專利名稱：γ-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸，Y -aminobutyric acid (GABA),化學(xué)名稱4_ 氨基丁酸，別名:Y-氨基丁酸，氨酪酸，哌啶酸。廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)。Y-氨基丁酸是為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，它參與多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性，它能促進(jìn)腦的活化性，鎮(zhèn)靜神經(jīng)，抗焦慮，健腦益智，治癲癇，抗哮喘，促進(jìn)睡眠，美容潤膚，延緩腦衰老機(jī)能，能補(bǔ)充人體抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有良好的降血壓功效。促進(jìn)腎機(jī)能改善和保護(hù)作用。抑制脂肪肝及肥胖癥，活化肝功能。在醫(yī)學(xué)上，Y-氨基丁酸可作為診斷酶用于糖尿病的檢驗(yàn)以及診療型酶制劑。 目前國際已報(bào)道的GABA定量測定方法主要有氨基酸分析儀測定法(aminoacid analyzer, AAA)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、薄層掃描法(thin layer chromatography scanning, TLCS)、紙層析法(Paper chromatography)、突光分光光度法(Fluorospectrophotometry)、放射性受體法(Radioreceptorassay, RRA)和基于Berthelot反應(yīng)的比色法、酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。氨基酸分析儀測定法(amino acid analyzer, AAA)方法簡單、單樣成本低、干擾少、穩(wěn)定性好，但需要昂貴的儀器設(shè)備。高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好等優(yōu)勢，但需要昂貴的儀器設(shè)備，而且檢測過程繁瑣、樣本前處理的技術(shù)要求很高，難于操作。檢測人員需要具備專業(yè)的檢測技能和豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。薄層掃描法(thinlayer chromatography scanning,TLCS)易受環(huán)境因素影響。紙層析法(Paper chromatography)簡便易行,耗費(fèi)低,但操作起來比較繁瑣費(fèi)時(shí)、靈敏度和重現(xiàn)性都差，不易采用。突光分光光度法(Fluorospectrophotometry)靈敏度較低且干擾因素較多。放射性受體法(Radioreceptor assay, RRA)不夠穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性也差?；贐erthelot反應(yīng)的比色法,分析試劑較為便宜，分析成本較低，方法快捷,但在測定中次氯酸鈉溶液的使用量是測定結(jié)果的主要影響因素，同時(shí)色澤的穩(wěn)定性對(duì)測定結(jié)果具有較大的影響。而濃度和溫度又是色澤穩(wěn)定性的兩個(gè)較大影響因素。所測定的結(jié)果波動(dòng)性比較大，實(shí)驗(yàn)誤差大。酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)利用抗原-抗體之間特異性的免疫反應(yīng)識(shí)別生物液體中的靶分子，并利用酶-底物的顯色反應(yīng)定量的反應(yīng)待測樣本中靶分子的含量。由于其特異性強(qiáng)、靈敏度、操作簡便及不需大型儀器等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于生物樣本的定量檢測實(shí)驗(yàn)中。[0012]因此，有必要選用一種快速、簡便能夠定量且靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性高的方法來進(jìn)行Y-氨基丁酸的檢測。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型目的是Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其操作簡便，成本低，穩(wěn)定性好，可以滿足普通實(shí)驗(yàn)室的要求。為了實(shí)現(xiàn)本實(shí)用新型的目的，擬采用如下技術(shù)方案本實(shí)用新型一方面涉及一種Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由抗Y-氨基丁酸抗體和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相載體的微孔表面上形成的復(fù)合層。在本實(shí)用新型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的多個(gè)微孔是指96個(gè)微孔。在本實(shí)用新型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的固相載體是聚苯乙烯酶標(biāo)板。本專利通過高效的偶聯(lián)方法的得到穩(wěn)定性好的Y-氨基乙酸-戊二醛-BSA，并通過免疫動(dòng)物得到特異性高及親和力強(qiáng)的抗體，用來制備Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。通過與HPLC法的比較，其精密度、回收率、準(zhǔn)確性和批量檢測樣本等方面均優(yōu)于HPLC法。ELISA法比HPLC法樣品前處理簡單得多，特異性好，無需純化濃縮。另外，ELISA法比HPLC法操作時(shí)間短，一次可處理大量樣品，節(jié)約了大量的人力、物力，提高了工作效率。而且，ELISA法比HPLC法投資小，儀器的使用不需要專業(yè)培訓(xùn)技術(shù)人員，更適合基層單位使用。

