專利名稱：基于紙的細胞陣列的制作方法
基于紙的細胞陣列本申請是2009年3月27日提交的200980110195.2號發(fā)明專利申請“基于紙的細胞陣列”的分案申請。
_2] 相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年3月27日提交的美國臨時專利申請N0.61/040，030、2008年3月27日提交的美國臨時專利申請N0.61/040，010、2008年9月17日提交的美國臨時專利申請N0.61/097，718及2009年I月22日提交的美國臨時專利申請N0.61/146，413的權(quán)利,其全部內(nèi)容通過弓I用整體并入本文。
背景技術(shù)：
細胞在體內(nèi)位于作為部分組織和器官結(jié)構(gòu)的組織化三維環(huán)境中。所述組織機化的損失為癌癥的特征(Wodarz, et al., Nature CelIBiology9:1016-1024(2007) ;Lee, etal.，J.CellSc1.121:1141-1150(2008);Morrison, et al.，Nature441:1068-1074(2006))。近一個世紀以來，在生物體外(離體)培養(yǎng)的細胞上進行的研究已推動了癌癥研究和抗癌制劑發(fā)現(xiàn)的進展(Ebeling, J.Exp.Med.17:273-285 (1913) ; Carrel, et al., J.Exp.Med.13:387-U34(1911);Carrel, et al., J.Exp.Med.13:571-575(1911);Leighton, CancerRes.17:929-941(1957) ;Paul, Cancer Res.22:431_&(1962))。用二維表面上培養(yǎng)的細胞進行了大多數(shù)的所述研究。已廣泛認識到在所述條件下培養(yǎng)的細胞和體內(nèi)的細胞間的形態(tài)和功能差異，且已顯示三維細胞生長基質(zhì)呈現(xiàn)出體內(nèi)細胞環(huán)境的更生理相關(guān)模型(Yamada，etal., Cell130:601-610(2007);Nelson,et al., Annu.Rev.Cell Dev.Biol.22:287-309 (2006);Huang, etal., Nature cell biologyl:E131_E138(1999);Schmeichel, et al., J.CellSc1.116,2377-2388(2003))。重要的是，在二維基質(zhì)上培養(yǎng)的細胞通常不應(yīng)答影響三維環(huán)境中細胞的可溶性因子(Emerman, et al., In Vitro-Journal of the Tissue CultureAssociationl3:316-328 (1977) ; Emerman, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.74:4466-4470(1977);Cukierman, et al., Science294:1708-1712 (2001);Bissel1，et al., Differentiation70:537-546 (2002) ; Weaver, et al., J.Cell Biol.137:231-245 (1997))。然而，迄今為止，大多數(shù)藥物發(fā)現(xiàn)過程始于基于二維培養(yǎng)的測定中的小分子篩選。在動物和人體試驗中已鑒定的化合物的失敗迫使藥物發(fā)現(xiàn)的花費至>10億美元/新化合物(Griffith, etal., Nat.Rev.Mo 1.Cell Biol.7:211-224(2006))?；谌S培養(yǎng)物的高通量測定允許在藥物發(fā)現(xiàn)過程的第一步中進行藥物有效性和毒性的評估。將三維細胞培養(yǎng)物并入基礎(chǔ)和應(yīng)用癌癥研究的每方面將促進用于癌癥治療的新療法的發(fā)現(xiàn)。三維環(huán)境與二維環(huán)境中細胞應(yīng)答的不同源自于細胞極性、基質(zhì)粘附位點的細胞廣泛分布及細胞對所述基質(zhì)機械特性應(yīng)答的不同(Yamada, et al,.2007;Huang, etal.，1999)。在分子水平上，通過整合素信號通路與其酪氨酸激酶受體間的交叉感知調(diào)控所述事件?；|(zhì)的化學(xué)組成、整合素配體的納米和微米級分布之類的特性(Cukierman, etal., 2001; Chen, et al., Science276:1425-1428 (1997))及基質(zhì)的機械特性(Engler, et a1.，Cel1126:677-689 (2006) ;Pelham, et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.94:13661-13665 (1997) ; Yeung, et al., Cell Moti1.Cytoskeleton60:24-34 (2005))可影響所述通路和調(diào)節(jié)細胞行為。此外，通過擴散驅(qū)使對凝膠樣基質(zhì)中細胞的氧和營養(yǎng)物質(zhì)傳遞。因此，基質(zhì)的結(jié)構(gòu)尺寸也在三維細胞培養(yǎng)中起作用。由于擴散的限制，在離體三維基質(zhì)中細胞的增殖通常為低于幾百微米的深度所限制。因此，在三維培養(yǎng)中必須小心控制所述基質(zhì)的大小、組成和機械特性。在二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)并行發(fā)展的數(shù)十年后，二維培養(yǎng)方法的簡單性使其成為細胞離體研究的主導(dǎo)技術(shù)。控制所述基質(zhì)的多種化學(xué)和物理特性的需要使細胞的三維培養(yǎng)有更高的勞動密集性和更低的再現(xiàn)性。發(fā)明概沭一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了三維細胞陣列。所述細胞陣列包括含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛的多孔親水基質(zhì)及含細胞的水凝膠，其中所述水凝膠被嵌入所述多孔區(qū)內(nèi)。在一實施方式中，所述基質(zhì)是:紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。在一實施方式中，所述水凝膠是溫度敏感性水凝膠。在特定的實施方式中，所述溫度敏感性水凝膠為基質(zhì)膠或膠原蛋白。在一些實施方式中，所述水凝膠是離子型水凝膠。在特定的實施方式中，所述離子型水凝膠包含:海藻酸(AA)、羧甲基纖維素(CMC)、叔卡拉膠、聚(半乳糖醒酸)(PG)、聚(雙(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。在其他的實施方式中，所述不透液界面包含:PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。在某些實施方式中，所述陣列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1，000或更多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在特定的實施方式中，所述陣列包含96、384、1536或3456個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在一些實施方式中，所述細胞是:細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了制備三維細胞陣列的方法。所述方法包括:提供多孔親水基質(zhì)，其中所述基質(zhì)含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛；及使所述多孔親水基質(zhì)與細胞和溫度敏感性水凝膠或離子型水凝膠前體的懸浮液接觸，其中所述懸浮液浸透所述基質(zhì)的一個或多個多孔區(qū)。在一實施方式中，所述基質(zhì)是:紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。在一實施方式中，所述水凝膠是溫度敏感性水凝膠。在特定的實施方式中，所述溫度敏感性水凝膠為基質(zhì)膠或膠原蛋白。在一些實施方式中，所述水凝膠是離子型水凝膠。在特定的實施方式中，所述離子型水凝膠包含:海藻酸(AA)、羧甲基纖維素(CMC)、叔卡拉膠、聚(半乳糖醒酸)(PG)、聚(雙(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。在一實施方式中，所述方法還包括在使所述細胞的懸浮液與所述基質(zhì)接觸前，用膠凝劑潤濕(例如浸透)所述基質(zhì)。在一些實施方式中，所述膠凝劑為金屬離子。在特定的實施方式中，所述膠凝劑為:Pb2+、Ba2+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Ho3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+ 或Mg2+。在一些實施方式中，所述不透液界面包含:PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹月旨、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。在某些實施方式中，所述陣列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1，000或更多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在特定的實施方式中，所述陣列包含96、384、1536或3456個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在一些實施方式中，所述細胞是:細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了制備三維細胞陣列的方法。所述方法包括:提供多孔親水基質(zhì)；使所述基質(zhì)的多個指定區(qū)與包含細胞和溫度敏感性水凝膠或離子型水凝膠前體的懸浮液接觸，其中所述懸浮液浸透所述基質(zhì)的多個指定區(qū)；及使所述溫度敏感性水凝膠或所述離子型水凝膠前體與膠凝劑接觸，其中所述膠凝劑誘導(dǎo)被嵌入所述基質(zhì)的多個指定區(qū)的水凝膠的形成。在一實施方式中，所述基質(zhì)是:紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。在一實施方式中，所述水凝膠是溫度敏感性水凝膠。在特定的實施方式中，所述溫度敏感性水凝膠為基質(zhì)膠或膠原蛋白。在一些實施方式中，所述水凝膠是離子型水凝膠。在特定的實施方式中，所述離子型水凝膠包含:海藻酸(AA)、羧甲基纖維素(CMC)、叔卡拉膠、聚(半乳糖醒酸)(PG)、聚(雙(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。在一實施方式中，所述方法還包含在使所述細胞的懸浮液與所述基質(zhì)接觸前，用膠凝劑潤濕(例如浸透)所述基質(zhì)。在一些實施方式中，所述膠凝劑為金屬離子。在特定的實施方式中，所述膠凝劑為:Pb2+、Ba2+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Ho3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+ 或Mg2+。在一些實施方式中，所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。在一些實施方式中，所述方法還包含使所述陣列與培養(yǎng)基接觸。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了鑒定修飾細胞功能的制劑的方法。所述方法包括:提供本文所述的陣列；使所述陣列與一種或多種測試制劑接觸；及檢測在所述一種或多種測試制劑存在下的一種或多種細胞功能；其中在所述一種或多種測試制劑存在下細胞功能的變化指示所述一種或多種測試制劑修飾細胞功能。在一些實施方式中，陣列包括含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛的多孔親水基質(zhì)及含細胞的水凝膠，其中所述水凝膠被嵌入所述多孔區(qū)內(nèi)。在一實施方式中，所述基質(zhì)是紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。在一實施方式中，所述水凝膠是溫度敏感性水凝膠。在特定的實施方式中，所述溫度敏感性水凝膠為基質(zhì)膠或膠原蛋白。在一些實施方式中，所述水凝膠是離子型水凝膠。在特定的實施方式中，所述離子型水凝膠包含:海藻酸(AA)、羧甲基纖維素(CMC)、叔卡拉膠、聚(半乳糖醒酸)(PG)、聚(雙(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。在其他的實施方式中，所述不透液界面包含:PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。在某些實施方式中，所述陣列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1，000或更多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在特定的實施方式中，所述陣列包含96、384、1536或3456個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在某些實施方式中，所述陣列于多個多孔區(qū)與所述一種或多種測試制劑接觸。