專利名稱：一種脂聯(lián)素濃度的測定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂聯(lián)素濃度的測定方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂聯(lián)素(APN)是一種由脂肪細(xì)胞合成、分泌的細(xì)胞因子，1995年由Scherer等在小鼠3T3脂肪細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)。編碼脂聯(lián)素基因在人類定位于染色體3q27，大小為17kb，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。全基因組掃描顯示該區(qū)域存在2型糖尿病和代謝異常綜合征的易感位點(diǎn)。脂聯(lián)素在人體是一個(gè)在胰島素敏感性和炎性通路中起重要作用的脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)。臨床研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素與肥胖、糖尿病、冠心病、胰島素抵抗密切相關(guān)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化形成、抗炎癥和血管損傷后抗內(nèi)膜增生的特性。目前的體外細(xì)胞培養(yǎng)及組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂聯(lián)素可能通過以下幾種機(jī)制直接作用于動(dòng)脈粥樣硬化的形成(I)脂聯(lián)素通過激活環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信號(hào)通路來調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。(2)抑制巨噬細(xì)胞的功能，可抑制前體巨噬細(xì)胞的生長，抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇酯的攝取，從而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的分化、增殖與遷移[41-43]。(4)脂聯(lián)素通過減少血漿游離脂肪酸以及肌肉和肝臟內(nèi)的甘油三脂含量減弱了胰島素抵抗，改善糖、脂代謝紊亂。由此可見脂聯(lián)素既可直接作用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程，又可通過引起與冠狀動(dòng)脈硬化形成有關(guān)的一系列危險(xiǎn)因素的變化而間接影響血管病變的發(fā)生與發(fā)展。人體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，APN與機(jī)體胰島素敏感性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性RI程度越高，APN血漿水平越低；反過來，APN水平升高可明顯改善RI，APN可能是通過以下機(jī)制來改善胰島素敏感性(I)脂聯(lián)素可增加5-AMP活化蛋白激酶(AMPK)對(duì)乙酰輔酶A羧化酶(ACC)磷酸化作用，加快脂肪酸氧化，使胰島素受體及受體后水平信號(hào)傳導(dǎo)加速，減少肝臟糖異生，促進(jìn)葡萄糖利用，從而達(dá)到改善胰島素抵抗的目的。(2)脂聯(lián)素對(duì)脂肪因子和脂肪酸引起的胰島B細(xì)胞凋亡起到一定的對(duì)抗作用，促進(jìn)葡萄糖的利用。(3)脂聯(lián)素可增強(qiáng)胰島素敏感性，并且可以改善胰島B細(xì)胞功能，對(duì)疾病的發(fā)生起到雙重保護(hù)作用。(4)抑制巨噬細(xì)胞的生長，減少其對(duì)脂質(zhì)的攝取，從而減少巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可結(jié)合血管損傷處膠原聚集在血管內(nèi)膜下，參與炎癥反應(yīng)的終止過程。通過對(duì)不同類型糖調(diào)節(jié)受損人群大血管病變影響因素分析，評(píng)價(jià)糖尿病血漿脂聯(lián)素(APN)在預(yù)測糖尿病前期大血管病變及其嚴(yán)重程度中的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種脂聯(lián)素的測定方法及其應(yīng)用，給預(yù)測糖尿病前期大血管病變的情況提供一種依據(jù)。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)?！N脂聯(lián)素濃度的測定方法，其步驟為(I)配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品 APN (濃度分別為 200、100、50、25、12. 5,6. 25,3. 125,1. 56、0.78ng/ml,共 9 管)。(2)血漿標(biāo)本IOml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測樣本。(3)每管加入IOOml待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入1-APN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在室溫下(20 25°C)孵育24小時(shí)過夜。(4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體(對(duì)照管除外)，混勻，40C孵育20分鐘，離心20分鐘(3000 Xg)吸取上清液棄去。(5)測定各試管的δ射線量。