專利名稱：檢測呋喃西林代謝物的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測呋喃西林代謝物的試劑盒，特別是檢測動物組織中呋喃西林代謝物的試劑盒。
背景技術(shù)：
硝基呋喃類藥物常作為廣譜類抗生素用于預(yù)防和治療由沙門氏菌和埃希氏菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。但在長時間的實驗研究過程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發(fā)生癌變和基因突變，此類藥物禁止在治療和飼料中使用。由于硝基呋喃類原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速，無法檢測，但其代謝產(chǎn)物因和蛋白質(zhì)結(jié)合而相當(dāng)穩(wěn)定，所以在分析此類藥物的殘留時經(jīng)常要分析其代謝后的產(chǎn)物，管理部門就以檢測代謝產(chǎn)物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。目前用來檢測硝基呋喃類代·謝物的最常用方法是高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)等，這些方法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、假陽性少，但樣品前處理過程復(fù)雜，儀器化程度高價格昂貴，與之相比，免疫方法具有靈敏度高、樣品預(yù)處理簡單、短暫的檢測時間、較大的檢測樣本量等特點，適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣品的篩查。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種靈敏度高、成本低、操作簡單、檢測時間短的檢測呋喃西林代謝物的試劑盒。本實用新型的試劑盒，其包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，微孔試劑條的反應(yīng)孔上具有微孔塞，其中凍干有呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應(yīng)膜上具有包被有呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。樣品吸收墊位于底板始端，吸水墊位于底板末端，檢測線和質(zhì)控線平行，質(zhì)控線位于距離吸水墊始端與反應(yīng)膜相連處5-8mm，檢測線位于距離質(zhì)控線5_6mm。試紙條樣品吸收墊上檢測端粘貼有保護膜，保護膜上有MAX標(biāo)記線。本實用新型試劑盒中試紙條底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護膜為PE材質(zhì)保護膜；試劑盒盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質(zhì)支撐材料。本實用新型試劑盒具有如下有益效果I.靈敏度高。呋喃西林代謝物檢測試劑盒以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。其中的呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。因此，本實用新型試劑盒具有較高的特異性和靈敏度。本試劑盒對呋喃西林代謝物的檢測靈敏度為I μ g/L。2.顯示檢測結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。檢測時試紙條以顯示紅色線“ I ”及“ 11 ”印跡作為陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示在被檢測樣本液中呋喃西林代謝物含量高于等于試劑盒對呋喃西林代謝物的最低檢測限，兩條紅線“ 11 ”印跡表示在被檢測樣本中呋喃西林代謝物含量低于試劑盒對呋喃西林代謝物的最低檢測限，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確、簡單明了，不容易出現(xiàn)結(jié)果誤判。3.成本低，投資少。使用本實用新型試劑盒，不需另配儀器設(shè)備及其他試劑，使現(xiàn)場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。4.易于大范圍推廣應(yīng)用。試劑盒操作簡單，能較好滿足動物組織檢測的需求，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。

圖I為本實用新型試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實用新型試紙條俯視圖；圖3為本實用新型微孔試劑圖；圖4為本實用新型試紙條檢測結(jié)果判定圖；圖5為本實用新型試劑桶結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為本實用新型固定用具俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定用具側(cè)視圖。
具體實施方式
一、呋喃西林代謝物檢測試劑盒的組裝制備I)試紙條樣品吸收墊I、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊位于底板始端，吸水墊位于底板末端，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，試紙樣品吸收墊上檢測端粘貼有保護膜，保護膜上印有MAX標(biāo)記線，檢測線4包被有呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線5包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。2)微孔試劑條微孔試劑條8具有微孔塞9，板孔中凍干有呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。3)將I)試紙條和2)微孔試劑條裝入具有密封蓋的塑料試劑桶10，將塑料試劑桶放置于試劑盒盒體12內(nèi)的固定用具11中。二、試劑盒的使用I、樣品前處理[0028]稱取5. 0g±0. 05g均質(zhì)的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml 10%三氯乙酸，再加入100 μ I衍生化試劑(向裝有151mg 2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加入IOml甲醇溶解混勻)，充分振蕩3min ;在60°C溫箱中孵育I. 5h ;取出依次加入Iml O. 5mol/L磷酸氫二鉀溶液、I. 5ml 2mol/L氫氧化鈉溶液和IOml乙酸乙酯，振蕩10s，脂肪含量高的樣本輕微振蕩8-10下，以防樣本乳化；3000g以上，室溫(20-25°C )離心5min ;取8ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，渦動30s，再加O. 8ml樣品復(fù)溶液(O. 2mol/L磷酸鹽緩沖液)，渦動IOs充分混勻；3000g以上，室溫(20-250C )離心5min ;除去上層有機相，取下層100 μ I用于分析。2、用試劑盒檢測用微量移液器吸取100 μ I復(fù)溶的樣本液，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，將標(biāo)記好的試紙條插入微孔中——印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中；室溫 (200C -250C )孵育5min后，取出試紙條，判定結(jié)果。三、檢測結(jié)果分析呋喃西林代謝物在樣品中的含量高于等于試劑盒對其的最低檢測限時，呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與藥物結(jié)合，金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點被封閉，從而在檢測區(qū)內(nèi)因為競爭反應(yīng)，不會與呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示。陽性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，試紙條以顯示紅色線“I”，判為陽性，如圖4. a圖所示。陰性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帶，試紙條以顯示紅色線為“ 11 ”，判為陰性，如圖4. b所示。無效當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙條判為無效，如圖4. c、4. d所示。四、檢測試劑盒中用到的材料制備方法I、呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定(I)呋喃西林代謝物半抗原的制備a.取l.Og對羥基苯甲醛溶于乙腈中，加入0.32g碳酸鉀，O. Ig碘化鈉，攪拌。力口入溴乙酸乙酯O. 44g，裝上回流冷凝管，80°C攪拌過夜。反應(yīng)停止后，蒸干乙腈，加水溶解，乙酸乙酯萃取，蒸干上硅膠柱，石油醚乙酸乙酯=5 I過柱純化得產(chǎn)物I. OSg ；b.取步驟a得到的I. 08g產(chǎn)物溶于乙醇中，加氫氧化鉀O. 5g，70°C攪拌4h。反應(yīng)停止后，蒸干乙醇，加水溶解，調(diào)節(jié)PH值到6，加60ml X3乙酸乙酯萃取三次，合并有機相，蒸干，上硅膠柱，石油醚乙酸乙酯=3 I洗脫得產(chǎn)物0.73g;c.