在特定的實施方式中，所述陣列于96、384、1536或3456個多孔區(qū)與所述一種或多種測試制劑接觸。在一些實施方式中，各多孔區(qū)與不同測試制劑接觸。在一些實施方式中，所述測試制劑是小的有機或無機分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。在一些實施方式中，所述測試制劑是測試試劑庫(例如組合化學(xué)品庫)的成員。在其他的實施方式中，所述細胞功能是增殖、遷移、活力或基因轉(zhuǎn)錄。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了鑒定修飾細胞功能的制劑的方法。所述方法包括:提供本文所述的三維陣列；將所述基質(zhì)切成多個區(qū)段，各區(qū)段具有相等尺寸；使各區(qū)段與測試制劑或?qū)φ战佑|；及檢測在所述測試試劑存在下的一種或多種細胞功能，其中在所述測試制劑存在下細胞功能的變化指示所述測試制劑修飾細胞功能。在一些實施方式中，所述細胞功能是增殖、遷移、活力或基因轉(zhuǎn)錄。在一些實施方式中，各區(qū)段被放置進96孔、384孔、1536孔或3456孔板的孔中。在一些實施方式中，各孔包含不同的測試試劑。在一些實施方式中，所述測試制劑是有機或無機小分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。在一些實施方式中，所述測試制劑是測試試劑庫(例如組合化學(xué)品庫)的成員。在一些實施方式中，所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了三維微陣列。所述微陣列包含:具有多個孔的無底微孔板及含多個多孔區(qū)和多個不透液界面，各多孔區(qū)被不透液界面束縛的多孔親水基質(zhì)；其中所述孔和所述不透液界面以相同的圖案排列，所述微孔板和所述基質(zhì)附著，由此所述多個孔對齊，且密封連接至所述多個不透液界面，以形成針對各多孔區(qū)的單個室。在一些實施方式中，所述基質(zhì)的所述多孔區(qū)在水凝膠中包含細胞。在一實施方式中，所述水凝膠是溫度敏感性水凝膠。在特定的實施方式中，所述溫度敏感性水凝膠為基質(zhì)膠或膠原蛋白。在一些實施方式中，所述水凝膠是離子型水凝膠。在特定的實施方式中，所述離子型水凝膠包含:海藻酸(AA)、羧甲基纖維素(CMC)、叔卡拉膠、聚(半乳糖醒酸)(PG)、聚(雙(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。在其他的實施方式中，所述不透液界面包含:PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。在某些實施方式中，所述陣列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1，000或更多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在特定的實施方式中，所述陣列包含96、384、1536或3456個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在一些實施方式中，所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了鑒定修飾細胞功能的制劑的方法。所述方法包括:提供微陣列，其包含具有多個孔的無底微孔板及含多個多孔區(qū)和多個不透液界面，各多孔區(qū)被不透液界面束縛的多孔柔性基質(zhì)；其中所述孔和所述不透液界面以相同的圖案排列，所述微孔板和所述基質(zhì)附著，由此所述多個孔對齊，且密封連接至所述多個不透液界面，以形成針對各多孔區(qū)的單個室；使所述陣列與一種或多種測試試劑接觸；及檢測在所述測試試劑存在下的一種或多種細胞功能，其中在所述一種或多種測試制劑存在下細胞功能的變化指示所述一種或多種測試制劑修飾細胞功能。在一些實施方式中，所述測試制劑是有機或無機小分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。在一些實施方式中，所述測試制劑是測試試劑庫(例如組合化學(xué)品庫)的成員。在一些實施方式中，各孔包含不同的測試試劑。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了圖案修飾多孔疏水基質(zhì)的方法，所述方法包括:使多孔疏水基質(zhì)與含水溶性化合物的水溶液接觸，所述溶液浸潤所述基質(zhì)以形成浸透所述溶液的所述基質(zhì)的第一區(qū)和不與所述溶液接觸的第二區(qū)；使所述基質(zhì)與疏水材料接觸，所述疏水材料浸透所述第二區(qū)；及除去所述水溶性化合物，產(chǎn)生被所述疏水材料束縛的親水多孔區(qū)。在一些實施方式中，所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖或甘油。在一些實施方式中，所述水溶液被點斑、打印、畫或蓋印在所述多孔疏水基質(zhì)上。在特定的實施方式中，所述溶液用噴墨打印機打印。在其他一些實施方式中，所述疏水材料包含:PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。在某些實施方式中，所述基質(zhì)被圖案修飾為1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1，000或更多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被疏水材料束縛。在特定的實施方式中，所述基質(zhì)被圖案修飾為96、384、1536或3456個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在一些實施方式中，所述基質(zhì)是:硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素紙、濾紙、布或多孔聚合物膜。另一方面，本發(fā)明展現(xiàn)了圖案修飾多孔疏水基質(zhì)的方法，所述方法包括:使多孔疏水基質(zhì)與疏水材料接觸，所述疏水材料浸透所述基質(zhì)；使所述基質(zhì)區(qū)與含水溶性化合物的水溶液接觸，所述溶液從所述區(qū)置換所述疏水材料；及除去所述水溶性化合物，產(chǎn)生被所述疏水材料束縛的親水多孔區(qū)。在一些實施方式中，所述水溶性化合物是:蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖或甘油。在一些實施方式中，所述水溶液被點斑、打印、畫或蓋印在所述多孔疏水基質(zhì)上。在特定的實施方式中，所述溶液用噴墨打印機打印。在其他一些實施方式中，所述疏水材料包含:PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。在某些實施方式中，所述基質(zhì)被圖案修飾為1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1，000或更多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被疏水材料束縛。在特定的實施方式中，所述基質(zhì)被圖案修飾為96、384、1536或3456個多孔區(qū)，各多孔區(qū)被不透液界面束縛。在一些實施方式中，所述基質(zhì)是硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素紙、濾紙、布或多孔聚合物膜。在一些方面中，在無水凝膠的情況下，本文所述陣列可包括被嵌入多孔親水基質(zhì)內(nèi)的細胞。


當與附圖一起閱讀時，可從下列描述更全面理解本發(fā)明的上述和其他目的、它們的各種特征及本發(fā)明本身，其中圖1A是示使用空白紙的三維細胞陣列的制備的示意圖，而圖1B是示使用被圖案修飾為親水區(qū)和疏水區(qū)的紙的制備的示意圖。圖1C是用HS-5基質(zhì)細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液點斑，并用綴合Alexa Fluor633的鬼筆環(huán)肽染色的層析紙的代表性掃描圖像的拼接圖。圖1D是來自圖1C的4 6個測量結(jié)果的平均值的坐標圖，且誤差棒相當于一個標準差。圖1E是被點斑至經(jīng)SU8圖案修飾的紙上、在培養(yǎng)基中懸浮24小時、固定且用SYTOX染料染色的HUVEC細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液的凝膠掃描儀圖像。圖1F是來自圖1E的4 6個測量結(jié)果的平均值的坐標圖。圖2A是通過用碳水化合物的水溶液預(yù)處理所述紙而將疏水材料圖案修飾至紙上(“甜水圖案修飾(sweet patterning)”)的過程示意圖。圖2B是用鹿糖、PDMS、然后覓菜紅水溶液處理的紙的數(shù)字表示。圖2C是用蔗糖、聚苯乙烯、然后莧菜紅水溶液處理的紙的數(shù)
子表不O圖3A是用各種化合物、PDMS、然后莧菜紅水溶液處理的紙的數(shù)字表示。圖3B是用各種化合物、PDMS、然后莧菜紅水溶液處理的紙的數(shù)字表示。圖3C是用各種化合物、聚苯乙烯、然后莧菜紅水溶液處理的紙的數(shù)字表示。(使用的縮寫:n/s-未溶解；n/d-未測定)圖4A是“甜水圖案修飾(sweet patterning)”的示意圖。圖4B是用PDMS、鹿糖、然后莧菜紅水溶液處理的紙的數(shù)字表示。圖5A和5B是使用噴墨打印機用蔗糖圖案修飾的紙的數(shù)字表示。圖5C是使用自來水筆用蔗糖圖案修飾的紙的數(shù)字表示。圖是蓋印蔗糖圖案至紙上的示意圖和用蔗糖圖案修飾的紙的數(shù)字表示。圖6描繪了使用用包含細胞的水凝膠滲透的數(shù)張疊加的紙的三維細胞陣列進行(A)細胞遷移、(B)交叉遷移和侵入及(C)三維共培養(yǎng)的研究的示意圖。圖7A、7B和7C是描繪分層測定與對影響三維生長基質(zhì)中細胞增殖和遷移的小分子進行的高通量篩選的整合的示意圖。圖8A是描繪微孔篩選格式與三維細胞陣列的整合的示意圖。圖SB是紙中或具有基質(zhì)膠的紙中的3T3細胞增殖的坐標圖。圖9描繪了在包含基質(zhì)膠的三維細胞陣列中生長的各種細胞類型的坐標圖和共聚焦圖像。將4yL (圖9A 9D)或IuL (圖9E 9H)細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液(IO7細胞/mL)點斑到空白濾紙上，且在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中懸浮所述紙。在指定的時間點，從培養(yǎng)基中除去所述細胞陣列并用甲醛固定。在時間過程的最后，用經(jīng)熒光標記的鬼筆環(huán)肽對全部樣品進行染色，并使用熒光凝膠掃描儀和ImageJ進行定量。各數(shù)據(jù)點為4個測量結(jié)果的平均值，誤差棒相當于一個標準差。圖10是在二維和三維紙細胞陣列上的HUVEC細胞中各種基因的相對表達水平的坐標圖。圖1lA是不用于研究HUVEC細胞的二維遷移的兩步方案的不意圖。圖1lB是在各種條件下隨時間的HUVEC細胞遷移的凝膠掃描儀圖像。圖12A是使用包含BHK細胞的紙和微孔板的病毒感染測定的示意圖。圖12B是從包含紙支持的基質(zhì)膠基質(zhì)中被感染的BHK細胞的96孔板讀取發(fā)光的坐標圖。圖13A是被點斑至濾紙上且在各種條件下生長的基質(zhì)膠中的PC12細胞的凝膠掃描儀圖像。圖13B是被點斑至濾紙上且在各種條件下生長的基質(zhì)膠中的PC12細胞增殖的坐標圖。圖14描繪了在經(jīng)基質(zhì)膠(“2D”)薄層、允許膠化以形成基質(zhì)膠包裹的細胞的PC12細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液(“3D”)，或滲透入紙內(nèi)的PC12細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液(“紙”)包被的表面上平鋪的PC12細胞的NGF誘導(dǎo)分化的定量PCR分析的坐標圖。圖15A是描繪了用細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液滲透疊加的多層紙以研究在營養(yǎng)和氧有限條件下的細胞增殖的示意圖。圖15B描繪了培養(yǎng)7天后8層的HUVEC細胞疊加物的層中細胞密度的掃描圖像和定量。用綴合Alexa Fluor633的鬼筆環(huán)肽對細胞進行染色，使用凝膠掃描儀進行成像并使用ImageJ進行分析。在所有層中的灰度強度以在第一天的細胞灰度強度進行標準化。豎的紅線和藍虛線分別標明第7天和第I天非疊加層中細胞的染色強度。所有的數(shù)據(jù)點是8個測量結(jié)果的平均值，且誤差棒相當于一個標準差。圖15C和D是頂層中在第7天形成的腔和8層的HUVEC細胞疊加物的底層中小腔的網(wǎng)絡(luò)的共聚焦圖像。用AF488-鬼筆環(huán)肽對細胞進行染色。圖15E是培養(yǎng)9天后6層的HDF成纖維細胞疊加物的層中細胞密度的定量的坐標圖。圖15F是培養(yǎng)9天后8層的MR-90成纖維細胞疊加物的層中細胞密度的定量的坐標圖。圖15G是培養(yǎng)9天后8層的HS-5骨髓基質(zhì)細胞疊加物的層中細胞密度的定量的坐標圖。圖15H是培養(yǎng)9天后8層的MDA-MB-231疊加物的層中細胞密度的定量的坐標圖。圖151描繪了在8堆增殖9天的MDA-MB-231細胞中代謝活性(I丐黃綠素染色)、總肌動蛋白(Texas Red鬼筆環(huán)肽染色)、總DNA (sytox染色)和增殖細胞(Click-1TEdU 染色)的總數(shù)量及低氧標記物的表達水平(針對VEGF和IGFBP3的定量PCR)的定量。圖16A是為研究細胞是否可在基質(zhì)膠滲透的紙的各層間遷移而設(shè)計的實驗的示意圖。