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，Β/Β0 (%)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(7)根據(jù)樣品Β/Β0 (%)從曲線上查得相應(yīng)的APN濃度(ng/ml)。(8) APN濃度(ng/ml)計(jì)算:所得APN濃度(ng/ml)值乘以稀釋倍數(shù)(500)再除以1000即為樣本濃度。所述的IOX倍緩沖液(50ml)兔抗APN抗體(13ml)、IAPN標(biāo)記物(13.5ml)、標(biāo)準(zhǔn)品(重組APN純品0.75ml)、質(zhì)控品I和2(重組APN純品1ml)、兔載體(2ml)、沉淀試劑(羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體、3%聚乙二醇)。購于美國Linco公司的放射免疫試劑盒，批內(nèi) CV < 6.21%,批間 CV < 9.25%。測定原理固定濃度的標(biāo)記抗原與一定量抗血清溫育抗體上抗原的結(jié)合位點(diǎn)是有限的。若加入未標(biāo)記抗原，兩者將競爭結(jié)合抗體上的有限固定位點(diǎn)，隨著未標(biāo)記抗原增加，與抗體結(jié)合的標(biāo)記物將減少。將抗體結(jié)合物與游離的標(biāo)記物分離，然后計(jì)數(shù)其中一部分或兩部分，通過由標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可查得未知樣本中APN抗原的含量。本發(fā)明所述的測試方法，步驟簡單，測量精準(zhǔn)，通過對(duì)不同類型糖調(diào)節(jié)受損人群大血管病變影響因素分析，評(píng)價(jià)糖尿病血漿脂聯(lián)素(APN)在預(yù)測糖尿病前期大血管病變及其嚴(yán)重程度中的臨床意義。


圖1為實(shí)施例四組間血漿APN濃度比較具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn):實(shí)施例2009-2011收集長寧區(qū)中心醫(yī)院，臨床疑似冠心病而住院行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)患者共210例。行口服糖耐量試驗(yàn)，根據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)糖代謝狀態(tài)分為:正常糖代謝組(NGT) 42例(男性21例，女性21例，平均年齡60.3± 10.9歲)；空腹血糖調(diào)節(jié)受損組(IFG)36例(男性20例，女性16例，平均年齡62.8±8.2歲);糖耐量減低組(IGT) 92例(男性54例，女性38例，平均年齡61.5±9.9歲)；其中IGTl組44例，IGT2組48例，空腹血糖受損合并糖耐量減低組(IFG+IGT)40例(男性25例，女性15例，平均年齡61.0±9.5歲)。所有入選對(duì)象均排除肝、腎、甲狀腺疾病，急性代謝紊亂、心功能衰竭、感染、自身免疫性疾病或結(jié)締組織疾病、腫瘤及既往曾接受過PTCA或CABG治療者。并未使用影響胰島素分泌和胰島素抵抗的藥物。
診斷及分類標(biāo)準(zhǔn):采用1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)分類診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖調(diào)節(jié)受損(IFG),FPG6.1 〈7.0mmol/L，服糖后 2hPG〈7.8mmol/L;糖耐量減低(IGT)，F(xiàn)PG〈6.1mmoI/L，7.8mmol/L彡服糖后2hPG〈ll.lmmol/L ;空腹血糖受損合并糖耐量減低(IFG+IGT)，F(xiàn)PG6.1 〈7.0mmol/L，7.8mmol/L 彡服糖后 2hPG〈lL lmmol/L。對(duì) IGT 人群以2hPG10.0mmol/L 為節(jié)點(diǎn)進(jìn)一步分層，IGTl 組:7.8mmol/L 彡服糖 2hPG〈10.0mmol/L ；IGT2組:10.0mmol/L彡服糖后2hPG〈ll.lmmol/L。每例受試者空腹8-10小時(shí)后于次H晨8AM做75g葡萄糖耐量試驗(yàn)，將75g葡萄糖溶于250-300毫升水中，五分鐘內(nèi)飲完，分別于空腹、服糖后2小時(shí)抽取靜脈血測空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、服糖后2h血糖(2hpost-challenge glucose, 2hPG),采用葡萄糖氧化酶法測定,在美國貝克曼全自動(dòng)生化儀上完成。同時(shí)空腹檢測甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-c)低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-c),并測空腹胰島素(fasting insulin, FINS)、脂聯(lián)素、C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)。每例受試者均測體重(kg)、身高(m)、血壓(mmHg)計(jì)算每位患者的體重指數(shù)BMI (kg/m2)=體重/身高2。評(píng)價(jià)胰島素抵抗指標(biāo)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) HOMA-1R= (FINS X FBG) /22.5。所有入選者在抽取上述空腹靜脈血標(biāo)本同時(shí)，留取2毫升靜脈血，以296EDTA抗凝后離心15分鐘，轉(zhuǎn)速3000r/min，留取上清液血漿0.5毫升，放置_80°C冰箱保存，保存時(shí)間小于3個(gè)月。測定方法:(I)配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品 APN (濃度分別為 200、100、50、25、12.5,6.25,3.125,1.56、0.78ng/ml,共 9 管)。