方法有兩大類熒光法與比色法。熒光法利用AFU水解4_甲基傘型酮a-L-巖藻吡喃糖苷釋放4-甲基傘型酮產(chǎn)生熒光來進(jìn)行檢測，靈敏度較高，但該法對儀器條件要求高，常規(guī)應(yīng)用有較大困難。比色法中，早期以4-硝基苯α-L-巖藻吡喃糖苷(PNPF)為底物，經(jīng)AFU水解后釋放4-硝基苯酚(4-NP)，反應(yīng)一定時(shí)間后用堿性緩沖液終止反應(yīng)并使4-NP呈黃色，在規(guī)定波長下讀取吸光度A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或4-NP的摩爾吸光度可以計(jì)算出AFU活性。后來以PNPF為底物還發(fā)展了速率法的檢測方法，使靈敏度、抗干擾性都有所提高，適用于各種半/全自動(dòng)分析儀器。但因底物溶解性的問題，需要調(diào)節(jié)反應(yīng)PH值為6. 1，在這個(gè)PH下AFU活性只能達(dá)到60% 70%，因此PNPF底物的速率法測值偏低。另外一種以氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷(CNPF)作底物，靈敏度和精密度較PNP法都有了很大的改善。但大多為干粉試劑，且易受樣本中溶血、黃疸及脂血的干擾。公開號為CN 1428435Α的中國發(fā)明專利申請公開了一種使用CNPF為底物的檢測試劑，但該法檢測過程中易產(chǎn)生肝素的干擾現(xiàn)象。公開號為CN 1464066Α的中國發(fā)明專利申請公開了一種單試劑的檢測試劑，能夠有效節(jié)約自動(dòng)生化儀上試劑位，但依然存在易受樣本肝素干擾的現(xiàn)象。公開號為CN 1731146Α公開了一種思路新穎的檢測方法，在試劑中引入煙酰胺輔酶I (NADH)氧化還原系統(tǒng)，大大提高了試劑的靈敏度，但NADH的保存條件與AFU的反應(yīng)條件具有不可調(diào)和的矛盾，因此該法只能是雙試劑的劑型，而且引入了巖藻糖苷酶脫氫酶使試劑成本大大提高。公開號為CN 101571537Α的中國發(fā)明專利申請公開了一種 能夠抗肝素干擾的檢測試劑，以CNPF為底物，能有效抵抗樣品中肝素的干擾，但此試劑為雙試劑?？傊?，現(xiàn)有的檢測a -L-巖藻糖苷酶的試劑大多不同程度的存在以下幾種問題I)在以氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷(CNPF)作底物時(shí)，往往會(huì)有穩(wěn)定性較差的問題，因此大多以干粉試劑的形式保存，使用戶操作起來不方便；2)在檢測肝素抗凝血漿時(shí)，大多都存在受肝素干擾的導(dǎo)致測值偏低的問題。3)大部分a -L-巖藻糖苷酶測定試劑為液體雙試劑，增加了自動(dòng)生化儀上試劑位的負(fù)擔(dān)。因此實(shí)踐中亟待開發(fā)一種穩(wěn)定性好、能夠有效抗肝素干擾的a -L-巖藻糖苷酶檢測單試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的檢測a-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑所存在的穩(wěn)定性差、不能有效抗肝素干擾的缺陷，提供一種新的檢測a -L-巖藻糖苷酶的液體單試劑，該液體單試劑具有優(yōu)異的穩(wěn)定性且能夠抵抗樣品中肝素的干擾。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種檢測a-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑，包括緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、表面活性劑、穩(wěn)定劑和氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷(CNPF)。為了達(dá)到更好的檢測效果，每I升液體單試劑中各組分的用量優(yōu)選為緩沖液O. 01-0. 5摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. Ol-lOg，NaCl O. 1-lOOg，表面活性劑O. 1-10 g，穩(wěn)定劑O. 1-10 g，氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷O. 05-20 g，余量為水。更優(yōu)選的，每I升液體單試劑中各組分的用量優(yōu)選為緩沖液O. 02-0. 2摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. 05-lg，NaCl l_50g，表面活性劑O. Ι-lg，穩(wěn)定劑O. Ι-lg，氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷O. 1-5 g，余量為水。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖液的pH值為3. 0-5. O時(shí)，相比于其它的pH值比較有利于底物CNPF的穩(wěn)定以及AFU酶活性的充分發(fā)揮，由此，本發(fā)明試劑中緩沖液的pH值優(yōu)選為3. 0-5. O ;本發(fā)明中所述的緩沖液可選自甘氨酸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液中的任意一種或多種。本發(fā)明液體單試劑中的表面活性劑有利于樣本中各種物質(zhì)的溶解，減少樣本脂濁對測定結(jié)果的影響。本發(fā)明中所述的表面活性劑優(yōu)選為非離子型表面活性劑，例如可選自Tween20> Tween80> Triton X_100、Brij 35等非離子型表面活性劑中的任意一種或多種。本發(fā)明液體單試劑中所加入的穩(wěn)定劑可以為醇類有機(jī)溶劑，例如可以為甲醇、乙醇、乙二醇、異丙醇、丙三醇、聚乙二醇等醇類有機(jī)溶劑的任意一種或多種。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過加入穩(wěn)定劑不僅能夠有效提高液體單試劑在2-8存儲(chǔ)或者37°C加速過程中保持穩(wěn)定性，出乎意料的是，穩(wěn)定劑能夠和表面活性劑相協(xié)同從而有效的消除樣品肝素的干擾， 最終提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏性。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種制備所述檢測a -L-巖藻糖苷酶液體單試劑的制備方法。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種制備檢測a -L-巖藻糖苷酶液體單試劑的制備方法，包括( I)按所述用量取各成分；(2)將各成分溶解于蒸餾水中，定容，即得。應(yīng)用本發(fā)明的AFU測定試劑，采用的測定方法為速率法，溫度為37°C，樣本R為25:225，測定主/副波長為410/520nm，試劑中加入樣本或校準(zhǔn)后在測定穩(wěn)定孵育180秒后，記錄吸光度值A(chǔ)l，然后繼續(xù)孵育180秒后記錄吸光度值A(chǔ)2。計(jì)算方法如下