將細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液和無細胞的基質(zhì)膠點斑至紙條上。折疊和緊貼所述紙，在底部放置醋酸纖維素板，并培養(yǎng)所述疊加物9天。(B)細胞在各層間遷移的方向的示意草圖。箭標指示細胞至鄰近板的遷移；遷移可發(fā)生在更接近主體培養(yǎng)基溶液的覆蓋層(紅色箭標)或離主體培養(yǎng)基更遠的下層(藍色箭標)。(C)包含培養(yǎng)9天的HDF細胞的未折疊紙的代表性圖像。用甲醛固定所述紙，用AF647鬼筆環(huán)肽進行染色并使用熒光凝膠掃描儀進行成像。(D) HDF細胞遷移的定量分析。向主體溶液的遷移在除了最底層的所有層中占優(yōu)勢。所得結(jié)果為4個實驗的平均值。誤差棒相當于一個標準差。使用兩尾、兩樣本不等方差t檢驗來獲得P值:*p〈0.05 ; 〃p〈0.01。(E)HDF細胞遷移的定量分析。向主體溶液的遷移在除了最底層的所有層中占優(yōu)勢。所得結(jié)果為5個實驗的平均值。誤差棒相當于一個標準差。*ρ〈0.05 ；**ρ<0.01。圖17Α是示使用疊加的三維細胞陣列來分析細菌培養(yǎng)物的示意圖。圖17Β是在各層中死亡的銅綠假單胞菌ΡΑ14細胞的數(shù)量的坐標圖。圖17C是在各層中活的銅綠假單胞菌ΡΑ14細胞的數(shù)量的坐標圖。圖18Α是具有可通過疊加有洞(“wH”)和沒有洞(“woH”)的材料板創(chuàng)建的孔的平板的示意圖。圖18B是在夾在圖18A所示的“wH”和“woH”層之間的經(jīng)圖案修飾的紙上接種的細胞的示意圖。圖18C描繪了包含一層含有細胞的經(jīng)圖案修飾的紙的系統(tǒng)。不同“孔”中紙中的細胞可暴露于不同溶液。圖18D是示遷移測定的示意圖。圖18E描繪了無底96孔板。圖18F描繪了被圖案修飾為疏水區(qū)和親水區(qū)內(nèi)的紙。圖18G描繪了平坦的底部表面。圖18H描繪了在圖18E、18F和18G中所述元件的組合，產(chǎn)生了每個孔都包含一層紙和每個孔可接觸不同溶液的96孔平臺。圖19A是允許篩選不同幾何形狀的3D培養(yǎng)物的平臺的示意圖?？墒褂么┛准埖寞B加物來創(chuàng)建在其中具有通道腔的3D結(jié)構(gòu)。圖19B是所述穿孔紙之一的照片。圖19C是與不銹鋼容器一起壓的8張穿孔紙的疊加物的照片。不同孔中紙支持的培養(yǎng)物具有不同的3D幾何形狀。圖19D是一個所述“幾何形狀篩選”的結(jié)果。在提高了厚度(頂部箭標)或提高了“腔”大小(底部箭標)的MDA-MB-231細胞疊加物中研究細胞的代謝活性(由鈣黃綠素染色確定)和細胞的總數(shù)量(由肌動蛋白染色測量)。圖19E是來自一些3D幾何形狀的結(jié)果，其為具有由2、4或6層“紙中的洞”(其在3D培養(yǎng)物的中間有效創(chuàng)建了 400、800或1200微米的缺口(“腔”))分離的6、4或2層的3D培養(yǎng)物。發(fā)明詳沭將所有出版物、專利申請、專利或本文提及的其他文獻通過引用整體并入本文。此外，所述材料、方法和例子僅為解說性的而不認為是限制性的。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的任一普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管可在本發(fā)明的實踐和測試中使用類似于或相當于本文所述的方法和材料，合適的方法和材料如下所述:總述本發(fā)明至少部分基于以三維紙為基礎(chǔ)的細胞陣列的制備和使用。用于三維細胞培養(yǎng)物獨特特征產(chǎn)生的微制造基質(zhì)難以被采用，因為許多細胞生物學(xué)研究組缺乏用于微制造的專業(yè)知識或設(shè)備(例如，潔凈室)。另外，許多微制造技術(shù)很適合于研究少量細胞，但其難以被用于大規(guī)模的測定和篩選。在基于三維細胞的測定中的突破取決于允許三維基質(zhì)所需的全部特性的控制的簡單和可升級技術(shù)。可使用本文所述方法來制備所述三維基質(zhì)。三維細朐陣列在某些情況下，本公開內(nèi)容提供了能生長和維持細胞的三維細胞陣列。所述細胞陣列包括多孔柔性基質(zhì)和嵌入基質(zhì)內(nèi)的包含細胞的水凝膠。在圖1A和IB中示意性的顯示了例示三維細胞陣列。如圖1A和IB所示，三維細胞陣列1300包括在基質(zhì)1330、1340內(nèi)的區(qū)域或“孔”1310、1320。所述孔在被注入基質(zhì)多孔網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的三維水凝膠1350內(nèi)包含細胞。所述基質(zhì)提供了所述細胞可位于的3D支架。如本文所述，可通過使用圖1A和IB所示的施加器1360使所述細胞在水凝膠或水凝膠前體中的懸浮液接觸(例如點斑)基質(zhì)。當所述基質(zhì)是多孔和親水的，通過基質(zhì)的厚度及細胞懸浮液經(jīng)基質(zhì)1330吸走或橫向擴散的距離指定孔1310的尺寸(見圖1A)。因為當液體和凝膠被點斑至紙或其他多孔親水基質(zhì)時其產(chǎn)生所確定橫向尺寸的斑，可通過將確定量的細胞在水凝膠前體中的懸浮液點斑至多孔親水基質(zhì)獲得所需橫向尺寸的三維細胞培養(yǎng)物?？赏ㄟ^控制被點斑的液體體積來控制所述斑的橫向尺寸(即三維培養(yǎng)物的橫向尺寸)。通過親水材料的厚度確定三維培養(yǎng)物的垂直尺寸(厚度)。點斑過程的重復(fù)在單獨的一張紙上產(chǎn)生了圖案修飾的三維培養(yǎng)物(即細胞陣列)。進行所述點斑以便通過存在的細胞培養(yǎng)物和篩選界面輕易識別所得圖案(例如通過點斑具有4.5mm縱向和橫向間距的斑的16X24陣列生成384孔的布局)。當所述基質(zhì)被圖案修飾(例如包含親水區(qū)和疏水區(qū))時，如圖1B中基質(zhì)1340所示的，通過基質(zhì)的厚度和基質(zhì)親水區(qū)的大小指定孔1320的尺寸(見圖1B)。在所述實施方式中，通過疏水性屏障或孔1370束縛親水區(qū)，其限制細胞懸浮液的橫向流動。在使細胞和水凝膠或水凝膠前體的懸浮液與基質(zhì)接觸后，在允許水凝膠在基質(zhì)內(nèi)凝膠化的合適條件下維持所述基質(zhì)。如本文所述，合適的條件包括在特定的溫度下維持所述基質(zhì)或使所述基質(zhì)與膠凝劑接觸。所得的三維細胞陣列是穩(wěn)定的且可在適于細胞生長的條件中被維持。本領(lǐng)域已知所述培養(yǎng)條件(見例如Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Techniques, Freshney, R.1.ed., (Alan R.Liss&C0., New Yorkl987);Animal CellCulture:A Practical Approach, Freshney, R.1.ed., (IRL Press, Oxford, Englandl986)X例如，可使細胞陣列浸入適于特定細胞類型的細胞培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)箱中維持。圖1C是描繪圖1A的三維細胞陣列1300的一系列圖像。在圖1C所示的例示陣列中，用手持的Gilson PlO移液管將I 5μ L在基質(zhì)膠中懸浮的HS-5細胞點斑至層析紙1330上。使用不同濃度的細胞懸浮液來改變每個點斑區(qū)域的細胞數(shù)量。可使點斑的紙浸入37°C的培養(yǎng)基24小時。然后用甲醛固定所述紙，用綴合Alexa Fluor633的鬼筆環(huán)肽進行染色并使用Typhoon凝膠掃描儀進行成像。所示圖像為各點斑區(qū)代表性掃描圖像的拼接圖。使用ImageJ進行圖像的定量?？刂泣c斑量允許細胞填充區(qū)域橫向尺寸的調(diào)節(jié)。如圖1C所示,通過點斑I 5μ L基質(zhì)膠懸浮液制備具有2 8mm直徑的細胞填充區(qū)域1350。改變點斑溶液中的細胞濃度，同時保持細胞生長區(qū)域橫向尺寸的恒定。通過測量掃描圖像(圖1D中所示)中包含細胞區(qū)域的灰度強度來評估紙中的細胞密度。如圖1C所證明，細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液的點斑允許確定厚度和橫向尺寸的三維基質(zhì)的重復(fù)性生成，其存在良好確定的細胞數(shù)量。此外，可使用常規(guī)的凝膠掃描儀快速定量紙支持的基質(zhì)中的細胞密度。圖1E是描繪圖案修飾的基質(zhì)1340上圖1B的三維細胞陣列1300的圖像。在圖1E所示的例示陣列中，使用標準的熒光和比色技術(shù)顯示嵌入細胞陣列所述孔中的細胞。將熒光凝膠掃描儀用于定量鑒定。當用SYTOX染料對細胞進行染色時確定在圖案修飾基質(zhì)1340的區(qū)域1350中的細胞數(shù)量(見圖1F)?？捎啥嗫子H水基質(zhì)制造本文所述的細胞陣列。在一些實施方式中，所述基質(zhì)是紙，例如層析紙。然而，可使用通過毛細作用吸走流體的任何基質(zhì)，其包括但不限于:硝酸纖維素和醋酸纖維素、纖維素紙、過濾紙、布及多孔聚合物膜。紙的許多物理參數(shù)使其成為用于支持細胞三維培養(yǎng)的有吸引力的候選物:(I)紙是廉價、無毒、惰性多孔基質(zhì)；(2)良好確定厚度(>20μπι)的平整紙張在世界范圍內(nèi)是易得的；(3)可將紙圖案修飾為親水區(qū)和疏水區(qū)；水溶液可輕易接受親水區(qū)的尺寸；(4)所述紙的機械特性可被改變；及(5)紙可被輕易做成、分層或折成不同的形式。基于所述特性，紙可充當天然或合成的細胞粘著水凝膠的模具?？蓪⒓堄脼榻邮?，或無需引入疏水性壁來確定所述孔。當水凝膠吸入紙內(nèi)時，通過紙的所述特性指定水凝膠的大小和厚度(見例如圖1Α)。在一些情況下，使用圖案修飾基質(zhì)(例如經(jīng)圖案修飾的紙)制備所述三維細胞陣列。因為液體和凝膠可輕易吸進紙基質(zhì)內(nèi)，圖案修飾具有不透(疏水)液界面的所述紙可被用來規(guī)定細胞生長基質(zhì)的物理尺寸和形狀。因此，在一些實施方式中，將所述基質(zhì)圖案修飾為疏水區(qū)和親水區(qū)。可使用圖案修飾親水基質(zhì)的任何方法。舉例而言，可將疏水層直接施加于多孔基質(zhì)以使用打印(如由噴墨打印機)、液體輸送(如用蓋印)或其他打印方法或絲網(wǎng)印刷法產(chǎn)生具有親水或疏水特性的圖案修飾區(qū)。也可使用光刻法制備疏水圖案，其中所述紙充滿光刻膠，然后暴光以產(chǎn)生疏水光刻膠的區(qū)域和去除親水抗性的紙的區(qū)域。例示方法為本領(lǐng)域已知和在例如W02008/049083中所述，其通過引用整體并入本文。制造所述經(jīng)圖案修飾的紙基質(zhì)的例示方法包括光圖案修飾技術(shù)，其中用商用的光反應(yīng)性聚合物(例如SU8)浸透紙，并覆蓋存在于所需圖案中的透明物質(zhì)，且將所述紙短暫暴露于UV光。當用適當?shù)娜軇?例如丙酮)洗滌時，從產(chǎn)生所需圖案的暴露區(qū)域去除所述聚合物。本文所述的另一例示方法為“甜水圖案修飾”。在某些實施方式中，使用水溶性化合物(如糖或它們的衍生物(例如多元醇，例如木糖醇))圖案修飾本文所述的基質(zhì)。所述方法源于觀察即疏水性溶液不能滲入充滿水溶液的紙的區(qū)域。相反地，疏水溶劑形成紙內(nèi)的互補圖案(見例如圖2A)。因此，可將親水基質(zhì)的一部分與水溶性化合物接觸，其浸潤多孔基質(zhì)以形成用包含水溶性化合物的水溶液浸透的特異形狀區(qū)。也可使用水之外的溶劑，其可使極性化合物溶解且不能與相應(yīng)的疏水溶劑混合。然后可使所述基質(zhì)與疏水材料接觸，其浸透所述基質(zhì)的暴露區(qū)域，但不滲入水浸透的區(qū)域。疏水材料可包含聚合物或聚合物前體，其可被處理以設(shè)置或固化所述聚合物，例如通過加熱、蒸發(fā)或光聚合。隨后可從親水基質(zhì)去除所述水溶性化合物，留下了由疏水材料界定的親水多孔區(qū)。在某些實施方式中，所述水溶性化合物為蔗糖(例如在水溶液中)。在其他的實施方式中，所述疏水材料為例如PDMS、聚苯乙烯或在用來產(chǎn)生疏水溶液的溶劑中可溶的其他任何疏水材料。在一些實施方式中，通過例如點斑、打印、畫或蓋印使所述基質(zhì)與水溶性化合物接觸。在基于常規(guī)噴墨打印的圖案修飾策略中，通過打印蔗糖溶液至紙上來創(chuàng)建所需疏水圖案的反面。然后將所述紙浸入充滿無蔗糖區(qū)的聚苯乙烯(或其他聚合物)溶液。用水洗滌后，去除蔗糖模板并獲得所需的親水-疏水圖案。圖2A示意性的說明了用水溶液320 (例如水溶性化合物的水溶液(例如蔗糖水溶液))圖案修飾親水多孔基質(zhì)310 (例如紙)的一種方法。在所述實驗中，將蔗糖水溶液點斑至紙上，其在紙中形成水溶液浸透區(qū)330。然后將所述紙浸入疏水溶液340內(nèi)。疏水溶液是在不能與水溶液混合的疏水溶劑中的任何聚合物的溶液。例如，疏水溶液可包含聚合物前體(例如PDMS)或聚合物(例如聚苯乙烯、PLGA)。所述兩種不能混合的液相在多孔基質(zhì)上分離以提供含水區(qū)330和疏水區(qū)350。由于相分離，疏水溶液不修飾被水溶液點斑的紙的區(qū)域?？商幚硭鍪杷芤阂栽O(shè)置或固化所述聚合物，例如通過加熱、蒸發(fā)或光固化。然后(例如用水)可沖走所述蔗糖，產(chǎn)生用疏水材料圖案修飾的紙。因此產(chǎn)生的基質(zhì)包括親水未修飾的紙360和疏水修飾的紙370的區(qū)域。在多孔基質(zhì)內(nèi)不能混合的液體可互為模板:在基質(zhì)上親水圖案的周圍疏水溶劑形成互補的形狀。盡管圖2A中的示意圖說明了用水溶性化合物預(yù)處理所述基質(zhì)和隨后用疏水材料處理所述基質(zhì)，在其他的實施方式中，可用疏水材料預(yù)處理所述基質(zhì)和隨后用水溶性化合物處理所述基質(zhì)(見例如圖4)。其在圖4中被說明，其中基質(zhì)被完全浸入疏水溶液以制備疏水基底510。