(2)血漿標(biāo)本IOml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測樣本。(3)每管加入IOOml待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入IAPN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在室溫下(20 25°C)孵育24小時(shí)過夜。(4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體(對(duì)照管除外)，混勻，40C孵育20分鐘，離心20分鐘(3000 Xg)吸取上清液棄去。(5)測定各試管的&射線量。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，Β/Β0 (%)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(7)根據(jù)樣品Β/Β0 (%)從曲線上查得相應(yīng)的APN濃度(ng/ml)。(8) APN濃度(ng/ml)計(jì)算:所得APN濃度(ng/ml)值乘以稀釋倍數(shù)(500)再除以1000即為樣本濃度。各組血漿APN濃度的比較:糖耐量異常及空腹血糖受損合并糖耐量異常組的血漿APN濃度顯著低于空腹血糖受損組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.013和0.002);亦顯著低于糖耐量正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.004和0.000);而糖耐量異常組和空腹血糖受損合并糖耐量異常組之間并無顯著差異(P=0.419);與空腹血糖受損組相比，糖耐量正常組的APN濃度雖較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.779)。見表I和圖1。表I四組間血漿APN濃度比較
權(quán)利要求
1.一種脂聯(lián)素濃度的測定方法，其特征在于:其步驟為: (1)配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品APN； (2)血漿標(biāo)本IOml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測樣本； (3)每管加入IOOml待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入1-APN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在20 25 °C溫度下孵育24小時(shí)過夜； (4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體，對(duì)照管除外，混勻，4°C孵育20分鐘，離心20分鐘吸取上清液棄去； (5)測定各試管的S射線量； (6)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，Β/Β0(%)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (7)根據(jù)樣品Β/Β0從曲線上查得相應(yīng)的APN濃度；(8)APN濃度ng/ml計(jì)算:所得APN濃度ng/ml值乘以稀釋倍數(shù)500再除以1000即為樣本濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂聯(lián)素濃度的測定方法，其特征在于:步驟I)中，緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品 APN 的濃度分別為 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78ng/ml,共 9 管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂聯(lián)素濃度的測定方法，其步驟為配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品APN。血漿標(biāo)本10ml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測樣本。每管加入100ml待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入I-APN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在室溫下孵育24小時(shí)過夜。次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體，混勻，4℃孵育20分鐘，離心20分鐘吸取上清液棄去。測定各試管的射線量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品B/B0從曲線上查得相應(yīng)的APN濃度。APN濃度計(jì)算。本發(fā)明所述的測試方法，步驟簡單，測量精準(zhǔn)，通過對(duì)不同類型糖調(diào)節(jié)受損人群大血管病變影響因素分析，評(píng)價(jià)糖尿病血漿脂聯(lián)素在預(yù)測糖尿病前期大血管病變及其嚴(yán)重程度中的臨床意義。
文檔編號(hào)G01N33/60GK103076452SQ20121058802
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者寧光, 黃珊, 王衛(wèi)慶, 顧衛(wèi)瓊, 洪潔 申請(qǐng)人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所