一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途。該單克隆抗體是由保藏于CGMCC保藏號(hào)為CGMCC?No.6606的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體；該制備方法通過(guò)克隆煙曲霉蛋白的基因；將克隆的基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析，得到純化的該煙曲霉蛋白的重組蛋白；用該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞系，從中篩選出分泌該煙曲霉蛋白抗體最穩(wěn)定、抗體活性最高的雜交瘤細(xì)胞株，它們所產(chǎn)生的抗體即為所需的單克隆抗體；該單克隆抗體可制備曲霉病診斷試劑。該單克隆抗體的具有高度特異性和強(qiáng)親和力，制備方法簡(jiǎn)單高效。
【專利說(shuō)明】一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程、細(xì)胞工程和曲霉病的免疫診斷領(lǐng)域，涉及一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]近期研究證明，以測(cè)定真菌抗原、抗體和循環(huán)代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)的血清學(xué)診斷方法潛力較大[1~4]。曲霉在體內(nèi)發(fā)生侵襲性感染時(shí)，由孢子狀態(tài)延伸生長(zhǎng)成菌絲，此時(shí)向體液中釋放菌絲蛋白，并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。鑒于曲霉感染的這個(gè)特征，一般認(rèn)為，血循環(huán)中抗原或特異抗體水平上升，預(yù)示著菌絲體延伸和/或曲霉感染的發(fā)展。由于曲霉蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，而且基礎(chǔ)疾病、前期用藥不同的病人其機(jī)體處于不同免疫狀態(tài)，導(dǎo)致體內(nèi)曲霉抗原、抗體種類和量也有差別[5~8]。因此，作為實(shí)驗(yàn)室診斷用的目標(biāo)抗原和抗體，應(yīng)該選擇在不同免疫狀態(tài)的病人罹患侵襲性曲霉病時(shí)，在其體內(nèi)優(yōu)勢(shì)大量表達(dá)、并能夠強(qiáng)烈刺激人體產(chǎn)生抗體的曲霉蛋白質(zhì)抗原組分。
[0003]我們用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)法篩選煙曲霉免疫優(yōu)勢(shì)抗原時(shí)[9]，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與確診侵襲性曲霉病(IA)血清發(fā)生強(qiáng)免疫反應(yīng)的新的煙曲霉蛋白，即硫氧還蛋白還原酶GliT (TR)，分子量約36.2KDa。用SignalP軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TR帶有信號(hào)肽(signalP probability, 0.808) ；WoLF PSORT 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示 TR 為胞外蛋白(Query Protein WoLFPSORTprediction:extr, 12.0; cyto, 6.5 ；cyto_nucl, 4.0 ；mito, 3.0 ；pero, 2.0);用 BLAST 程序進(jìn)行同源性分析顯示，TR與人源性蛋白質(zhì)沒(méi)有同源性，與其他真菌蛋白質(zhì)的同源性也很低，如與白念珠菌蛋白質(zhì)的同源性為25%，熱帶念珠菌25%，光滑念珠菌24%，季也蒙念珠菌27%，釀酒酵母菌24%，馬爾尼菲青霉27%[1°]，是一個(gè)理想的診斷標(biāo)志物。TR可以作為煙曲霉的特異性抗原用于曲霉病尤其是IA的血清學(xué)診斷。
[0004]為此，我們克隆表達(dá)了該蛋白，并建立了 ELISA法來(lái)檢測(cè)血清中的ant1-TR水平，結(jié)果顯示，煙曲霉孢子感染一周后即出現(xiàn)ant1-TR抗體陽(yáng)性，且抗體滴度快速上升。檢測(cè)血清ant1-TR抗體在免疫功能相對(duì)正常的非粒缺IPA患者中診斷的敏感性和特異性為80.9%和96%，明顯優(yōu)于現(xiàn)有試劑盒GM的檢測(cè)(43.5%，p < 0.05) [10]。而聯(lián)合檢測(cè)ant1-TR抗體和抗原TR，可明顯提高檢測(cè)的敏感性。
[0005]因此，制備出特異性識(shí)別煙曲霉TR蛋白、且與之高親和力結(jié)合的單克隆抗體，用于配制診斷曲霉病的試劑組合物，是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
[0006]參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提供一種針對(duì)煙曲霉TR的單克隆抗體。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該單克隆抗體的制備方法。
[0019]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供該單克隆抗體在制備曲霉病診斷試劑中的應(yīng)用。
[0020]一種煙曲霉蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6606的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
[0021]本發(fā)明的單克隆抗體應(yīng)理解為可以是IgG或IgM，也可以是該抗體的Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈抗體等，其抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征。
[0022]分泌本發(fā)明所述單克 隆抗體的雜交瘤細(xì)胞Ant1-TRl，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.6606，保藏時(shí)間為2012年9月24日。