疏水溶液包括如上所述的聚合物。在所述例子中，將水溶液520點斑至紙上，其在紙中形成了水溶液浸透區(qū)530。在疏水溶液中水溶液是不能混合的，且其在疏水基底510中形成了含水區(qū)530?？扇缟纤鎏幚硭龌|(zhì)以提供包括親水未修飾的紙和疏水修飾的紙的區(qū)域的基質(zhì)(未顯示)?？墒褂么罅恳阎夹g(shù)的任一個來向所述基質(zhì)施加所述水溶性化合物以制備親水模板。例如，可通過點斑、打印、畫或蓋印來施加水溶性化合物的水溶液(見例如圖5和實施例11)。打印技術(shù)是已知的且其包括噴墨打印機、自來水筆等的使用。也可通過畫(如絲網(wǎng)印刷法、刮膠法等)施加水溶液。對于蓋印技術(shù)，印可由已知材料(例如橡膠、金屬和紙)制成，并被設(shè)計來保持和轉(zhuǎn)移所需量的液體(見，例如圖5D)。也可在本文所述的方法中使用向基質(zhì)施加液體、墨水、溶劑和染料等的其他已知方法。所述施加可通過手工或使用機器(例如自動化系統(tǒng))。本文所述的方法可利用任何水溶性化合物。所述化合物包括例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖、甘油和其他水溶性碳水化合物及至少與上文所列的一樣可溶的它們的衍生物?？墒褂美绫疚膶嵤├?所述的測定來確定在給定的基質(zhì)上及與給定的疏水材料一起使用的水溶性化合物的適當濃度。在一些實施方式中，水溶性化合物在非極性有機溶劑中是不溶的。在一些實施方式中，水溶性化合物是無機鹽。可使用本文所述的基于總體相分離的圖案修飾技術(shù)來用許多類型的疏水材料圖案修飾紙。例如，所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂或聚苯乙烯?？墒褂玫钠渌杷牧习ǖ幌抻谠谟袡C溶劑中可溶(例如聚苯乙烯和其衍生物、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體(例如SU8)、蠟和脂肪)和/或通過在例如20 70°C由有機溶劑縮聚作用的聚合制備(例如PDMS、聚氨酯和環(huán)氧樹脂衍生物、酚醛聚合物或丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯衍生物)的任何塑料。水凝膠可通過使基質(zhì)與吸入親水基質(zhì)的水凝膠或水凝膠前體接觸來制備本文所述細胞陣列。在某些實施方式中，在向所述基質(zhì)施加所述前體后形成水凝膠。與本文所述的圖案修飾和非圖案修飾多孔基質(zhì)一起使用所述水凝膠?？稍诒疚乃龅姆椒ㄖ惺褂萌魏我阎乃z。水凝膠基質(zhì)如例如美國專利N0.5，906，934、Lin et al., Advanced Drug Delivery Rev.58:1379-1408 (2006)及 Jenet al., Biotechnology and Bioengineering50:357_364 (2000)所述?？稍诒疚乃龇椒ㄖ惺褂镁酆衔?，其可形成韌性的離子型或共價交聯(lián)的水凝膠。本文所用“水凝膠”是當經(jīng)共價、離子或氫鍵交聯(lián)聚合物以產(chǎn)生捕獲水分子來形成凝膠的三維開放格子結(jié)構(gòu)時形成的物質(zhì)。所述聚合物可為有機聚合物。所述聚合物可為天然或合成的聚合物。本文所用“水凝膠前體”為經(jīng)共價、離子或氫鍵交聯(lián)以形成水凝膠的聚合物。用來形成水凝膠的材料的例子包括:多糖(如海藻酸鹽)、聚膦嗪和聚丙烯酸脂(其被離子交聯(lián))或嵌段共聚物(如Pluronics 或Tetronics )、聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物(其分別通過溫度或PH被交聯(lián))。其他的材料包括蛋白(如纖維蛋白)、聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、透明質(zhì)酸和膠原蛋白。一般而言，所述聚合物在水溶液(如水、緩沖鹽溶液或醇水溶液、具有帶電側(cè)基的或它們的一價離子鹽)中至少是部分可溶的。具有可與陽離子反應(yīng)的酸性側(cè)基的聚合物的非限制性例子包括:聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙酯)、磺化聚合物(如磺化聚苯乙烯)。其他非限制性例子包括例如:海藻酸(AA)、羧甲基纖維素(CMC)、叔卡拉膠、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(丙烯酸)(PAA)和聚(雙(4-羧基苯氧基)-磷腈。也可使用具有由丙烯酸或甲基丙烯酸與乙烯醚單體或聚合物反應(yīng)形成的酸性側(cè)基的共聚物。酸性基的非限制性例子包括:羧酸基、磺酸基、鹵代醇基、酚OH基和酸OH基。具有可與陰離子反應(yīng)的堿性側(cè)基的聚合物的非限制性例子包括:聚(乙烯胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)及一些亞胺基取代的聚磷腈。也可由主鏈氮或懸掛式亞胺基形成聚合物的銨或季銨鹽。堿性側(cè)基的非限制性例子包括:氨基和亞氨基。本文所用“膠凝劑”為交聯(lián)水凝膠前體以形成水凝膠的任何試劑。例如膠凝劑可經(jīng)共價、離子或氫鍵交聯(lián)水凝膠前體以形成水凝膠。例如，通過所述聚合物與包含相反電荷膠凝劑(例如相反電荷的多化合價離子)的水溶液發(fā)生反應(yīng)來離子交聯(lián)具有帶電側(cè)基的水溶性聚合物。在一些實施方式中，所述聚合物具有酸性側(cè)基，且所述膠凝劑為多化合價陽離子。在一些實施方式中，所述聚合物具有堿性側(cè)基，且所述膠凝劑為多化合價陰離子。在一些實施方式中，所述膠凝劑為陽離子，例如Pb2+、Ba2+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Ho3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+ 或 Mg2+、Sr2+、Gd3+、Pb2+、Ra2+、Fe2+、Pd2+、Bi' Hg2+、Au' Co2+、Co' Cr2+、Cr3+、Mn4+、Pt2+、Pt4+、Sn2+、Sn4+、Ce3+、Ce4+、Ga3+、V3+ 或 Rh3+。在其他的實施方式中，所述水凝膠為溫度敏感性水凝膠(如基質(zhì)膠或膠原蛋白)，且通過提高基質(zhì)溫度至適當水平(如37°C)誘導(dǎo)凝膠化。通過將所述基質(zhì)浸入適當溫度的溶液內(nèi)(例如適于特定細胞類型的培養(yǎng)基內(nèi))維持所述溫度。溫度敏感性水凝膠為本領(lǐng)域已知且為商業(yè)易得的。MM用細胞并同時用陽離子溶液和/或水凝膠聚合物裝載本文所述陣列。在一些實施方式中，在使所述陽離子溶液和/或水凝膠聚合物與所述基質(zhì)接觸后用細胞裝載所述陣列。在基于紙的細胞陣列中生長的細胞可為任何原核或真核細胞。所述細胞包括例如:細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Cvl細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞或PC12細胞)。其他例示細胞包括來自下列屬成員的細胞:埃希氏菌屬、桿菌屬、乳桿囷屬、紅球囷屬、假單胞囷屬、曲霉屬、木霉屬、鏈抱霉屬、鍵刀囷屬、腐殖囷屬、根毛霉屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、毛霉菌屬、毀絲霉(Myceliophtora)屬、青霉屬、白腐真菌屬(Phanerochaete)、側(cè)耳屬、槐耳屬、黃小孢子屬(Chrysosporium)、酵母屬、裂殖酵母屬、子囊菌酵母屬(Yarrowia)或鏈霉菌。其他的細胞包括:⑶90+/⑶45-肝腫瘤干細胞。在某些情況下，可用一種或多種表達載體或病毒載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述細胞。多層細胞陣列在某些實施方式中，可制造基于多層紙的細胞陣列?？赏ㄟ^疊加數(shù)層本文所述的任何三維細胞陣列制備所述陣列。例如，可疊加兩個或更多個紙陣列(各陣列由包含細胞的水凝膠滲透)以制備多層陣列。在一個或多個實施方式中?？捎靡粋€或多個包含細胞的紙陣列覆蓋包含無細胞水凝膠的一個或多個紙陣列以達到多層陣列。在一個或多個實施方式中，一層或多層可包含試劑，例如化學(xué)試劑，例如化學(xué)引誘物。例如，可在包含化學(xué)引誘物的紙板的頂部上疊加大量包含水凝膠的紙板，且在所述疊加物的頂部放置包含細胞的紙板。使用本文所述的三維細胞陣列進行本領(lǐng)域已知的任何基于細胞的測定。例如，可在篩選影響細胞功能(如細胞活力、凋亡、增殖、遷移和基因表達)的試劑中使用本文所述的三維細胞陣列。測試試劑可被添加至所述細胞陣列，可被吸附或被共價連接至水凝膠或基質(zhì)(例如紙)，或也可被包括在基質(zhì)(例如紙)上包被的生物降解性基質(zhì)中。在一些情況下，使三維細胞陣列接觸測試試劑，并使用例如本文所述的測定來確定細胞目的特征(例如活力、凋亡、增殖、遷移或基因表達)。在所述測試試劑存在下細胞目的特征相對于對照(例如所述測試試劑不存在的情況)的改變指示所述測試試劑調(diào)節(jié)細胞功能。
在某些情況下，所述測試試劑被包含在孔(例如微孔板的孔)內(nèi)，且使三維細胞陣列接觸所述孔中的所述測試試劑。例如，所述測試試劑存在于微孔板孔內(nèi)的培養(yǎng)基中，且可使所述細胞陣列接觸(例如浸沒于)包含所述測試試劑的所述培養(yǎng)基。在一些情況下，可在使所述細胞陣列與所述測試試劑接觸之前和之后測量細胞的特征。在一些實施方式中，可將細胞陣列切成多個區(qū)段(例如條、塊、盤、球)，且可將區(qū)段放置在微孔板的各孔中?？蓪⒒诙鄬蛹埖年嚵杏糜诜治龈鞣N細胞特征，例如遷移、裝配和增殖。例如，可將疊加的層用于三維液體引導(dǎo)(Martinez et al., Proc Natl Acad Sci U SA.105:19606-11(2008))。在一些實施方式中，可使用基于紙疊加物的陣列作為遷移測定的平臺。可在多層疊加系統(tǒng)中建立氧和營養(yǎng)物質(zhì)的擴散梯度。因此，相同的測定格式提供了便利的系統(tǒng)來模擬實體瘤的內(nèi)部環(huán)境。在一些實施方式中，可研究內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞(EPC) (Asaharaet al.，Science275, 964-967(1997))和乳腺癌細胞向血管生成因子、向營養(yǎng)物質(zhì)、氧或向化學(xué)引誘物的板間遷移。例如可使用基質(zhì)膠中包含乳腺癌細胞的板和包含沒有細胞的基質(zhì)膠的板的疊加來研究細胞向包含“空白”基質(zhì)膠的板的侵入?？蛇x擇包含細胞的疊加物和“空白”疊加物的特定順序以研究所述遷移的方向(見圖16)。在其他的實施方式中，當疊加的板被拆開時可輕易定量位于不同深度(層)的細胞低氧誘導(dǎo)增殖、分化或凋亡?？稍诟咄亢Y選中使用遷移和低氧測定。圖6示例示的方法，其中在包含水凝膠的紙板層上疊加用經(jīng)熒光標記的細胞接種的紙板，然后其疊在包含細胞粘附水凝膠加化學(xué)引誘物的紙上。圖6A是多層細胞陣列600的示意性說明。陣列600包括包含含細胞的孔620的多孔親水基質(zhì)610。陣列600也包括具有孔640的多孔親水基質(zhì)630?？捎媚康脑噭?例如用來篩選細胞行為的試劑)預(yù)處理孔640。陣列600也包括插入板650。插入板650是多孔親水基質(zhì)，其可包括安置在插入板650內(nèi)的水凝膠。陣列600被疊加以便親水基質(zhì)610、插入板650和親水基質(zhì)630是流體接觸的。將陣列600放置于在細胞生長合適條件下的合適培養(yǎng)基中。然后去疊加陣列600，并確定在親水基質(zhì)610、插入板650和親水基質(zhì)630內(nèi)的細胞660的數(shù)量。圖6B是另一個多層細胞陣列600的示意性說明。如圖6B所示，陣列600包括多孔親水基質(zhì)610和620，其中親水基質(zhì)610包含含細胞類型611的水凝膠，且親水基質(zhì)620包含含細胞類型621的水凝膠。所述親水基質(zhì)610和620被疊加，被放置于細胞培養(yǎng)基內(nèi)，然后被去疊加。分析親水基質(zhì)610和620中細胞類型611和細胞類型621的數(shù)量。在特定的實施方式中，去疊加后，分離的紙疊加物中的細胞保持存活，且其可被分開培養(yǎng)或使用本文所述的任何測定對其進行鑒定以與分離的紙疊加物中的細胞比較。例如，使用細胞增殖試劑(例如Alamar Blue)或熒光測定(例如鈣黃綠素染色，圖15)可定量各板中活的細胞?？晒潭ǜ鲗又械募毎⒂媒?jīng)熒光標記的試劑(例如標記DNA的SYT0X、標記F-肌動蛋白的鬼筆環(huán)肽，圖15)對其進行定量。可裂解各板中的細胞，并使用所述裂解物來測量目的基因(例如VEGF和IGFPB3，圖15)的表達水平或測量特異蛋白(例如用商業(yè)ELISA試劑盒測量低氧誘導(dǎo)因子(HIF) I和2)的細胞濃度?？蓮母靼逯忻附馊コ毎⑼ㄟ^流式細胞儀分析對其進行鑒定以評估存活、凋亡和壞死細胞的數(shù)量，及進行在各板中細胞種群的細胞周期分析。可使用熒光報告分子或細胞示蹤染料來標記各板中的細胞，及追蹤各層中各細胞的來源(圖6B)。最后，從不同的層板分離的細胞的比較轉(zhuǎn)錄譜可在實體瘤及由多層細胞組成的其他非血管化三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部發(fā)生的轉(zhuǎn)化上提供新的見解。在一些實施方式中，可使用疊加紙板中細胞的共培養(yǎng)來研究組織間的自組裝、細胞的交叉遷移和在組織樣環(huán)境中的低氧應(yīng)答。例如，可使用紙上的三維細胞培養(yǎng)物來研究內(nèi)皮細胞與周圍組織的互作，其對血管網(wǎng)絡(luò)形成及器官和腫瘤的營養(yǎng)輸送是關(guān)鍵的。