取步驟b得到的O. 7g產(chǎn)物加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，在攪拌下加O. 41g呋喃西林代謝物的甲醇溶液5ml，60°C攪拌4h。反應(yīng)停止后，蒸干溶劑，加乙醇重結(jié)晶得半抗原產(chǎn)物O. 53g。(2)免疫原的制備取12mg呋喃西林代謝物半抗原用O. 8ml DMF溶解，冷卻至10°C，得到溶液I ;取氯甲酸異丁酯 ο μ I加入溶液I中，10°c攪拌反應(yīng)IOmin得到溶液II ;取40mg牛血清白蛋白(BSA)用 3. 2ml50mmol/LNa2C03溶解與溶液 II 10°C反應(yīng)4h，然后 4°C過夜；用 O. OImoI/LPBS4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?3)包被原的制備取12mg呋喃西林代謝物半抗原，溶解于Iml DMF中，得到溶液I ;取15mg碳化二亞胺(EDC)用O. 2ml水充分溶解后加入溶液I中，室溫下攪拌24h，即可得到溶液II ;稱取卵清白蛋白(OVA) 30mg，使之充分溶解在3. 8ml水中，將溶液II逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用O. Olmol/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?4)呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、呋喃西林代謝物半抗原、呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物 用ρΗ7· 4的PBS配成O. 5mg/mL的溶液，以O(shè). Olmol/L pH7. 4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200-800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、呋喃西林代謝物半抗原、呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明呋喃西林代謝物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備a.動物免疫將步驟I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)
生抗血清。b.細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按8 I (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌呋喃西林代謝物單克隆抗體的雜交瘤細胞株。c.細胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成5X IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(I)膠體金的制備用雙蒸去離子水將I %氯金酸(購于sigma公司)稀釋成O. 01% (質(zhì)量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉(購于廣州化學(xué)試劑廠)，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。(2)呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用O. 2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7. 2，按每毫升膠體金溶液中加入50 100 μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述呋喃西林代謝物單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻IOminJPA 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000rpm，4°C離心40mi n，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。復(fù)溶緩沖液含牛血清白蛋白(BSA) O. I % O. 3 % (體積百分含量)、吐溫-800. 05% O. 2% (質(zhì)量百分含量)、ρΗ7· 2的O. 02mol/L磷酸鹽緩沖液。5、將呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ I呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物,放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50°C條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞，密封保存。6、樣品吸收墊的準(zhǔn)備將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為O. 5%(體積百分含量))、pH為7. 2,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C烘2h備用。7、反應(yīng)膜的制備包被過程用磷酸緩沖液將呋喃西林代謝物半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL,用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T)，包被量為I. O μ g/cm2 ;用O. 01mol/L、pH 7. 4PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(0，包被量為1.(^8/(^2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
權(quán)利要求1.一種檢測呋喃西林代謝物的試劑盒，其特征在于試劑盒包括試劑盒盒體、具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑桶中包括微孔試劑條和8個試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)膜上具有包被有呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“ I ”。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述樣品吸收墊位于底板始端，所述吸水墊位于底板末端，所述質(zhì)控線位于距離吸水墊始端與反應(yīng)膜相連處5-8mm，所述檢測線位于距離質(zhì)控線5_6mm。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試紙條樣品吸收墊上的檢測端粘貼有保護膜，保護膜上有MAX標(biāo)記線。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述底板可為PVC底板，樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙，吸水墊為吸水紙，反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。
6.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述微孔試劑條有8個反應(yīng)孔，反應(yīng)孔上具有微孔塞。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述微孔試劑中凍干有呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
8.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒盒體為硬紙盒，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具是硬質(zhì)支撐材料。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測呋喃西林代謝物的試劑盒，試劑盒包括試劑盒盒體，具有12個孔的固定用具及放置其中的12個具塞試劑桶，試劑盒中包括微孔試劑條和試紙條，試紙條由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成，呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中。反應(yīng)膜上具有包被有呋喃西林代謝物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡“|”和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡“|”。本實用新型試劑盒具有便攜性好，靈敏度高，檢測時間短等特點，可以在呋喃西林代謝物殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/558GK202720229SQ20122014419
公開日2013年2月6日 申請日期2012年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月7日
發(fā)明者何方洋, 羅曉琴, 陶光燦, 吳鵬, 陳煒玲, 張荃, 馮才茂, 楊秀賢, 劉玉梅 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司