Δ A/minX Vt X 1000
AFU (U/L) =---------------------------= Δ A/minXF*
e X Vs Xd
Δ A/mi η----每分e------摩爾消光
鐘吸光度變化率系數(shù)
Vt-----反應(yīng)液總Vs-----標(biāo)本體積
體積(ml)(ml)
1000-----變化因d------I 比
數(shù)色杯光徑(cm)
F*--------理論因
數(shù)(1250)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測a -L-巖藻糖苷酶的液體單試劑分別在42°C保存3天，37°C保存14天和2-8°C保存18個(gè)月后，各項(xiàng)性能均保持穩(wěn)定，表明本發(fā)明液體單試劑穩(wěn)定性良好且能夠抵抗樣本中至少100KU/L的肝素干擾。


圖I本發(fā)明液體單試劑檢測肝素抗凝樣本反應(yīng)曲線圖。圖2對照液體單試劑檢測肝素抗凝樣本反應(yīng)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例I本發(fā)明液體單試劑的制備將pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑TWeen20，穩(wěn)定劑甲醇以及氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液O. 02摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. Olg，NaCl 5g，表面活性劑TWeen20 O. lg，穩(wěn)定劑甲醇O. I g，氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷O. 5g，余量為水。實(shí)施例2本發(fā)明液體單試劑的制備將pH值為5. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑Triton X-100，穩(wěn)定劑乙二醇以及氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為5. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液O. 05摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. 5g，NaCl 10g，表面活性劑Triton X-100 10 g，穩(wěn)定劑乙二醇10 g，氯化對硝基苯α-L-巖藻吡喃糖苷2g，余量為水。實(shí)施例3本發(fā)明液體單試劑的制備將pH值為4. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑Brij35，穩(wěn)定劑異丙醇以及氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.02摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸0.058，恥(1 Ig，表面活性劑Brij 35 O. I g，穩(wěn)定劑異丙醇O. Ig,氯化對硝基苯a-L-巖藻批喃糖苷O. Ig,余量為水。實(shí)施例4本發(fā)明液體單試劑的制備將pH值為5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑TWeen80，穩(wěn)定劑乙二醇以及氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖液O. 2摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸lg，NaCl 5g，表面活性劑TWeen80 I g，穩(wěn)定劑聚乙二醇lg，氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷O. 5g，余量為水。對比實(shí)施例I液體單試劑的制備將pH值為3. O的甘氨酸-鹽酸緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑TWeen20以及氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液O. I摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. Olg , NaCl O. Ig，表面活性劑Tween20 O. Ig,氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷O. 05g,余量為水。對比實(shí)施例2液體單試劑的制備將pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑Triton X-100以及氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為5. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液O. 5摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸IOg，NaCl IOg，表面活性劑Triton X-100 10 g,氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷O. 2 g,余量為水。