也可對內(nèi)皮細胞形成的微環(huán)境進行檢查，其對多種細胞類型的增殖和分化也是關(guān)鍵的?？捎冒渌毎愋偷年嚵携B加包含細胞的紙陣列以制備共培養(yǎng)物(見例如圖6C)。在所述紙板被拆開后易于研究在所述紙板共培養(yǎng)物中兩種細胞類型的應(yīng)答。例如，可使用內(nèi)皮細胞和乳腺癌細胞共培養(yǎng)物的疊加陣列來研究組織向內(nèi)生長(例如腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤血管化)。更具體而言，可使用報告細胞系進行包含內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的紙板間細胞的交叉遷移(圖6B)?？扇缟纤龆窟w移前和遷移后各層中的細胞數(shù)量。在另一個實施例中，可在多層的三維細胞陣列中與內(nèi)皮細胞和乳腺癌細胞一起共培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞(EPC)。已知體內(nèi)的EPC與血管內(nèi)皮互作，且其經(jīng)受了作為歸巢至缺血性或受傷組織的第一步的跨血管內(nèi)皮遷移。相反地，EPC分泌因子增強血管化，并促進預(yù)存在的內(nèi)皮細胞中的遷移應(yīng)答(Urbich, et al.，Circ.Res.95:343-353(2004))?？蓪PC放置于基于紙的基質(zhì)中，然后用包含內(nèi)皮細胞和乳腺癌細胞的層疊加以研究在內(nèi)皮細胞-EPC共培養(yǎng)物中的長期反應(yīng)。可研究所述細胞應(yīng)答血管生成因子和氧濃度梯度的交叉遷移?？墒褂肊PC和共培養(yǎng)的細胞類型的表達譜和流式細胞儀分析來鑒定它們的不同狀態(tài)(圖6C)。在其他情況下，可使用“細菌的多層疊加物”來分析在各種條件下的細胞生長。例如，可使用細菌的多層疊加物作為細菌生物膜的模型，其為包含多層細菌的三維結(jié)構(gòu)。生物膜各層中的細菌被暴露于不同條件(例如不同量的營養(yǎng)物質(zhì)或氧)。可使用紙中生長和疊加的細菌來模擬生物膜中存在的營養(yǎng)物質(zhì)/氧富集和限制的區(qū)?？墒褂貌煌瑢又屑毦锘瘜W(xué)組成的分析來理解在生物膜形成期間發(fā)生的細菌轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域已知生物膜內(nèi)的氧/營養(yǎng)物質(zhì)饑餓可能誘導(dǎo)細菌獲得特定表型，其或多或少顯示出對各種細胞毒性劑的易感性(K.Lewis, Nat Rev.Microbiol.2007，5，48-56)。因此，分析用不同測試試劑處理后多層細胞陣列的不同層中的細菌存活對鑒定處理細菌生物膜的試劑是有用的。一例示系統(tǒng)如圖17所示，其中多層紙中的細菌在氧/營養(yǎng)物質(zhì)易得層(層I和8)或限制層(層2 7)中。如圖17A所示，多孔疏水基質(zhì)1710浸入細菌懸浮液中。疊加和培養(yǎng)所述基質(zhì)1710。去疊加所述介質(zhì)，并分析在層1711、1712和1713中細菌的生長。圖17B描繪了來自被包括層1、2、3、4、5、6、7和8的疊加物1720的死細菌和活細菌分析。高通量篩選可將本文所述三維細胞陣列用于高通量篩選方法例如以篩選調(diào)節(jié)劑。在一些實施方式中，可用一種或多種潛在的調(diào)節(jié)劑點斑經(jīng)圖案修飾的紙(例如圖案修飾為親水區(qū)和疏水區(qū))。然后用三維細胞陣列覆蓋經(jīng)圖案修飾的紙，所述調(diào)節(jié)劑可擴散進所述陣列內(nèi)，且可評估所述調(diào)節(jié)劑對陣列內(nèi)細胞的作用。圖7示例示篩選方法。使用生物降解性聚合物(例如聚乳酸羥基乙酸、PLGA)的紙陣列中小分子的局部釋放來進行基于細胞的高通量篩選(Bailey, et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.101:16144-16149(2004))。在所述方法中，用細胞陣列覆蓋用PLGA中小分子圖案修飾的紙(圖7B)。分析所述小分子擴散對陣列內(nèi)細胞的作用。
如圖7A所示，多孔親水基質(zhì)710包括基質(zhì)710內(nèi)的區(qū)域或“孔”720。通過在基質(zhì)710上接觸特定試劑的水溶液725來形成所述孔720。如圖7B所示，包括包含細胞的三維水凝膠760的多孔親水基質(zhì)750被疊加至基質(zhì)710的頂部，其允許所述試劑擴散進基質(zhì)750?？纱_定所述試劑對細胞活性的作用。在其他實施方式中，高通量篩選包括基于多層紙的陣列。例如用小分子圖案修飾的紙板可被疊加至大量紙板上，其中一個為三維細胞陣列。可測定所述小分子對細胞特性(例如細胞遷移)的作用。例示方法如圖7C所示。圖7C描繪了多層細胞陣列700。陣列700包括親水基質(zhì)750?；|(zhì)750包括三維水凝膠760內(nèi)細胞的“孔”。陣列700也包括親水基質(zhì)710，其包括所述基質(zhì)710內(nèi)的“孔”720。所述孔720包括基質(zhì)710內(nèi)的特定試劑。陣列700也包括多孔、親水的插入板730。親水基質(zhì)710包括所述基質(zhì)710內(nèi)的“孔”720。所述孔720包括在基質(zhì)710內(nèi)的特定試劑。陣列700也包括多孔、親水的插入板730。疊加、培養(yǎng)、去疊加基質(zhì)710、插入板730和基質(zhì)760，并確定基質(zhì)710、插入板730和基質(zhì)760中細胞的數(shù)量。在特定的實施方式中，使用基質(zhì)710、插入板730和基質(zhì)760上特定位置處的細胞數(shù)量來從影響細胞行為(例如遷移、增殖或死亡)的基質(zhì)710鑒定試劑720。在一些實施方式中，可通過將包含細胞的三維紙陣列放置進微孔板內(nèi)進行高通量篩選。所述微孔板的各孔包括要待篩選的試劑，且可測定陣列內(nèi)細胞的應(yīng)答。一例示方法如圖8所示。在所述方法中，將相同大小的紙陣列分布至微孔板的各孔以確保每個孔中幾乎相等的細胞數(shù)量的遞送(圖8A)。為說明所述策略，用3T3成纖維細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液滲透2mmX4mm的濾紙，然后將其分布進96孔板的所述孔中。使用Alamar Blue來評估細胞的數(shù)量。對于來自8個獨立孔的測量結(jié)果,可觀察到少于10%的偏差，其證明嵌入三維陣列的相似細胞數(shù)量被遞送給所述孔。3T3細胞在基質(zhì)膠浸沒的紙內(nèi)而不在無基質(zhì)膠的紙內(nèi)增殖(圖8B)，且當將秋水仙素添加至所述孔時，所述增殖被停止。因此可使用所述系統(tǒng)來篩選影響三維陣列中細胞增殖的試劑。另一例示方法如圖18所示。在所述方法中，用水凝膠1830中細胞嵌入被圖案修飾為疏水區(qū)1810和親水區(qū)1820的紙陣列1800。然后使經(jīng)圖案修飾的紙1800與不透水材料的兩板1840和1850接觸。具有透洞的一張紙板1850 (命名為“wH”)形成了包含所述液體的孔1851，沒有洞的另一張紙板1840 (命名為“woH”)形成了所述孔的底部。經(jīng)圖案修飾的紙1800的疏水界面1820產(chǎn)生了不透水密封裝置1860，其防止分開的孔1851間流體的毛細管作用。然后可將所述孔1851暴露于不同溶液或試劑1852且可分析對細胞的作用。可使用上文命名為“wH”和“woH”的紙板1840和1850來創(chuàng)建不限制平板的大小、形狀或特征、洞(孔)的大小、形狀或數(shù)量或用于制備所述平板的材料和方法的篩選陣列。可通過噴射塑形法、鑄造、機械加工、激光切割、或真空板形成一個或多個樹脂制造所述板?？捎赏该骰虿煌该鞑牧现苽渌霭?。材料可為金屬、塑料、玻璃、陶瓷和優(yōu)選對細胞無毒性的不透水材料。在特定的實施方式中，命名為“wH”的板1850可包含定制的陣列或洞以創(chuàng)建孔的定制陣列，其可由為與標準微孔板一起工作而設(shè)計的儀器識別(例如可使用“《H”中洞的12X8陣列來創(chuàng)建與96孔板具有相同布局的陣列)。在特定的實施方式中，可以商業(yè)可得的無底96、384、1536和3456孔板(例如，來自Greiner Labortechnik ofFrickenhausen, Germany; and Corning Life Sciences of Acton, Massachusetts)獲得命名為“wH”的具有特異圖案的洞的板1850?？烧{(diào)整本文所述的任何多層測定以使其與無底微孔板一起使用。例如，可疊加多層的經(jīng)圖案修飾的紙并使其與“wH”和“woH”板接觸(如圖18D所示)，且各層可包含各種試劑或可被用在例如遷移測定分析中。在特定的實施方式中，在使用正常或惡性細胞和調(diào)節(jié)劑的高通量篩選中使用三維細胞陣列以鑒定促進(或抑制)細胞死亡、增殖、遷移或分化的那些。如果如本文所述使用多層紙，可評估應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的各層中的細胞死亡、增殖、遷移或分化。在其他的實施方式中，可將三維細胞陣列用于使用祖細胞和干細胞的高通量篩選。迄今為止，在二維基質(zhì)上已進行了干細胞和祖細胞的高通量篩選，而使用本文所述的細胞陣列可擴展所述方法。所述紙陣列內(nèi)細胞的三維分層模擬常用于祖細胞和干細胞生長或分化的細胞的三維聚集物。例如，稱為“胚體”的胚胎干細胞(ESC)的三維聚集物被用于ES細胞的分化，稱為“神經(jīng)球”的神經(jīng)干細胞(NSC)的三維聚集物被用于神經(jīng)干細胞的增殖和分化。在特定的實施方式中，可將ESC或NSC平鋪于細胞陣列，且可使用一層或多層的所述陣列來創(chuàng)建類似于“胚體”或“神經(jīng)球”的三維結(jié)構(gòu)的陣列。當所述陣列的各層被分離時，可研究所述結(jié)構(gòu)內(nèi)的分化。使用本文所述的任何方法進行調(diào)控所述分化的“調(diào)節(jié)劑”的篩選。不同幾何形狀的3D培養(yǎng)物的高通暈篩選可在涉及不同幾何形狀的3D培養(yǎng)物的快速產(chǎn)生和3D幾何形狀如何影響細胞特性(例如代謝活性、生長、遷移、分化)的研究的篩選方案中使用紙支持的陣列?？捎?但不限于)以下所述例示不同幾何形狀:(1)不同物理尺寸或形狀的3D培養(yǎng)物。通過疊加不同數(shù)量的板和在指定位置中包含指定大小的洞的板生成所述培養(yǎng)物。板上洞的平面排列和垂直排列確定所得培養(yǎng)物的3D尺寸和形狀(見例如圖19); (2)在特定位置具有特定機械特性的3D培養(yǎng)物?？赏ㄟ^疊加不同機械特性的板生成所述培養(yǎng)物，在所述疊加物中板的順序確定在垂直方向上機械特性 的空間位置；(3)在特定位置具有特定化學(xué)組成的3D結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^疊加包含在板不同區(qū)域中的不同水凝膠中包裹的細胞的板生成所述培養(yǎng)物，在所述疊加物中板的順序確定在垂直方向上化學(xué)特性的空間位置。橫向圖案修飾和疊加的組合允許控制X、Y和Z中的化學(xué)組成。上述的三個例子是獨立的，且可被組合使用。例如，穿孔紙的疊加物可提供具有不同機械特性的一些區(qū)域，且也可包括具有在不同組成的水凝膠中包裹的細胞的一些區(qū)域。細胞測定類型可使用本文所述的三維陣列來表征在陣列內(nèi)生長的細胞的各種特性。例如，在基于紙的陣列中細胞的定性和定量檢測是可能的，例如使用本領(lǐng)域已知的熒光顯微鏡或比色測定。某些實施方式可使用常規(guī)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，其為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知。所述技術(shù)如例如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",third edition(Sambrooket al., 2001) ;^Oligonucleotide Synthesis^(M.J.Gait,ed., 1984) ;"AnimalCell Culture"(R.1.Freshney, ed.，1987) ;"Methods in Enzymology^(AcademicPress, Inc.) ;"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel etal.,eds.,1987, and periodic updates) ;〃PCR:The Polymerase Chain Reaction",
