一種發(fā)酵液中2-酮基-l-古龍酸含量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法，包括如下步驟：A、建立維生素C溶液標準曲線；B、檢測樣品：制備檢測樣品，堿處理前與處理后分別進行紫外吸收值測定，得出吸光差值與標準曲線對照作為維生素C定性或定量的依據(jù)，從而推算出發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸的含量。本檢測方法簡單，成本低；環(huán)保安全，不需要使用有毒的有機溶劑；經(jīng)實際檢測驗證，該方法穩(wěn)定性好，測定的準確性高。
【專利說明】一種發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002]維生素C是可溶于水的無色結晶，是一種六碳的多羥基內(nèi)酯，為分子結構最簡單的維生素。維生素C能參與人體內(nèi)多種代謝過程，使組織產(chǎn)生膠原質，影響毛細血管的滲透性及血漿的凝固，刺激人體造血功能，增強機體的免疫力。另外，由于它具有較強的還原能力，可作為抗氧化劑，在醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面獲得廣泛應用。
[0003]2-酮基-L-古龍酸是維生素C生產(chǎn)中重要的中間體，其經(jīng)過簡單的化學轉化即可生成維生素C。我國的“兩步發(fā)酵法”制備維生素C的生產(chǎn)工藝中，利用氧化葡糖酸桿菌與芽孢桿菌屬或假單胞桿菌屬的菌株混合培養(yǎng)，將L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸，再經(jīng)化學轉化生產(chǎn)維生素C。因此發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測無論在生產(chǎn)工作還是在科研工作中都是非常重要的環(huán)節(jié)。
[0004]目前對發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸的測定大多將其轉化為維生素C，然后采用2010版藥典中規(guī)定測定維生素C含量的方法進行測定。2-酮基-L-古龍酸在強酸介質中，加熱經(jīng)內(nèi)酯化烯化反應轉化成維生素C，當介質條件固定后，在一定的試驗條件下，轉化率僅與加熱時間長短有關，如介質條件為7mol/L濃硫酸時,沸水浴25min, 2-酮基-L-古龍酸生成維生素C的轉化率為63.03%，所以測得轉化生成的維生素C的含量，通過維生素C與2-酮基-L-古龍酸分子量之比及固定介質條件下的轉化率計算，即可推得發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸的含量。
[0005]所以此項檢測多采用加熱法將發(fā)酵液中的2-酮基-L-古龍酸按一定比例轉化為維生素C，然后用碘滴定法進行檢測，雖然該檢測方法準確，但是在操作過程中要用到劇毒試劑三氧化二砷，而且該方法費時費力，不適宜對大規(guī)模樣品進行檢測，對菌種篩選等科研工作來說并不實用。
[0006]《水果、蔬菜中維生素C含量的測定——紫外分光光度快速測定方法探討》(鄭京平，《光譜實驗室》，2006，第23卷，731-735)報道了利用紫外分光光度法對水果、蔬菜中的維生素C含量進行檢測的方法，但是發(fā)明人在使用報道方法對發(fā)酵液中的2-酮基-L-古龍酸進行檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，檢測結果不穩(wěn)定且準確性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決檢測發(fā)酵液中的2-酮基-L-古龍酸檢測方法費時費力、準確性與穩(wěn)定性差的問題，本發(fā)明提供一種操作簡便而準確性較高的發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸定性或定量的快速檢測方法。
[0008]實現(xiàn)上述目的的技術方案如下:
[0009]A、建立維生素C標準曲線