對比實(shí)施例3 液體單試劑的制備將pH值為4. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑Brij 35以及氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液O. 02摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. 05g，NaCl lg，表面活性劑Brij 35 O. I g，氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷O. lg，余量為水。對比實(shí)施例4 液體單試劑的制備將pH值為5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性劑TweenSO以及氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷加入到蒸餾水中混合均勻并充分溶解于水中，即得液體單試劑；其中，每I升液體單試劑中各成分的用量控制為，pH值為5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖液O. 2摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸lg，NaCl 5g，表面活性劑TWeen80 I g，氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷O. 5g，余量為水。試驗(yàn)例I檢測Ci-L-巖藻糖苷酶液體單試劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料I、供試試劑實(shí)施例1-4所制備的液體單試劑；2、對照試劑對比實(shí)施例1-4所制備的液體單試劑。二、試驗(yàn)方法測定方法為速率法，溫度為37°C，樣本試劑為25:225，測定主/副波長為410/520nm,供試試劑或?qū)φ赵噭┘尤霕颖净蛐?zhǔn)后在測定穩(wěn)定孵育180秒后，記錄吸光度值A(chǔ)l，然后繼續(xù)孵育180秒后記錄吸光度值A(chǔ)2。計(jì)算方法如下
Δ A/minX Vt X 1000
AFU (U L) =---------------------------= Δ A/minXF*
e X Vs Xd
權(quán)利要求
1.一種檢測a-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑，其特征在于，包括緩沖液、乙二胺四乙酸、NaCl、表面活性劑、穩(wěn)定劑和氯化對硝基苯a -L-巖藻吡喃糖苷。
2.按照權(quán)利要求I所述的液體單試劑，其特征在于，每I升液體單試劑中各組分的用量為緩沖液O. 01-0. 5摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸O. Ol-IOg ,NaCl O. I-IOOg，表面活性劑O.1-10 g,穩(wěn)定劑O. 1-10 g,氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷O. 05-20 g，余量為水。
3.按照權(quán)利要求2所述的液體單試劑，其特征在于，各組分的用量為緩沖液O.02-0. 2摩爾質(zhì)量，乙二胺四乙酸0.05-lg，NaCl l_50g，表面活性劑O. l_lg，穩(wěn)定劑O. Ι-lg，氯化對硝基苯a-L-巖藻吡喃糖苷O. 1-5 g。
4.按照權(quán)利要求I所述的液體單試劑，其特征在于所述緩沖液的PH值為3.0-5. O。
5.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的液體單試劑，其特征在于所述的緩沖液選自甘氨酸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液中的任意一種或多種。
6.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的液體單試劑，其特征在于所述的表面活性劑是非離子型表面活性劑。
7.按照權(quán)利要求6所述的液體單試劑，其特征在于所述的非離子型表面活性劑是Tween20> Tween80> Triton X-100 或 Brij 35 中的任意一種或多種。
8.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的液體單試劑，其特征在于所述的穩(wěn)定劑為醇類有機(jī)溶劑。
9.按照權(quán)利要求8所述的液體單試劑，其特征在于所述的醇類有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙二醇、異丙醇、丙三醇或聚乙二醇中的任意一種或多種。
10.一種制備權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述液體單試劑的制備方法，其特征在于，包括 (1)按所述用量取各成分； (2)將各成分溶解于蒸餾水中，定容，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測α-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑及其制備方法。所述液體單試劑包括緩沖液、乙二胺四乙酸、NaCl、表面活性劑、穩(wěn)定劑和氯化對硝基苯α-L-巖藻吡喃糖苷。本發(fā)明液體試劑中的穩(wěn)定劑不僅能夠有效提高液體單試劑的穩(wěn)定性,還能夠和表面活性劑相協(xié)同有效消除樣品肝素的干擾，從而提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏性。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測α-L-巖藻糖苷酶的液體單試劑分別在42℃保存3天，37℃保存14天和2-8℃保存18個(gè)月后，各項(xiàng)性能均保持穩(wěn)定，表明本發(fā)明液體單試劑穩(wěn)定性良好且能夠抵抗樣本中至少100KU/L的肝素干擾。
文檔編號G01N21/31GK102967571SQ20121056879
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司