(Mullis et al., eds., 1994)所述。凋亡測丨定可使用本領(lǐng)域已知的用于測量凋亡的任何標準測定來確定本文所述三維細胞陣列中細胞的凋亡。所述測定包括但不限于:末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的地高辛-11-dUTP 缺 口 和標記(TUNEL)測定(Lazebnik et al.1994，Nature371, 346)；熒光素-dUTP 的摻入(Yonehara et al., 1989, J.Exp.Med.169，1747);吖啶橙染色(Lucas, R.，etal., 1998, Bloodl5:4730-41);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7 測定(從 Promega, cat#67790可得的Apo-ONE 同源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7測定);及細胞死亡核小體ELISA測定(從 Roche, Cat#1774425 可得)。在一些情況下，可將測試試劑添加至本文所述的三維細胞陣列，且可使用相對于對照(未加入測試試劑)的凋亡誘導(dǎo)中的變化來鑒定調(diào)節(jié)凋亡的候選試劑。細胞增殖和細胞周期測定可使用本領(lǐng)域已知的任何方法測定本文所述的三維細胞陣列內(nèi)的細胞增殖。已知的方法包括但不限于:溴脫氧尿苷(BRDU)或5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(EdU)(圖15)摻入測定(Hoshino et al.1986, Int.J.Cancer38, 369; Campana et al., 1988, J.Tmmunol.Meth.107, 79; Click-1T EdU, Invitrogen);憐酸化組蛋白 H3 染色(Chadlee, D.N.1995, J.Biol.Chem270:20098-105) ;3[H]_ 胸苷摻入(Chen, J.，1996，0ncogenel3:1395-403; Jeoung，J.，1995，J.Biol.Chem.270:18367-73);使用 Alamar Blue 測定進行代謝活性測量(圖 15)(從 Biosource International 可得)(Voytik-Harbin S L et al., 1998, In Vitro CellDev Biol Anim34:239-46),I丐黃綠素測定(圖 15)(從 Invitrogen 可得)或 CellTitelGlo測定(從Promega可得)。從包含細胞的區(qū)域發(fā)出由特異測定產(chǎn)生的信號(熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性)，且可使用常規(guī)方法(熒光顯微鏡、熒光或發(fā)光掃描儀、磷光成像儀、凝膠成像儀等)對其進行測量。牛物化學(xué)測定可使用本文所述的三維細胞陣列分析基因表達水平。例如，可在細胞陣列內(nèi)直接裂解細胞，且可在本領(lǐng)域已知的標準測定(RNA印跡分析、核糖核酸酶保護測定或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR))中使用所述裂解物(見例如Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd ed.2001))?？墒褂靡阎娜蚪M分析技術(shù)測定三維陣列中生長的細胞在基因表達上的變化。例如，可使用AfTymetrix基因芯片 來進行轉(zhuǎn)錄組分析；可使用Illumina深度測序來進行編碼RNA和調(diào)節(jié)RNA (例如小RNA或miRNA)的分析。可將基因表達譜和調(diào)控RNA譜與離體和體內(nèi)生長的細胞的已知譜進行比較。也可通過蛋白印跡分析或免疫測定之類的方法使用從三維細胞陣列中培養(yǎng)的細胞獲得的細胞材料來分析蛋白水平。可通過已知的整體譜方法(global profilingmethods)(例如基于質(zhì)譜(例如鳥槍蛋白組學(xué)、代謝組學(xué))或NMR譜(代謝組學(xué))的方法)分析來自細胞材料的蛋白、碳水化合物和代謝物。分離的細胞分析可從本文所述的三維細胞陣列分離所述細胞且在隨后的測定中使用。例如，可在流式細胞儀分析中使用分離的細胞?？墒褂靡阎娜魏畏椒?例如酶解地)從所述陣列中分離細胞。一例示酶對纖維素基質(zhì)是反應(yīng)性的，如來自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纖維素酶。外部刺激應(yīng)答評估三維細胞陣列中生長的細胞對已知效應(yīng)器(例如增殖和形態(tài)發(fā)生的效應(yīng)器)的應(yīng)答。在一例示測定中，可評估內(nèi)皮細胞的應(yīng)答(例如管和腔的形成)。已知通過整合素-ECM互作和下游P GTP酶介導(dǎo)的通路調(diào)控所述應(yīng)答，且可輕易獲得和測試已知抑制所述進程的一組小分子和 siRNA (Koh, et al., J.Cell Sc1.121:989-1001 (2008) ;Ghosh, etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1n press, do1: 10.1073/pnas.0800835105 (2008))。測試制劑可使用本文所述的三維細胞陣列來測定任何測試試劑。“測試試劑”可為任何試齊 ，例如有機或無機小分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。所述測試試劑可為合成、天然產(chǎn)生的或者合成成分和天然成分的組合。在一些實施方式中，所述測試試劑可為測試試劑庫(例如組合化學(xué)品庫)的成員或細胞提取物或體液(例如尿液、血液、眼淚、汗水或唾液)的成分。通過下列實施例進一步說明本發(fā)明。僅以說明的目的提供所述實施例。其不被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍和內(nèi)容。
實施例實施例1:基質(zhì)膠滲透的紙內(nèi)細胞的形態(tài)和生長速度測試了在用基質(zhì)膠滲透的紙的三維基質(zhì)內(nèi)生長的許多細胞的長期生長速度。所述細胞包括原代細胞(人臍靜脈內(nèi)皮 細胞(HUVEC)、人皮膚成纖維細胞(HDF)、IMR-90人肺成纖維細胞)、永生化細胞(轉(zhuǎn)染了端粒酶的GFP-HUVEC、HS-5人骨髓基質(zhì)細胞、S16大鼠雪旺氏細胞)和癌細胞(MDA-MB-231人乳腺癌和PC-12大鼠嗜鉻細胞瘤)(圖9A G)。在紙支持的基質(zhì)膠基質(zhì)中大多數(shù)細胞的數(shù)量倍增時間顯著低于其在2D培養(yǎng)物中的倍增時間。對于S16細胞( 36小時)和PC12細胞( 48小時)，所述倍增時間是最長的，而原代HUVEC和永生化的GFP-HUVEC細胞系都顯示出很少的或沒有增殖。所述結(jié)果與觀察一致，即在三維水凝膠中懸浮的許多細胞類型比在培養(yǎng)皿的二維表面上平鋪的相同細胞增殖更慢。使用共聚焦顯微鏡來檢查在紙支持的基質(zhì)膠基質(zhì)中的細胞形態(tài)。使用人臍帶血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為模型系統(tǒng)。HUVEC在三維中顯示出獨特的形態(tài)變化即細胞形成與體內(nèi)毛細管相像的空心結(jié)構(gòu)。相反地，當在二維培養(yǎng)皿上培養(yǎng)HUVEC時其形成平板狀的單層細胞。當所述細胞被包裹在所述三維基質(zhì)內(nèi)時，已知它們的生長速度降低。將HUVEC在基質(zhì)膠中的懸浮液點斑至紙上。在7 12天所述細胞形成空心血管樣結(jié)構(gòu)。所述觀察證明在基質(zhì)膠滲透的紙中培養(yǎng)的細胞顯示出在三維基質(zhì)中生長的細胞的行為特征。成纖維細胞、基質(zhì)細胞和雪旺氏細胞經(jīng)纖維素纖維延伸，長期增殖后形成多層結(jié)構(gòu)。MDA-MB-231細胞顯示出很少的延伸并形成細胞的無組織聚集物。誘導(dǎo)在用基質(zhì)膠滲透的紙中培養(yǎng)的PC-12細胞以分化成形成三維互連神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)元樣細胞?？偟膩碚f，紙對檢查的原代和永生化細胞的形態(tài)和生理機能不具有不利作用。
實施例2:在基質(zhì)膠滲透的紙內(nèi)和在二維基質(zhì)上細胞基因表達的比較在紙中生長的細胞不同于在二維中生長的細胞。使用全基因表達譜來研究在紙上三維生長的細胞與三維生長的細胞有多相似。對在化學(xué)上相同的二維和三維系統(tǒng)上增殖的HUVEC的基因表達水平進行比較。將在二維基質(zhì)膠單層中培養(yǎng)的細胞與在基質(zhì)膠滲透的紙內(nèi)培養(yǎng)的細胞進行比較。裂解細胞，并處理以分離總RNA。分析七個候選基因在二維和三維系統(tǒng)中生長的細胞中的不同表達。實時定量PCR證明7個選定基因中的4個具有不同的表達水平(見圖10)。每個基因在二維基質(zhì)上細胞中的表達水平被設(shè)定為1，所述圖表顯示在基質(zhì)膠滲透的紙中細胞基因表達的相對上調(diào)或下調(diào)。使用微球蛋白作為所有樣品的參照基因。可將線性區(qū)域用于每組引物中。
_9] 實施例3:紙為研究細胞Ξ維遷移的便利平臺紙可被用來三維生長細胞和隨后被用來篩選在三維中發(fā)生而在二維中不發(fā)生的應(yīng)答(或所述應(yīng)答在二維中是不同的)。為證明這一點，使用紙作為平臺以研究內(nèi)皮細胞(HUVEC)的三維遷移和管形成。將細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液(I μ L，IO7細胞/mL)點斑至紙上且所述紙被浸入基質(zhì)膠中。這產(chǎn)生了 2 3mm的圓形圖案，其包含由無細胞的三維基質(zhì)圍繞的三維基質(zhì)中的細胞(見圖11A)。使用熒光凝膠掃描儀監(jiān)測細胞隨著時間進入周圍基質(zhì)膠的遷移。當在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時候，細胞侵入周圍的區(qū)域(圖11B)。包含細胞的斑的半徑可作為所述遷移的量度。在用100ng/mL VEGF(“VEGF”)或 10 μ M P 激酶小分子抑制劑 Υ27632 (“Υ27632”)補充的內(nèi)皮培養(yǎng)基中懸浮包含細胞的紙板。固定所述樣品并于圖1lB指定的天用SYTOX進行染色。通過Υ27632、Ρ激酶小分子抑制劑(ROCK)促進細胞的向外生長。在完全內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EGM)或具有額外的100ng/mL VEGF的EGM中所述侵入的半徑顯著低于在EGM+10 μ MΥ27632中的半徑(圖11Β)?？稍谒觥扒秩?yún)^(qū)域”中觀察腔和管樣結(jié)構(gòu)。在另一實施方式中，將內(nèi)皮細胞點斑在中間，而乳腺癌細胞在外面，并三維共培養(yǎng)。差異性標記所述細胞類型，并觀察所述兩種細胞類型的橫向交叉侵入(代表“轉(zhuǎn)移”和“血管發(fā)生”的組合)。實施例4:在基于細胞的筒通暈篩選中紙的應(yīng)用可與現(xiàn)有的高通量篩選基礎(chǔ)設(shè)施一起輕易使用紙支持的三維基質(zhì)。用細胞水凝膠懸浮液滲透的紙被分布至96孔板的孔中。使用相同大小紙片的分布來控制每個孔相似數(shù)量細胞的遞送。使用發(fā)光進行三維中細胞應(yīng)答的高通量研究。具體而言，使用基于細胞的簡單模型系統(tǒng)來產(chǎn)生發(fā)光的讀取。用攜帶熒光素酶報告質(zhì)粒的水泡性口炎病毒(Iux-VSV)感染幼倉鼠腎(BHK)細胞。用所述病毒感染的細胞產(chǎn)生熒光素酶。將BHK細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液滲透進2 X 4_的紙片內(nèi)。所述紙片被分布至96孔板的所述孔中，且用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細胞24小時。將漸增滴度的Iux-VSV添加至所述孔。6小時后，移去所述培養(yǎng)基，添加細胞裂解緩沖液中的熒光素溶液至所述孔，且使用發(fā)光酶標儀讀取所述信號。觀察到對應(yīng)于Iux-VSV滴度線性提高的發(fā)光線性提高(圖12Β)。各數(shù)據(jù)點對應(yīng)于從特定孔的讀取；來自在相似條件下進行的測定的讀取的散布低。所述結(jié)果證明可將使用發(fā)光報告系統(tǒng)的細胞應(yīng)答定量和篩選擴展至高通量篩選。實施例5:在基質(zhì)膠滲透的紙上生長的PC-12細胞的分析我們分析在基質(zhì)膠滲透的紙上PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系的生長。已知PC-12細胞在用神經(jīng)生長因子(NGF)處理后經(jīng)歷神經(jīng)元分化。首先，我們評估在紙中生長的PC-12細胞應(yīng)答NGF的增殖。將PC12細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液(luL，5X106細胞/mL)點斑至濾紙上。將所述紙放置在包含血清的培養(yǎng)基(在F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的2.5%胎牛血清、15%馬血清)或用100ng/mL神經(jīng)生長因子(NGF)補充的包含血清的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)在紙-基質(zhì)膠基質(zhì)內(nèi)的細胞指定時間，用甲醛固定，并用綴合Alexa Fluor488的鬼筆環(huán)肽進行染色。使用Typhoon突光凝膠掃描儀掃描所述紙(見圖13A)。使用ImageJ軟件定量所述圖像，且在圖13B中存在4個測量結(jié)果的平均值。誤差棒是一個標準差。細胞在紙支持的基質(zhì)中以36小時的種群倍增時間增殖。此外，在包含血清的培養(yǎng)基中，NGF對細胞的生長速度具有很少的影響。下一步，我們評估使用NGF-處理在紙支持的三維基質(zhì)中維持的PC-12細胞是否分化成神經(jīng)元。我們將PC12細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液點斑至紙上，并在用NGF或者用NGF和ROCK抑制劑Y27632的組合補充的培養(yǎng)基中懸浮所述紙。共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)了有長神經(jīng)突的神經(jīng)元樣細胞。當使用不同的培養(yǎng)基/添加劑時，細胞的形態(tài)和神經(jīng)突的長度發(fā)生變化。例如，在100ng/mL NGF存在情況下的6天培養(yǎng)后，由包含血清的培養(yǎng)基中的細胞發(fā)生短神經(jīng)突，在無血清的培養(yǎng)基中發(fā)生更長的神經(jīng)突，在5 μ M Y27632R0CK抑制劑存在下在無血清的培養(yǎng)基中觀察到大量互連神經(jīng)突的3D網(wǎng)絡(luò)。為確定觀察到的神經(jīng)元表型，通過定量PCR分析所述細胞，且顯示其上調(diào)神經(jīng)元特異性神經(jīng)絲L (NF-L)和神經(jīng)肽Y (NPY)的轉(zhuǎn)錄本(圖14)。最后，我們將在紙支持的基質(zhì)膠(“紙”)中維持的PC-12細胞的分化與在無紙基質(zhì)膠中(“3D”)或在基質(zhì)膠包被的表面上(“2D”)的細胞分化進行比較。在包含血清的培養(yǎng)基或在用100ng/mL NFG補充的培養(yǎng)基中使在所述基質(zhì)中的細胞增殖。在第3天或第4天時，處理所述樣品以分離mRNA，且通過定量PCR評估NF-L或NPY的表達水平。使用GAPDH和肌動蛋白作為持家對照。使用GAPDH作為參照在對于每個弓I物的線性范圍中進行△ ACT分析。在圖14中，各數(shù)據(jù)點為3個獨立樣品的測量結(jié)果的平均