圖I為本實(shí)用新型一具體實(shí)施例酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖。I固相載體，2微孔,3包被層。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本實(shí)用新型并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本實(shí)用新型的限定。如圖I所示，本實(shí)用新型試劑盒的酶標(biāo)板，其包括固相載體I和包被層3，固相載體
I采用96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板。固相載體I上有多個(gè)微孔2，包被層3附著在固相載體上的微孔2上。包被層3是包括抗Y-氨基丁酸抗體和牛血清白蛋白的復(fù)合層。本試劑盒應(yīng)用競爭抑制酶聯(lián)免疫分析法測定血清或血漿樣本中Y -氨基丁酸的水平。制備過程如下使用96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時(shí)，使酶標(biāo)板活化。在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)先包被一定濃度的抗體，4°C過夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板。檢測時(shí)，依次加入待測標(biāo)本及生物素化的Y-氨基丁酸，形成待測標(biāo)本中的Y-氨基丁酸和生物素化的Y-氨基丁酸競爭結(jié)合酶標(biāo)板上包被的抗體的局面，再通過親和素化辣根過氧化物酶(HRP)放大信號(hào)，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制備。[0023]2、經(jīng)過對(duì)Y -氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒-系列的質(zhì)量指標(biāo)檢測，包括靈敏度、重復(fù)性、特異性、回收率及線性測定，表明該檢測體系成熟，本試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果a.標(biāo)準(zhǔn)曲線
濃度(pg/ml) Log (濃度)標(biāo)準(zhǔn)品OD值 OD值平均值
24.691.393 1.573 1.3531.463 74.071.870 1.107 0.9391.023 222.222.347 0.692 0.5680.630 666.672.824 0.373 0.2710.322 20003.301 0.109 0.0970.103 b.靈敏度Y -氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測血清標(biāo)本時(shí)最低檢測限為9.68pg/ml ；c.回收率用同一血清樣本分別添加不同量的定值標(biāo)準(zhǔn)品，作回收試驗(yàn)(η = 5)。平均回收率99. 56% (表2)。表2ELISA法測定Y-氨基丁酸的回收試驗(yàn)
定值標(biāo)準(zhǔn)品(pg/ml) 回收率(% )
—1500102. 56
—50097. 85
—15098. 26
—平均回收率99.563、發(fā)明專利技術(shù)路線I中所述的Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的研制方法，其特征在于本發(fā)明的原料的制備和試劑盒的制備方法，比常規(guī)的檢測方法靈敏度更高、特異性好。技術(shù)效果我們對(duì)比了 ELISA法(本公司生產(chǎn)的Y _氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒)和HPLC法定量檢測，可見ELISA法有操作簡單、快捷、試驗(yàn)成本低的特點(diǎn)。表3ELISA法和HPLC法比較
~ELISA 法HPLC 法
I麗過程—簡單—繁瑣
操作時(shí)間__短(2. 5小時(shí)) 長_
人員—普通實(shí)驗(yàn)員專業(yè)培訓(xùn)技術(shù)H
樣本測定數(shù)量/次多__^_
試劑)價(jià)格I低廉昂貴I.精密度實(shí)驗(yàn)用兩法對(duì)高、中、低值質(zhì)控品分別進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法為分別用這兩個(gè)試劑盒測定三個(gè)定值樣本853. 6pg/ml、356. 3pg/ml、96.8pg/ml，每個(gè)樣本重復(fù)測定20次，表4中結(jié)果可見ELISA法精密度較好。表4ELISA法和HPLC法精密度測試
權(quán)利要求1.Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由抗Y-氨基丁酸抗體和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相載體的微孔表面上形成的復(fù)合層。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是所述的多個(gè)微孔是指96個(gè)微孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Y-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是所述的固相載體是聚苯乙烯酶標(biāo)板。
專利摘要本實(shí)用新型公開了γ-氨基丁酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由抗γ-氨基丁酸抗體和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相載體的微孔表面上形成的復(fù)合層。本實(shí)用新型的試劑盒操作簡便，成本低，穩(wěn)定性好，可以滿足普通實(shí)驗(yàn)室的要求。
文檔編號(hào)G01N33/545GK202710552SQ20122005908
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月11日
發(fā)明者楊娟, 李華淵, 童曉玲, 從旭霞, 李慶, 何峰容 申請(qǐng)人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司