[0010]測定維生素C標準品溶液與NaOH溶解后的維生素C標準品溶液在244nm波長處的紫外吸光值之差，建立維生素C標準曲線；
[0011]B、檢測樣品
[0012]取待檢測的發(fā)酵液制備檢測樣品，分別與標準品相同的條件處理，得出轉化樣品的吸光值之差，與標準曲線對照得出維生素C的含量，計算出2-酮基-L-古龍酸的含量。
[0013]所述步驟A包括如下步驟:
[0014]A-1、稱取維生素C標準品0.05g溶于500mL醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配成100 μ g/mL的維生素C標準溶液；所述醋酸-醋酸鈉緩沖液為:11.55mL冰醋酸溶于1000mL水配得溶液①，16.4g醋酸鈉或27.2g三水醋酸鈉溶于1000mL水配得溶液②，將46.3mL溶液①與
3.7mL溶液②混合,加入lmol/L的EDTA200 μ L,蒸懼水定容至80mL,用醋酸調(diào)pH至3.6,蒸懼水定容至IOOmL ；
[0015]A-2、取維生素C標準溶液，稀釋至濃度為1、5、10、15、20、25、30，單位為μ g/mL，分別在紫外可見分光光度計244nm波長處進行光譜掃描，以所述醋酸_醋酸鈉緩沖液作為空白對照，測得吸光值A1;
[0016]A-3、以0.3mol/L的NaOH為溶液，配制濃度分別為1、5、10、15、20、25、30，單位為
μ g/mL的維生素C標準品溶液，室溫反應15分鐘后，以0.3mol/L的NaOH溶液作為空白對照，測得吸光值A2;
[0017]A-4、分別計算相同維生素C標準品濃度時的吸光值差值Λ A = A1-A2,以維生素C標準品溶液中維生素C的濃度為橫坐標,單位為μ g/mL,以相應的吸光值差值Δ A為縱坐標，作標準曲線；
[0018]所述步驟B包括如下步驟:
[0019]B-1、取待測的含有2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵液，加入等體積7mol/L濃硫酸溶液，混勻后煮沸25min，使2-酮基-L-古龍酸部分轉化為維生素C，以12，OOOg的離心力離心lOmin，取上清液備用；
[0020]Β-2、50 μ L上清液加入950 μ L所述醋酸-醋酸鈉緩沖液，得溶液③，取20 μ L溶液③加入980 μ L所述醋酸-醋酸鈉緩沖液，得檢測液I ;將檢測液I置紫外可見分光光度計，以所述醋酸-醋酸鈉緩沖液作為空白對照，于244nm波長處測定紫外吸光值A3 ；
[0021]B-4、取20 μ L溶液③加入980 μ L 0.3mol/L的NaOH溶液，混勻，室溫反應15min，得檢測液II，以0.3mol/L的NaOH溶液作為空白對照，于244nm波長處測定紫外吸收值A4 ；
[0022]B-5、樣品中維生素C的光吸收值Av。= A3-A4，根據(jù)光吸收值及標準曲線即可得到維生素 C 含量 Cvc = (Avc-0.006) /0.046 ；
[0023]Β-6、發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸的含量Cs= 2000*CVc*l.1023/0.6303，C古單位為μ g/mL, 2000為稀釋倍數(shù)，1.1023為2-酮基-L-古龍酸分子量/Vc分子量；0.6303為2-酮基-L-古龍酸生成維生素C的轉化率。
[0024]該方法在檢測過程中只需要15-20分鐘，檢測過程不需要使用有毒試劑，實際檢驗過程中檢測結果穩(wěn)定 性好、準確性高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]維生素C的標準曲線圖【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]主要設備:5300紫外分光光度計(美國GE公司)；PIC017離心機(Thermo公司)；FE20實驗室pH計(梅特勒-托利多公司)。所檢測發(fā)酵液由華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司提供。
[0028]1、建立維生素C溶液標準曲線
[0029]1)配制醋酸-醋酸鈉緩沖液(EDTA 2mmol/L) (pH3.6)