值。誤差棒是一個標準差。在通過NFG處理誘導(dǎo)的NF-L和NPY表達水平中我們沒有觀察到不同(圖14)。所述觀察提示紙不干擾所述細胞的分化，且可將基于紙的平臺用于篩選調(diào)節(jié)三維環(huán)境中細胞分化的試劑。實施例6:研究在限制營養(yǎng)物質(zhì)和氧的Ξ維培養(yǎng)物中細胞增殖的多層基于紙的水鍾
使用多個紙板的分層來圖案修飾三維中的細胞及來創(chuàng)建細胞的復(fù)合三維裝配。重要的是，所述疊加層被拆開且在各層中的細胞能被單獨檢查(圖15A)。在多層培養(yǎng)物內(nèi)，處于不同深度的層中的細胞被暴露于不同濃度的氧和營養(yǎng)物質(zhì)。因此，可使用多層培養(yǎng)來研究在營養(yǎng)物質(zhì)和氧濃度梯度中不同細胞類型的增殖。
為比較在多層培養(yǎng)物中許多細胞類型的行為，將4μ L基質(zhì)膠中的原代細胞(HUVEC、HDF、MR-90)或永生化細胞(HS-5)點斑至200 μ m厚的層析紙上。在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞24小時(允許細胞進行擴散)并將其疊加至6 8層的紙上。為創(chuàng)建在疊加層中氧和營養(yǎng)物質(zhì)的單向梯度，將不透層放置在所述疊加物的底部(圖15A)。疊加的細胞培養(yǎng)7天(!1爪^0或9天(冊？、頂1 90、肥-5)。所述細胞被固定且被再疊加。用綴合AlexaFluor633的鬼筆環(huán)肽對細胞進行染色,使用凝膠掃描儀成像,并使用ImageJ進行分析。對應(yīng)于第I天的細胞密度的灰度強度被設(shè)定為1.0 ;在所有層中的灰度強度以在第I天的強度進行標準化。在所述分析中包括在非疊加層中增殖9天的細胞的密度(黑線，圖15B、15E、15F、15G)。在HDF和HS-5疊加的培養(yǎng)物中，在頂層中的細胞密度類似于在非疊加紙中增殖11天的細胞的密度(圖15B)。因此，即使在單向梯度中，在200 μ m內(nèi)的細胞被暴露于足夠量的營養(yǎng)物質(zhì)和氧以支持其增殖。IMR90和HUVEC細胞甚至在頂層中也顯示降低的增殖。我們推測所述降低是由于從紙的一側(cè)獲取營養(yǎng)物質(zhì)的阻斷。在自由浮動層中，其中可從紙的任何一側(cè)發(fā)生營養(yǎng)物質(zhì)的獲取且所述細胞離所述主體溶液平均為100 μ m或更近。隨著紙的一側(cè)被阻斷，至主體溶液的平均距離有效倍增且變成 200 μ m。所述厚度的所述倍增對于對氧缺乏更敏感的所述細胞系是有害的。在一對照實驗中，在包含基質(zhì)膠(沒有細胞)和在下面的不透層的7層的頂部放置一層HUVEC細胞。所述構(gòu)造有效阻斷從紙的一側(cè)獲取營養(yǎng)物質(zhì)和氧。在頂(包含細胞)層中的細胞數(shù)量少于在自由浮動層中的數(shù)量且其類似于在8層HUVEC的頂層疊加物中細胞的數(shù)量(未顯示)。 在所有情況下，在第一層下的細胞密度(>200 μ m深度)顯著低于在非疊加層對照中的細胞密度(黑線，圖15B、15E、15F、15G)。與起始細胞密度的比較(1.0網(wǎng)格線，圖15B、15E、15F、15G)顯示在不同細胞類型的不同層中發(fā)生增殖的損失。所述測試細胞系的“不增殖深度”為:HUVEC — 200 μ m、HS — 5 400 μ m.1MR — 90 600 μ m、HDF — 800 μ m?？墒褂眠M一步的實驗來說明細胞死亡、對低氧的抗性和其他因素。細胞增殖(EdU)或代謝活性(I丐黃綠素、Alamar Blue、圖151)標記物的染色顯示代謝活躍細胞或活躍合成DNA的細胞(S期細胞)的數(shù)量除了在頂部疊加物之外，在任何疊加物中低許多。觀察到的“S期細胞的梯度”和“代謝活躍細胞的梯度”比總DNA或總肌動蛋白染色的梯度陡許多，其表明在底層中的大多數(shù)細胞是代謝不活躍的和非增殖的。如VEGF和IGFBP3的定量PCR所示，在底部疊加物中的細胞也表達高許多的水平的低氧反應(yīng)性基因(圖151)。共聚焦圖像顯示在疊加層中細胞的獨特形態(tài)變化。空腔網(wǎng)絡(luò)的大量形成在頂部的5 6層中發(fā)生(圖15C)。在底層中觀察到小得多的腔(圖15D)和在非疊加的對照中僅可觀察到單獨的短腔(未顯示)。每個腔細胞核平均數(shù)量的定量顯示在層I的腔中觀察到平均
12.6細胞/腔，在層8中為5.5細胞/腔及在非疊加對照中為8.0細胞/腔。我們推測相比于“非疊加對照”中的腔，在頂部疊加層中更長腔的形成是由于多層培養(yǎng)物中HUVEC的營養(yǎng)物質(zhì)和氧缺乏，其刺激刺激腔生長的因子(VEGF等)的自分泌產(chǎn)生。實施例7:研究在Ξ維培養(yǎng)物中細胞遷移的多層紙支持的水凝膠使用多層紙支持的水凝膠的疊加來研究細胞的三維遷移。另外，可使用細胞層間三維遷移的觀察來確定在疊加后形成了連續(xù)的三維水凝膠。使細胞遷移可見的簡單方法是交替疊加包含紙支持的基質(zhì)膠中的細胞的層和只包含基質(zhì)膠的層。為創(chuàng)建所述疊加物，將4μ L基質(zhì)膠和細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液點斑至濾紙片上。折疊后產(chǎn)生由包含基質(zhì)膠的區(qū)域圍繞的含細胞區(qū)域的“4-螺旋物”，選擇點斑的圖案(圖16Α)。為了增強細胞的遷移，通過在各折疊的疊加物的底部上放置不透層(醋酸纖維素薄板)來創(chuàng)建營養(yǎng)物質(zhì)和氧的單向梯度(圖 16Β)。9天培養(yǎng)后，用4%甲醛溶液處理折疊的紙且用鬼筆環(huán)肽進行染色。不折疊所述疊加物，并使用凝膠掃描儀使所述細胞可見(圖16C)。細胞在包含基質(zhì)膠的板間遷移。我們推斷各層與鄰近的層是物理接觸的。遷移至較高層與較低層的定量顯示，當與逆著梯度遷移的細胞相比，使更多的細胞遷移至氧和營養(yǎng)物質(zhì)濃度更高的更高層(即沿著所述梯度)(圖16D和圖16Ε)。為評估在遷移中共形接觸的作用，我們比較層中的細胞行為，所述層被折疊并被壓至剛折疊但未被壓在一起的層上。我們觀察到僅當所述層被壓在一起時遷移發(fā)生(未顯示)。因此在不是共形接觸的層中細胞不能遷移至鄰近的層。實施例8:在不同幾何形狀的3D培養(yǎng)物中細胞生長和代謝活性的仿形我們使用包含洞圖案的紙來創(chuàng)建不同幾何形狀的3D培養(yǎng)物(圖18Α)。將細胞在基質(zhì)膠中的懸浮液滲透進紙內(nèi)，且所述紙被疊加，并用不銹鋼容器吸住(圖18C)。培養(yǎng)所述細胞9天，在第9天，用鈣黃綠素溫育所述疊加物30分鐘，然后用甲醛固定。然后分離所述層并使用熒光凝膠掃描儀使鈣黃綠素強度成像。用綴合Texas Red的鬼筆環(huán)肽對所述層進行染色，并使用凝膠掃描儀使其顯現(xiàn)。在圖19D和19E中顯示來自一些3D幾何形狀的結(jié)果。我們比較具有2、4、6或8層的疊加物(B卩400、800、1200和1600微米厚的培養(yǎng)物，圖19D)和具有由2、4或6層“紙中的洞”(其在3D培養(yǎng)物的中間有效創(chuàng)建了 400、800或1200微米的缺口(“腔”))分離的6、4或2層的3D培養(yǎng)物(圖19E)。對于在不透界面上具有
8、6、4和2層的疊加物，代謝活性的梯度急劇下降至低于層I (圖19D)。在3D培養(yǎng)物中腔的引入提高了在所述疊加物中細胞的總體代謝活性，且使在所述3D培養(yǎng)物中間的細胞更加代謝活躍(例如，將在18D中的4層疊加物和在18E中以800微米分離的2+2層構(gòu)成的相同疊加物進行比較)。因為在所述疊加物的底部和側(cè)面沒有營養(yǎng)物質(zhì)的入口且營養(yǎng)物質(zhì)和氧的大量涌入僅經(jīng)所述疊加物的頂部發(fā)生，在3D培養(yǎng)物內(nèi)腔的引入不改變所述疊加物的有效灌注表面區(qū)域(其在頂部)。最后，對于“分離的疊加物”，細胞的數(shù)量是相同的或甚至更高。不管正常的疊加物和“具有腔的疊加物”間的所述相似性，所述組合的代謝活性在具有腔的疊加物中顯著更高。實施例9:研究細菌細胞的生存能力的多層紙支持的水凝膠研究在200微米層析紙的疊加物中生長的銅綠假單胞菌株P(guān)A14細胞的生存能力。用細菌的懸浮液浸沒所述紙，且允許細菌附著至所述紙幾小時。然后疊加八張紙(形成8層的疊加物)并在培養(yǎng)基中溫育4小時、24小時或48小時。所述紙被去疊加，且使用商用的活/死細菌生存能力試劑盒(InvitiOgen)確定各層中死細菌和活細菌的數(shù)量。在8層的疊加物的中間觀察到活細菌和死細菌的數(shù)量的穩(wěn)步下降。所述下降可歸因于細菌的氧擴散和氧消耗的競爭率。盡管所述疊加物的頂部(層I)和底部(層8)都暴露于培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基不被攪拌，且層8離空氣/液體界面最遠。在不攪拌的培養(yǎng)基中，在層8中有更少的存活細菌，推測因為相比于層1，較少的氧可進入層8。實施例10:甜水圖案修飾方法的研制
A.篩選能保護用于甜水圖案修飾方法的纖維素的碳水化合物和多元醇研制篩選以鑒定保護纖維素免受疏水溶液影響的化合物。起初測試了蔗糖，因為蔗糖是便宜和豐富的碳水化合物。將各種濃度的蔗糖溶液點斑至濾紙上，然后將疏水溶劑中的聚合體或聚合體前體溶液浸入所述紙(見圖2A)。聚合所述前體或干燥所述溶劑后，用水洗滌所述紙。然后將莧菜紅的水溶液點斑至圖案修飾區(qū)上，且串珠狀的染料液滴提供了所述保護的定性測量。如果保護是成功的，點斑區(qū)域?qū)⒈３钟H水，且隨后用莧菜紅水溶液將其潤濕。相反地，在保護不成功的區(qū)域中，聚合物修飾的紙將被給予疏水性，且隨后不用莧菜紅水溶液將其潤濕。為制備PDMS修飾的紙(圖2B)，將蔗糖水溶液的斑沉積至所述紙上，然后將所述紙浸入在辛烷中的PDMS前體溶液(1: lwt，混合物)中。如圖2B所證明，蔗糖保護的斑保持親水性，允許莧菜紅溶液潤濕在所述蔗糖處理的斑中的紙。如圖2B所示，低濃度的蔗糖不保護所述紙(PDMS處理后所述紙變成疏水的，產(chǎn)生了串珠狀的莧菜紅溶液)。使用在甲苯中的聚苯乙烯溶液可觀察到相似的結(jié)果(圖2C)。PDMS和聚苯乙烯在蔗糖溶液周圍形成互補的圖案?？墒褂糜袧摿Φ脑S多其他類型的熱固性和熱塑性高分子材料。所述結(jié)果提示，由紙上的蔗糖溶液形成的任何圖案可模板在紙內(nèi)的互補疏水圖案的形成。使用圖2A所概括的篩選，發(fā)現(xiàn)纖維素由其他的碳水化合物衍生物保護(見圖3)。在圖3A中，化合物在水中溶解(60%重量分數(shù))且被點斑至濾紙上(I μ L滴)。將在正辛烷中的PDMS溶液浸入紙內(nèi)。在70°C溫育紙2小時以固化所述PDMS，然后用水將其洗滌。使用染料溶液(2 μ L滴)來評估點斑區(qū)的潤濕特性。在圖3Β中，使用作為疏水材料的PDMS測試各種濃度的不同化合物。在圖3C中，用列出的溶液點斑所述紙并將其短暫浸入10wt%甲苯中的聚苯乙烯溶液。過多的溶液被徹底去除，且允許所述紙在室溫干燥。相關(guān)化合物的保護性能力是相當不同的，且通過碳水化合物和它們的衍生物的保護是濃度依賴性的(圖3)。純甘油或甘油水溶液不保護纖維素免受PDMS影響。因為相比于PDMS的固化率，甘油的蒸發(fā)是慢的，所述結(jié)果表明甘油和PDMS-辛烷溶液在紙內(nèi)是易混合的。免受PDMS-辛烷和聚苯乙烯-甲苯影響的保護分布變化顯著(見圖3B和3C)。保護所需的化合物的濃度，對于聚苯乙烯比對于PDMS更低。甘油水溶液(高于60%)保護紙免受甲苯-聚苯乙烯影響。在紙不存在下不能從所述液體的相行為預(yù)測紙內(nèi)液體的可混合性。一些不能混合的液體在紙內(nèi)變成可混合的(例如甘油和辛烷-PDMS溶液)。所有化合物濃度的微小變化后，有保護效率的急劇下降。在圖2A中所述的篩選提供了鑒定保護性化合物和確定用于保護的濃度的方法。B.使用親水溶劑圖案修飾，隨后用親水溶液點斑如果相分離是平衡構(gòu)形(equilibrium configuration),溶液添加的順序不應(yīng)該影響最后的狀態(tài)。紙首先被浸入正辛烷中的PDMS前體的1:1溶液中。蔗糖的溶液被點斑至PDMS浸入的紙上，并在70°C溫育所述紙2小時，以固化所述PDMS。在幾秒內(nèi)，蔗糖液滴滲透進紙塊內(nèi)并代替所述疏水溶液(圖4A)。固化和洗滌產(chǎn)生了具有與由試劑的反向添加形成的潤濕特性相同的陣列(見圖4B和2B)。因此，試劑的添加順序是不重要的。C.用疏水材料圖案修飾紙使用許多現(xiàn)有的用墨水溶液圖案修飾紙的技術(shù)用蔗糖溶液圖案修飾。在第一種方法中，使用具有填充糖漿的墨盒的噴墨打印來形成所述圖案(見圖5A)。使用具有填充糖漿的墨盒(60wt%鹿糖、lwt%甘油、0.l%surfanoI)的Epson Stylus噴墨打印機打印所述圖案。使用連續(xù)10輪的打印來沉積高量的蔗糖，且未觀察到分辨率上的損失；本文所述的打印的圖案的照片如圖5A所示。打印的紙被浸入1:1的PDMS-辛烷溶液中并在70°C過夜固化。打印的圖案保持親水性且能被用于液體引導(dǎo)(微流體)(見圖5B)。通道間Imm的分界線防止液體滲透入平行的通道。在另一個方法中，是使用填充糖漿(63被％蔗糖溶液)的自來水筆形成微流體通道。使用常規(guī)的激光打印機打印兩個通道的虛線輪廓。使用填充糖漿的自來水筆“填充”所述輪廓。紙被浸入聚苯乙烯溶液(在甲苯中為10wt%)，并用干凈的濾紙吸干過多的溶液。在室溫干燥所述紙5分鐘并用水洗滌。點斑墨水溶液(莧菜紅和考馬斯亮藍)，且允許其吸進所述通道。在所述通道中觀察到層流(圖5C)。在另一方法中，通過蓋印蔗糖溶液至紙上制造圖案修飾的紙。使用SU8圖案修飾的紙作為蓋印的基礎(chǔ)(用藍色染料標記親水的紙區(qū)域)。如圖所示組合所述“印”。在兩個平坦的表面間手工壓制糖漿浸泡的紙、SU8圖案修飾的紙和Kimwipe 。重復(fù)蓋印16次。蓋印16個相同圖案所需的總時間是30秒左右?？墒褂盟龇椒焖佼a(chǎn)生大量的相同圖案。等同發(fā)明

