專利名稱：用于快速檢測(cè)atp的熒光共振體系的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和快速診斷檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及用于快速檢測(cè)ATP的熒光共振體系的制備方法，適用于低濃度ATP的快速檢測(cè)以及細(xì)胞生物學(xué)線粒體功能等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三磷酸腺苷(ATP)存在于從微生物到高等動(dòng)植物細(xì)胞所有的生物體中。ATP在細(xì)胞體內(nèi)主要作用是提供能量，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖和核酸的代謝，是機(jī)體能量的重要來(lái)源，在維持生物體的正常機(jī)能上有著無(wú)可替代的作用。ATP作為最重要的能量分子在細(xì)胞的各種生理、病理過(guò)程中起著重要作用，可作為細(xì)胞活性的一個(gè)重要標(biāo)志物。ATP也常作為微生物污染的一個(gè)指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)ATP含量，可以檢測(cè)食品、水、啤酒、藥品、化妝品等樣品中的微生物含量，從而反應(yīng)出其受污染的程度。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成ATP的主要場(chǎng)所，通過(guò)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP含量的改變，可以評(píng)價(jià)多種藥物、生物制劑或生物活性物質(zhì)引起的細(xì)胞殺傷、細(xì)胞抑制和細(xì)胞增殖作用。傳統(tǒng)的ATP檢測(cè)方法有生物發(fā)光法、高效液相色譜法和同位素示蹤法等。其中高效液相色譜法操作復(fù)雜且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)；同位素示蹤法雖檢測(cè)靈敏度較高，但污染較大限制其應(yīng)用。采用生物發(fā)光方法是目前較為流行的方法之一，該方法基于螢火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly Luciferase)催化熒光素氧化，消耗ATP，發(fā)出光子的高效發(fā)光反應(yīng)，具有發(fā)光效率極高、發(fā)光量與ATP含量呈很好的線性關(guān)系的特點(diǎn)，而ATP含量是螢光素氧化反應(yīng)中的限制因素，光的強(qiáng)度與樣品中所含的ATP量成正比，需利用高靈敏度的儀器測(cè)定光的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。而目前眾多的ATP檢測(cè)方法多適用于體外ATP檢測(cè)，對(duì)活細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP的檢測(cè)涉及較少。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足、提高ATP檢測(cè)的靈敏度以及實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP的適時(shí)監(jiān)控，本發(fā)明的目的在于提供用于快速檢測(cè)ATP的熒光共振體系的制備方法，利用ATP與其配體鏈(aptamer)的特異性結(jié)合原理，利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)QDs與配對(duì)熒光染料的熒光強(qiáng)度比值變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的快速檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，用于快速檢測(cè)ATP的熒光共振體系的制備方法，包括以下步驟:步驟一:準(zhǔn)備一種Cy3突光標(biāo)記的ATP-aptamer適配體，ATP-aptamer適配體為3’ _Cy3 修飾的 DNA 適配體，其序列信息為:5’ -ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3_3’ ；步驟二:將QDs與ATP-aptamer適配體互補(bǔ)鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng),得到QDs-分子探針，QDs為羧基表面水溶性量子點(diǎn)(COOH-QDs)，濃度為IuM ；ATP適配體互補(bǔ)鏈為5’-NH2- (CH2) 12修飾的 DNA，其序列信息為:5’ -NH2- (CH2) 12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT_3’ (ProbeDNA，DNAp)；
步驟三:將步驟2得到的QDs-分子探針與Cy3熒光標(biāo)記的ATP適配體反應(yīng)，得到ATP適配體與互補(bǔ)鏈相互作用后的用于檢測(cè)ATP的熒光共振體系。本發(fā)明采用能量共振轉(zhuǎn)移原理，以帶有熒光染料Cy3標(biāo)記的ATP適配體與量子點(diǎn)標(biāo)記的ATP適配體互補(bǔ)鏈，通過(guò)雜交反應(yīng)形成雙鏈，構(gòu)建能量共振轉(zhuǎn)移體系。利用ATP與ATP適配體特異性識(shí)別結(jié)合的原理，以量子點(diǎn)為能量供體，Cy3為能量受體進(jìn)行能量共振轉(zhuǎn)移，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度比值改變。在無(wú)ATP存在的條件下，與QDs偶聯(lián)的ATP適配體互補(bǔ)鏈與Cy3標(biāo)記的ATP適配體形成雙鏈進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，QDs熒光下降，Cy3熒光增強(qiáng)；當(dāng)有ATP存在時(shí)，ATP與ATP適配體特異性識(shí)別，雙鏈解體，能量共振轉(zhuǎn)移體系降低或消失，QDs熒光增強(qiáng)，Cy3熒光降低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的快速檢測(cè)。本發(fā)明利用了 ATP與其配體鏈(aptamer)特異性結(jié)合的特點(diǎn)，結(jié)合能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的快速檢測(cè)，為ATP的體外檢測(cè)監(jiān)控提供了一種新的方法本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種快速、高靈敏度檢測(cè)ATP的體系。以QDs標(biāo)記的DNA-aptamer為分子探針，利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理，通過(guò)檢測(cè)QDs與配對(duì)熒光染料的熒光強(qiáng)度比值變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP進(jìn)行定量檢測(cè)，可以提高ATP檢測(cè)靈敏度、縮短檢測(cè)時(shí)間，降低成本。