[0023]可通過(guò)實(shí)質(zhì)上通用的基因重組技術(shù)，獲得煙曲霉TR基因工程蛋白用于動(dòng)物的免疫接種和篩選、鑒定抗體的抗原，但本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)載體pET_28a( + )，使目的基因的表達(dá)最有效，最易于純化。[0024]本發(fā)明所述的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0025]首先用基因工程技術(shù)制備煙曲霉TR蛋白:從煙曲霉菌絲中提取TR基因(SEQ IDN0.1)，對(duì)該基因進(jìn)行克隆，并構(gòu)建攜帶該基因的原核細(xì)胞表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌高效表達(dá)重組TR蛋白。再用獲得的該基因工程蛋白接種小鼠，待動(dòng)物體內(nèi)對(duì)重組TR蛋白形成免疫應(yīng)答后，從該動(dòng)物體內(nèi)提取脾淋巴細(xì)胞，與能在體外無(wú)限增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞系，從該細(xì)胞系中篩選出所有能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞株。對(duì)產(chǎn)生抗體的這些細(xì)胞株進(jìn)行反復(fù)篩選和單克隆化培養(yǎng)，采用ELISA法對(duì)分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，采用Western印跡法、免疫組織化學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)法以及阻斷試驗(yàn)對(duì)所制備的單克隆抗體的特異性進(jìn)行了鑒定，優(yōu)選出抗體親和力最強(qiáng)，特異性最高的單克隆細(xì)胞株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6606，該雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體即為本發(fā)明的單克隆抗體。[0026]一種用于診斷曲霉病的試劑組合物，該組合物含有作為活性成分的有效量的上述單克隆抗體。
[0027]本發(fā)明所述的單克隆抗體在制備曲霉病診斷試劑中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞系在制備曲霉病診斷試劑中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明的有益效果:
[0030]首先，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該抗體能特異性結(jié)合于煙曲霉的TR蛋白，該抗體也能特異性結(jié)合于人或動(dòng)物組織中煙曲霉的TR蛋白，包括釋放到外周血中的TR蛋白。
[0031]本發(fā)明單克隆抗體的具有高度特異性和強(qiáng)親和力，能用于診斷曲霉病的檢測(cè)試劑制備。
[0032]本發(fā)明所制備的單克隆抗體可適用于檢測(cè)曲霉病病人的體液中的TR蛋白，以幫助判斷真菌的類型。
[0033]本發(fā)明所制備的單克隆抗體適用于檢測(cè)病人病變組織中曲霉表達(dá)的TR蛋白，以幫助判斷真菌的類型。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1:RT_PCR擴(kuò)增煙曲霉TR DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖
[0035]其中:M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照2.RT-PCR產(chǎn)物。
[0036]圖2:瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒PMD18-T/TR的酶切鑒定圖
[0037]其中:M，DNAmarker ;1，pMD18_T/TR 質(zhì)粒雙酶切；2，pMD18_T/TR 質(zhì)粒
[0038]圖3:TR基因的DNA測(cè)序分析。
[0039]圖4:重組TR的SDS-PAGE分析圖
[0040]其中:1，誘導(dǎo)的pET28a ( + )/TR菌體超聲破碎上清；2，未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌；3，純化的重
[0041]組蛋白質(zhì)；M,蛋白質(zhì)分子量marker。
[0042]圖5:重組TR蛋白的質(zhì)譜鑒定圖譜及肽段匹配情況
[0043]其中:A，重組TR蛋白的質(zhì)譜鑒定圖；B，與TR匹配的肽段(黑體標(biāo)示)
[0044]圖6:ffestern blot印跡鑒定TR單克隆抗體的特異性[0045]圖7 JsoStrip小鼠單克隆抗體亞類(型)測(cè)定結(jié)果。
[0046]圖8:TR單克隆抗體與曲霉的間接免疫熒光分析圖:抗TR單克隆抗體與煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉的TR發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。
[0047]圖9:1A兔模型肺組織免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖之一:IA兔模型肺組織中曲霉菌絲表達(dá)的TR與抗TR單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，菌絲染成黃褐色。
[0048]圖10:1A兔模型肺組織免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖之二:IA兔模型肺組織中曲霉菌絲表達(dá)的TR與抗TR單克隆抗體的反應(yīng)被游離的TR蛋白所阻斷，未出現(xiàn)黃褐色菌絲。
[0049]圖11:1A患者肺組織免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖之一:IA患者肺組織中曲霉菌絲表達(dá)的TR與抗TR單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，菌絲染成黃褐色。
[0050]生物材料保藏信息
[0051]Ant1-TRl，分類命名為分泌抗曲美硫氧還蛋白還原酶GliT(TR)單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.6606，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2012年9月24日。