應(yīng)了解雖然已與本發(fā)明的詳述相結(jié)合描述了本發(fā)明，希望前面的描述說明但不限制本發(fā)明的范圍，其由附加的權(quán)利要求的范圍所界定。其他方面、優(yōu)勢和修飾在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說明書還包括以下內(nèi)容:1.三維細胞陣列，其含: 多孔親水基質(zhì)，其中所述基質(zhì)含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛；及 含細胞的水凝膠，

其中所述水凝膠被嵌入所述多孔區(qū)內(nèi)。2.項目I的細胞陣列，其中所述基質(zhì)是紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。3.項目I的細胞陣列，其中所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。4.項目I的細胞陣列，其中所述水凝膠是溫度敏感性水凝膠。5.項目I的細胞陣列，其中所述水凝膠是離子型水凝膠。6.項目I的細胞陣列，其中所述不透液界面含PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。7.制備三維細胞陣列的方法，包括: 提供多孔親水基質(zhì)，其中所述基質(zhì)含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛；及 使所述多孔親水基質(zhì)與細胞和溫度敏感性水凝膠或離子型水凝膠前體的懸浮液接觸，其中所述懸浮液浸透所述基質(zhì)的一個或多個多孔區(qū)。8.項目7的方法，還包括在使所述細胞的懸浮液與所述基質(zhì)接觸前，用膠凝劑潤濕所述基質(zhì)。9.項目8的方法，其中所述膠凝劑誘導(dǎo)被嵌入所述基質(zhì)的一個或多個多孔區(qū)的水凝膠的形成，所述水凝膠含細胞。10.項目7的方法，其中所述基質(zhì)是紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。11.項目7的方法，其中所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。12.項目7的方法，其中所述不透液界面含PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻膠前體、蠟或脂肪。13.制備三維細胞陣列的方法，包括: 提供多孔 親水基質(zhì)； 使所述基質(zhì)的多個指定區(qū)與含細胞和溫度敏感性水凝膠或離子型水凝膠前體的懸浮液接觸，其中所述懸浮液浸透所述基質(zhì)的多個指定區(qū) '及 使所述溫度敏感性水凝膠或所述離子型水凝膠前體與膠凝劑接觸，其中所述膠凝劑誘導(dǎo)被嵌入所述基質(zhì)的多個指定區(qū)的水凝膠的形成。14.項目13的方法，其中所述基質(zhì)是紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。15.項目13的方法，其中所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。16.項目13的方法，還包括使所述陣列與培養(yǎng)基接觸。17.鑒定修飾細胞功能的制劑的方法，所述方法包括: 提供項目I的陣列；籲使所述陣列與一種或多種測試制劑接觸；及 檢測在所述一種或多種測試制劑存在下的一種或多種細胞功能；其中在所述一種或多種測試制劑存在下細胞功能的變化指示所述一種或多種測試制劑修飾細胞功能。18.項目17的方法，其中所述陣列于多個多孔區(qū)與所述一種或多種測試制劑接觸。19.項目17的方法，其中各多孔區(qū)與不同測試制劑接觸。20.項目17的方法，其中所述細胞功能是增殖、遷移、活力或基因轉(zhuǎn)錄。21.三維細胞陣列，其含: 含水凝膠的第一多孔親水基質(zhì)，所述水凝膠含細胞且于指定區(qū)配置在所述第一基質(zhì)內(nèi)；籲含水凝膠的第二多孔親水基質(zhì)；及 第三多孔親水基質(zhì)，所述第一基質(zhì)疊在所述第二基質(zhì)上，且所述第二基質(zhì)疊在所述第三基質(zhì)上。22.項目21的陣列，其中所述第三基質(zhì)含測試制劑。23.項目22的陣列，其中所述測試制劑是小分子、氨基酸、多肽、核酸、碳水化合物
或多糖。24.項目21的方法，其中所述基質(zhì)是紙、硝酸纖維素、醋酸纖維素、布或多孔聚合物膜。25.項目21的方法，其中所述細胞是細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。26.鑒定修飾細胞功能的制劑的方法，所述方法包括: 提供項目I的三維陣列； 將所述基質(zhì)切成多個區(qū)段，各區(qū)段具有相等尺寸； 使各區(qū)段與測試制劑或?qū)φ战佑|；及 檢測在所述測試試劑存在下的一種或多種細胞功能；其中在所述測試試劑存在下細胞功能的變化指示所述測試制劑修飾細胞功能。27.三維微陣列，其含:
籲無底微孔板，其具有多個孔；及 多孔柔性基質(zhì)，其含多個多孔區(qū)和多個不透液界面，各多孔區(qū)被不透液界面束縛；其中所述孔和所述不透液界面以相同的圖案排列，所述微孔板和所述基質(zhì)附著，由此所述多個孔對齊，且密封連接至所述多個不透液界面，以形成針對各多孔區(qū)的單個室。28.項目27的微陣列，其中所述基質(zhì)的所述多孔區(qū)在水凝膠中含細胞。29.鑒定修飾細胞功能的制劑的方法，所述方法包括: 提供項目20的三維微陣列； 使所述陣列與一種或多種測試制劑接觸；及 檢測在所述一種或多種測試制劑存在下一種或多種細胞功能；其中在所述一種或多種測試制劑存在下細胞功能的變化指示所述一種或多種測試制劑修飾細胞功能。30.圖案修飾多孔疏水基質(zhì)的方法，所述方法包括: 使多孔疏水基質(zhì)與含水溶性化合物的水溶液接觸，所述溶液浸潤所述基質(zhì)以形成浸透所述溶液的所述基質(zhì)的第一區(qū)和不與所述溶液接觸的第二區(qū)； 使所述基質(zhì)與疏水材料接觸，所述疏水材料浸透所述第二區(qū)；及 除去所述水溶性化合物，產(chǎn)生被所述疏水材料束縛的親水多孔區(qū)。31.項目30的方法，其中所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖或甘油。32.項目30的方法，其中所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂或聚苯乙烯。33.項目30的方法，其中所述水溶液被點斑、打印、畫或蓋印在所述多孔疏水基質(zhì)上。34.項目33的方法，其中所述溶液用噴墨打印機打印。
35.項目30的方法，其中所述基質(zhì)是硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素紙、濾紙、布或多孔聚合物膜。36.項目30的方法，其中所述基質(zhì)是紙。37.圖案修飾多孔疏水基質(zhì)的方法，所述方法包括: 使多孔疏水基質(zhì)與疏水材料接觸，所述疏水材料浸透所述基質(zhì)； 使所述基質(zhì)區(qū)與含水溶性化合物的水溶液接觸，所述溶液從所述區(qū)置換所述疏水材料 '及 除去所述水溶性化合物，產(chǎn)生被所述疏水材料束縛的親水多孔區(qū)。38.項目37的方法，其中所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖或甘油。39.項目37的方法，其中所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂或聚苯乙烯。40.項目37的方法，其中所述水溶液被點斑、打印、畫或蓋印在所述多孔疏水基質(zhì)上。41.項目40的方法，其中所述溶液用噴墨打印機打印。42.項目37的方法，其中所述基質(zhì)是硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素紙、濾紙、布或多孔聚合物膜。

43.項目37的方法，其中所述基質(zhì)是紙。
權(quán)利要求
1.圖案修飾多孔疏水基質(zhì)的方法，所述方法包括: 使多孔疏水基質(zhì)與含水溶性化合物的水溶液接觸，所述溶液浸潤所述基質(zhì)以形成浸透所述溶液的所述基質(zhì)的第一區(qū)和不與所述溶液接觸的第二區(qū)； 使所述基質(zhì)與疏水材料接觸，所述疏水材料浸透所述第二區(qū)；及 除去所述水溶性化合物，產(chǎn)生被所述疏水材料束縛的親水多孔區(qū)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖或甘油。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂或聚苯乙烯。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述水溶液被點斑、打印、畫或蓋印在所述多孔疏水基質(zhì)上。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述溶液用噴墨打印機打印。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)是硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素紙、濾紙、布或多孔聚合物膜。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)是紙。
8.圖案修飾多孔疏水基質(zhì)的方法，所述方法包括: 使多孔疏水基質(zhì)與疏水材料接觸，所述疏水材料浸透所述基質(zhì)； 使所述基質(zhì)區(qū)與含水溶性化合物的水溶液接觸，所述溶液從所述區(qū)置換所述疏水材料；及 除去所述水溶性化合物，產(chǎn)生被所述疏水材料束縛的親水多孔區(qū)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、蘇糖醇、甘露糖或甘油。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、環(huán)氧樹脂或聚苯乙烯。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述水溶液被點斑、打印、畫或蓋印在所述多孔疏水基質(zhì)上。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述溶液用噴墨打印機打印。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述基質(zhì)是硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素紙、濾紙、布或多孔聚合物膜。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述基質(zhì)是紙。
全文摘要
公開了三維細胞陣列、制備三維細胞陣列的方法及使用所述陣列鑒定制劑的方法。三維細胞陣列含多孔親水基質(zhì)，其中所述基質(zhì)含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛；及含細胞的水凝膠，其中所述水凝膠被嵌入所述多孔區(qū)內(nèi)。制備三維細胞陣列的方法包括提供多孔親水基質(zhì)，其中所述基質(zhì)含多個多孔區(qū)，各多孔區(qū)至少部分被不透液界面束縛；及使所述多孔親水基質(zhì)與細胞和溫度敏感性水凝膠或離子型水凝膠前體的懸浮液接觸，其中所述懸浮液浸透所述基質(zhì)的一個或多個多孔區(qū)。鑒定制劑的方法包括提供描述的修飾細胞功能的陣列；使所述陣列與一種或多種測試制劑接觸；及檢測在所述一種或多種測試制劑存在下的一種或多種細胞功能；其中在所述一種或多種測試制劑存在下細胞功能的變化指示所述一種或多種測試制劑修飾細胞功能。
文檔編號G01N33/548GK103203210SQ20121057933
公開日2013年7月17日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者R·德達, A·拉羅邁內(nèi)薩格, G·M·懷特賽德斯 申請人:哈佛學(xué)院院長等