圖1為偶聯(lián)反應(yīng)原理示意圖。圖2為熒光共振體系反應(yīng)原理示意圖。圖3為QDs發(fā)射譜和Cy3激發(fā)譜示意圖。圖4為偶聯(lián)雜交后終產(chǎn)物QDs-DNAp-Cy3進(jìn)行熒光光譜掃描得到的譜圖。圖5為熒光共振體系可用于檢測(cè)ATP原理示意圖。圖6是對(duì)于不同濃度的ATP系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖7是根據(jù)圖6的光譜數(shù)據(jù)，計(jì)算的體系在檢測(cè)不同濃度的atp時(shí)候的響應(yīng)結(jié)果。圖8是在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以顯示整個(gè)系統(tǒng)的線性范圍。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附體對(duì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)原理和工作原理做詳細(xì)敘述。用于快速檢測(cè)ATP的熒光共振體系的制備方法，包括以下步驟:步驟一:準(zhǔn)備一種Cy3突光標(biāo)記的ATP-aptamer適配體；ATP_aptamer適配體為3’-Cy3修飾的DNA適配體，濃度為0.2uM_luM，其序列信息為:5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3，；步驟二:將QDs與ATP-aptamer適配體互補(bǔ)鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng),得到QDs分子探針，QDs為羧基表面水溶性量子點(diǎn)(COOH-QDs)，濃度為IuM ；ATP適配體互補(bǔ)鏈為5’-NH2- (CH2) 12修飾的 DNA，濃度為 10-500uM，其序列信息為:5’-NH2-(CH2) 12_ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’ (Probe DNA, DNAp)。步驟三:將步驟2得到的QDs分子探針與Cy3熒光標(biāo)記的ATP適配體反應(yīng)，得到ATP適配體與互補(bǔ)鏈相互作用后的用于檢測(cè)ATP的熒光共振體系。本發(fā)明中，偶聯(lián)反應(yīng)按如下方法制備，原理示意詳見(jiàn)圖1:將COOH-QDs加入到反應(yīng)器中，300rpm, 5min,震蕩混勻；加入計(jì)算好用量的EDC溶液和sulfo-NHS (10mg/mL, IOmM硼酸鹽緩沖液，pH7.4)活化30min ;加入計(jì)算好用量的DNAp,繼續(xù)震蕩混合均勻，300rpm,室溫反應(yīng)2h (若室溫較低，可將攪拌式加熱器的溫度調(diào)至25°C)。反應(yīng)結(jié)束，用0.22 μ m針頭式濾器將樣品過(guò)濾，或者12000rpm離心3min除團(tuán)聚；用超濾管將樣品濃縮純化5次，每次濃縮比不小于10，終產(chǎn)物(QDs-DNAp)復(fù)溶于適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)偶聯(lián)物緩沖液中。反應(yīng)用量:
權(quán)利要求
1.用于快速檢測(cè)ATP的熒光共振體系的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:準(zhǔn)備一種Cy3突光標(biāo)記的ATP-aptamer適配體,ATP-aptamer適配體為3’_Cy3修飾的 DNA 適配體，其序列信息為:5’ -ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’ ； 步驟二:將QDs與ATP-aptamer適配體互補(bǔ)鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng),得到QDs-分子探針，QDs為羧基表面水溶性量子點(diǎn)(COOH-QDs)，濃度為IuM ；ATP適配體互補(bǔ)鏈為5’ -NH2-(CH2) 12修飾的 DNA，其序列信息為:5’-NH2-(CH2) 12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’ (Probe DNA,DNAp)； 步驟三:將步驟2得到的QDs-分子探針與Cy3熒光標(biāo)記的ATP適配體反應(yīng)，得到ATP適配體與互補(bǔ)鏈相互作用后的用于檢測(cè)ATP的熒光共振體系。
全文摘要
用于快速檢測(cè)ATP的熒光共振體系的制備方法，包括以下步驟步驟一準(zhǔn)備一種Cy3熒光標(biāo)記的ATP-aptamer適配體；步驟二將QDs與ATP-aptamer適配體互補(bǔ)鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到QDs分子探針；步驟三將步驟2得到的QDs分子探針與Cy3熒光標(biāo)記的ATP適配體反應(yīng)，得到ATP適配體與互補(bǔ)鏈相互作用后的用于檢測(cè)ATP的熒光共振體系。本發(fā)明利用了ATP與其配體鏈(aptamer)特異性結(jié)合的特點(diǎn)，結(jié)合能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的快速檢測(cè)，并且實(shí)現(xiàn)了對(duì)線粒體內(nèi)ATP濃度變化的實(shí)時(shí)監(jiān)控，為ATP的體外及體內(nèi)檢測(cè)監(jiān)控提供了一種新的方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103207166SQ20121057003
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者李政, 彭年才, 劉小龍 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)