【具體實(shí)施方式】
[0052]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0053]實(shí)施例1:煙曲霉蛋白TR基因的克隆及原核表達(dá)
[0054]要制備TR單克隆抗體，首先要進(jìn)行TR基因的克隆和原核表達(dá)，為制備TR單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。我們利用RT-PCR法和T/A克隆策略，從煙曲霉菌絲中克隆TR基因，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切鑒定后，進(jìn)行DNA測(cè)序(SEQ ID N0.1)0然后，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET_28a (+)/TR,經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)重組TR，鈷離子親和層析純化重組蛋白。
[0055]1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本:煙曲霉菌絲
[0056]1.2制備TR雙鏈cDNA片段
[0057]1.2.1引物設(shè)計(jì)
[0058]用Primer5分析軟件設(shè)計(jì)，PCR引物序列如下:
[0059]TR 上游引物(primerl):5' ~CACACATATGTCGATCGGCAAACTAC~3' (SEQ ID N0.2)(劃線處為Nde I酶切位點(diǎn))
[0060]TR 下游引物(primer2):5 ' ~ACTGAATTCCTATAGCTCCTGATCGAGACG~3 ' (SEQ IDN0.3)(劃線處為EcoR I酶切位點(diǎn))。
[0061]1.2.2煙曲霉總RNA的提取
[0062]取50mg煙曲霉菌絲放入研缽中，立即加入適量的液氮，在菌絲呈凍結(jié)狀態(tài)下充分研磨，使之成為粉末狀，緊接著轉(zhuǎn)移至含Iml Trizol RNA提取液的離心管中，顛倒混勻，室溫放置15分鐘。加入0.2ml氯仿，充分混勻，4°C 12000rpm離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上層無(wú)色水相至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘。4°C 12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml75%乙醇，渦旋振蕩，4°C 7500rpm離心5分鐘。棄上清，用50 μ IDEPC (焦碳酸二乙酯)處理水溶解RNA沉淀，8g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取的效果，將標(biāo)本RNA溶液凍存在_70°C冰箱待用。[0063]1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0064]總反應(yīng)體系(20 μ I)組成如下:
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種煙曲霉蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6606的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征。
3.分泌權(quán)利要求1所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞Ant1-TRl，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6606，保藏日期為2012年9月24日。
4.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: a、克隆煙曲霉的一種蛋白的基因； b、將克隆的煙曲霉蛋白的基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體； C、將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)異丙基硫代_β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)獲得該煙曲霉蛋白高效表達(dá)產(chǎn)物，再經(jīng)親和層析，得到純化的該煙曲霉蛋白的重組蛋白； d、用純化的該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,建立雜交瘤細(xì)胞系； e、從上述雜交瘤細(xì)胞系中篩選分泌該煙曲霉蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選出最穩(wěn)定、抗體活性最高的細(xì)胞株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6606，該雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體即為權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述煙曲霉蛋白的基因是用逆轉(zhuǎn)錄PCR法從煙曲霉mRNA中擴(kuò)增出煙曲霉硫氧還蛋白還原酶的cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述表達(dá)載體優(yōu)選pET_28a (+ )ο
7.一種用于診斷曲霉病的試劑組合物，其特征在于所述的試劑組合物含有作為活性成分的有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備曲霉病診斷試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞系在制備曲霉病診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103897060SQ201210579111
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】史利寧, 李芳秋 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院