[0030]溶液①:0.2mol/L醋酸(11.55mL冰醋酸溶于1000mL水);
[0031]溶液②:0.2mol/L醋酸鈉(16.4g醋酸鈉或27.2g醋酸鈉.3H20溶于1000mL水)；
[0032]將46.3mL溶液①與3.7mL溶液②按相應體積混合，定容至IOOmL,加入相應量IMEDTA至終濃度2mmol/L，用醋酸調(diào)pH至3.6。
[0033]2)配制維生素C標準溶液
[0034]準確稱取0.05g維生素C標準品，以IOmL醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，此處及以下所述醋酸-醋酸鈉緩沖液均為步驟I)所配，并以醋酸-醋酸鈉緩沖液定容到500mL，至終濃度為 100 μ g/mL。
[0035]3)繪制維生素C標準曲線
[0036]按下表所列，以醋酸-醋酸鈉緩沖液(EDTA 2mmol/L) (pH3.6)將維生素C標準溶液稀釋至不同濃度，以醋酸-醋酸鈉緩沖液(EDTA 2mmol/L) (pH3.6)作空白試劑，在244nm下測定吸光值A1 ；0.3mol/L氫氧化鈉溶液為溶劑，配制相應濃度的維生素C溶液，以
0.3mol/L氫氧化鈉為溶液配制相應濃度的維生素C溶液，以0.3mol/L氫氧化鈉溶液為空白對照，在244nm下測定吸光值A2，然后以維生素C濃度(μ g/mL)為橫坐標，以相應的吸光值差值ΔΑ = A1-A2為縱坐標,繪制標準曲線。
[0037]表1
【權利要求】
1.一種發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟: A、建立維生素C標準曲線 測定維生素C標準品溶液與NaOH溶解后的維生素C標準品溶液在244nm波長處的紫外吸光值之差，建立維生素C標準曲線； B、檢測樣品 取待檢測的發(fā)酵液制備檢測樣品，分別與標準品相同的條件處理，得出轉化樣品的吸光值之差，與標準曲線對照得出維生素C的含量，計算得出2-酮基-L-古龍酸的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法，其特征在于所述步驟A包括如下步驟: A-1、稱取維生素C標準品0.05g溶于500mL醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配成100 μ g/mL的維生素C標準溶液；所述醋酸-醋酸鈉緩沖液為:11.55mL冰醋酸溶于1000mL水配得溶液①，16.4g醋酸鈉或27.2g三水醋酸鈉溶于1000mL水配得溶液②，將46.3mL溶液①與3.7mL溶液②混合，加入lmol/L的EDTA200l.! L，蒸餾水定容至80mL，用醋酸調(diào)pH至3.6，蒸餾水定容至IOOmL ； A-2、取維生素C標準溶液，稀釋至濃度為1、5、10、15、20、25、30，單位為μ g/mL，分別在紫外可見分光光度計244nm波長處進行光譜掃描，以所述醋酸-醋酸鈉緩沖液作為空白對照，測得吸光值A1; A-3、以0.3mol/L的NaOH為 溶液，配制濃度分別為1、5、10、15、20、25、30，單位為μ g/mL的維生素C標準品溶液，室溫反應15分鐘后，以0.3mol/L的NaOH溶液作為空白對照，測得吸光值A2 ； A-4、分別計算相同維生素C標準品濃度時的吸光值差值Λ A = A1-A2,以維生素C標準品溶液中維生素C的濃度為橫坐標,單位為μ g/mL,以相應的吸光值差值Δ A為縱坐標,作標準曲線。
3.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法，其特征在于所述步驟B包括如下步驟: B-1、取待測的含有2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵液，加入等體積7mol/L濃硫酸溶液，混勻后煮沸25min，使2-酮基-L-古龍酸部分轉化為維生素C，以12，OOOg的離心力離心10min，取上清液備用； Β-2、50 μ L上清液加入950 μ L所述醋酸-醋酸鈉緩沖液，得溶液③，取20 μ L溶液③加入980 μ L所述醋酸-醋酸鈉緩沖液，得檢測液I ;將檢測液I置紫外可見分光光度計，以所述醋酸-醋酸鈉緩沖液作為空白對照，于244nm波長處測定紫外吸光值A3 ; B-4、取20 μ L溶液③加入980 μ L 0.3mol/L的NaOH溶液，混勻，室溫反應15min，得檢測液II，以0.3mol/L的NaOH溶液作為空白對照，于244nm波長處測定紫外吸收值A4 ； B-5、樣品中維生素C的光吸收值Av。= A3-A4，根據(jù)光吸收值及標準曲線即可得到維生素 C 含量 Cvc = (Avc-0.006) /0.046 ； Β-6、發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸的含量Cs= 2000*CVc*l.1023/0.6303，C古單位為μ g/mL, 2000為稀釋倍數(shù)，1.1023為2-酮基-L-古龍酸分子量/Vc分子量；0.6303為2-酮基-L-古龍酸生成維生素C的轉化率。
4.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟: A、建立維生素C溶液標準曲線 A-1、稱取維生素C標準品0.05g溶于500mL醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配成100 μ g/mL的維生素C標準溶液；所述醋酸-醋酸鈉緩沖液為:11.55mL冰醋酸溶于1000mL水配得溶液①，16.4g醋酸鈉或27.2g三水醋酸鈉溶于1000mL水配得溶液②，將46.3mL溶液①與3.7mL溶液②混合，加入lmol/L的EDTA200 μ L，定容至80mL，用醋酸調(diào)pH至3.6，定容至IOOmL ； A-2、取維生素C標準溶液，稀釋至濃度為1、5、10、15、20、25、30，單位為μ g/mL，分別在紫外可見分光光度計244nm波長處進行光譜掃描，以醋酸_醋酸鈉緩沖液作為空白對照，測得吸光值A1 ； A-3、以0.3mol/L的NaOH為溶液，配制濃度分別為1、5、10、15、20、25、30，單位為μ g/mL的維生素C標準品溶液，室溫反應15分鐘后，以0.3mol/L的NaOH溶液作為空白對照，測得吸光值A2 ； A-4、分別計算相同維生素C標準品濃度時的吸光值差值Λ A = A1-A2,以維生素C標準品溶液中維生素C的濃度為橫坐標,單位為μ g/mL,以相應的吸光值差值Δ A為縱坐標,作標準曲線； B、檢測樣品 B-1、取待檢測的含有2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵液，加入等體積7mol/L濃硫酸溶液，混勻后煮沸25min，使2-酮基-L-古龍酸部分轉化為維生素C，以12000g的離心力離心10min，取上清備用； Β-2、50 μ L上清加入950 μ L所述醋酸-醋酸鈉緩沖液，得溶液③，取20 μ L溶液③加入980 μ L醋酸-醋酸鈉緩沖液，得檢測液I ;將檢測液I置紫外可見分光光度計，以醋酸-醋酸鈉緩沖液作為空白對照，于244nm波長處測定紫外吸光值A3 ； B-4、取20 μ L溶液③加入980 μ L 0.3mol/L的NaOH溶液，混勻，室溫反應15min，得檢測液II，以0.3mol/L的NaOH溶液作為空白對照，于244nm波長處測定紫外吸收值A4 ； B-5、樣品中維生素C的光吸收值Av。= A3-A4，根據(jù)光吸收值及標準曲線即可得到維生素 C 含量 Cvc = (Avc-0.006) /0.046 ； Β-6、發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸的含量Cs= 2000*CVc*l.1023/0.6303，C古單位為μ g/mL, 2000為稀釋倍數(shù)，1.1023為2-酮基-L-古龍酸分子量/Vc分子量；0.6303為2-酮基-L-古龍酸在B-1步驟的處理條件下生成維生素C的轉化率。
【文檔編號】G01N1/38GK103900985SQ201210580394
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權日:2012年12月28日
【發(fā)明者】段寶玲, 修建新, 朱欣杰, 崔永濤, 郎曉磊, 張斌, 孫君偉, 李錦 , 王會會, 王茶, 古國勝 申請人:河北維爾康制藥有限公司