專利名稱：一種殺蟲晶體蛋白BT-Cry1C膠體金免疫層析速測(cè)卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡。
技術(shù)背景蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽(yáng)性菌，在芽孢形成時(shí)產(chǎn)生的具有高度特異性殺蟲活性的晶體蛋白，稱為殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal protein, ICPs)。ICP常以原毒素形式存在，當(dāng)昆蟲取食ICP后,在昆蟲消化道內(nèi)，在中腸消化酶的作用下，原毒素被活化即降解成具有毒性的多肽，活化的毒素分子與昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的特異受體結(jié)合，致使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些穿孔，破壞細(xì)胞的滲透平衡，引起細(xì)胞腫脹裂解，使昆蟲幼蟲停止取食，最終導(dǎo)致死亡。目前，Bt殺蟲蛋白基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用中最廣泛、最具有潛力和應(yīng)用前景的抗蟲基因。其中，Cry殺蟲蛋白對(duì)鱗翅目等多種害蟲具有毒殺作用，因此被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物。例如，CrylC基因被應(yīng)用于抗蟲水稻等轉(zhuǎn)基因作物。轉(zhuǎn)基因作物的飛速發(fā)展在帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，人們也越來(lái)越關(guān)注轉(zhuǎn)基因作物可能帶來(lái)的不可預(yù)期的食用安全及環(huán)境安全性問(wèn)題，越來(lái)越多的國(guó)家要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)以實(shí)行標(biāo)識(shí)制度。免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、檸檬酸鈉等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金標(biāo)記技術(shù)是免疫層析快速診斷的核心技術(shù)，它以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。目前，將現(xiàn)有的免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用到檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源蛋白中，仍然存在許多問(wèn)題，例如，特異性差，靈敏度不高，成本高，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需對(duì)現(xiàn)有免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，研制特異性強(qiáng)，靈敏度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源蛋白的新方法。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是設(shè)計(jì)一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，該速測(cè)卡特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中BT-CrylC蛋白的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)以及安全性評(píng)價(jià)。為達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案如下一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其包括卡殼和卡殼內(nèi)的試紙條，其中，所述試紙條包括底板、粘著在底板上依次相連的樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水墊。進(jìn)一步，所述卡殼上設(shè)有加樣孔和觀察窗。所述加樣孔設(shè)于對(duì)應(yīng)所述樣品墊上方殼體，所述觀察窗設(shè)于對(duì)應(yīng)所述反應(yīng)膜上方殼體。所述樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水墊之間設(shè)有l(wèi)_2mm的重疊區(qū)。又,所述金標(biāo)墊包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體-膠體金結(jié)合物。所述反應(yīng)膜上設(shè)有包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體的檢測(cè)線和包被羊抗兔IgG的質(zhì)控線；所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線間隔0. 5-1. Ocm0所述底板為PVC(聚氯乙烯)板，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜。所述樣品墊由玻璃纖維膜或?yàn)V紙制成，所述吸水墊由濾紙制成。本實(shí)用新型膠體金免疫層析速測(cè)卡的使用(I)待測(cè)樣品前處理若待測(cè)樣品為水和植物組織提取液等液體物質(zhì)時(shí)，可直接取50iU樣品檢測(cè)。若待檢樣品為植物葉片、莖干、種子等樣品時(shí)，則需要將樣品進(jìn)行預(yù)處理，即將樣品磨碎，加入樣品處理液(5mM PBS pH 7.4)搖勻，靜置后取上清50 檢測(cè)。(2)檢測(cè)將所取樣品滴入加樣孔內(nèi)，室溫下作用5-10min，然后觀察結(jié)果。(3)檢測(cè)結(jié)果分析陽(yáng)性質(zhì)控線、檢測(cè)線均呈現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明樣本中有CrylC蛋白存在。陰性檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色條帶，質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明樣本中沒(méi)有CrylC蛋白存在。失效如果檢測(cè)線、質(zhì)控線均不出現(xiàn)紅色條帶或僅有檢測(cè)線出現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明試紙條失效。本實(shí)用新型的有益效果I.本實(shí)用新型特異性強(qiáng)，靈敏度高。2.操作方法簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)時(shí)間短。本實(shí)用新型不需要使用其他特殊儀器、設(shè)備，只要將待測(cè)樣品滴入加樣孔內(nèi)，加樣后10分鐘內(nèi)即可從觀察窗觀察到結(jié)果，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。3.本實(shí)用新型使用抗CrylC的多克隆抗體，成本低，并且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可以用于檢測(cè)不同樣品，應(yīng)用范圍廣。

圖I為本實(shí)用新型一實(shí)施例試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實(shí)用新型一實(shí)施例試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本實(shí)用新型一實(shí)施例卡殼的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為本實(shí)用新型一實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性示意圖；圖5為本實(shí)用新型一實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果呈陰性示意圖；圖6為本實(shí)用新型一實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果失效示意圖之一；圖7為本實(shí)用新型一實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果失效示意圖之二。
具體實(shí)施方式
[0032]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。參見圖I-圖7，本實(shí)用新型的一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其包括卡殼I和卡殼內(nèi)的試紙條2，其中，所述試紙條2包括底板3、粘著在底板3上依次相連的樣品墊4、金標(biāo)墊5、反應(yīng)膜6和吸水墊7。進(jìn)一步，所述卡殼I上設(shè)有加樣孔8和觀察窗9，所述加樣孔8設(shè)于對(duì)應(yīng)所述樣品墊4上方殼體,所述觀察窗9設(shè)于對(duì)應(yīng)所述反應(yīng)膜6上方殼體。所述依次相連的樣品墊4、金標(biāo)墊5、反應(yīng)膜6和吸水墊7之間設(shè)有l(wèi)_2mm的重疊區(qū)。又,所述金標(biāo)墊5包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體_膠體金結(jié)合物。所述反應(yīng)膜6上設(shè)有包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體的檢測(cè)線61和包被羊抗兔IgG的質(zhì)控線62,所述檢測(cè)線61和所述質(zhì)控線62間隔0. 5cm。所述底板3為PVC板，所述反應(yīng)膜6為硝酸纖維素膜。所述樣品墊4由玻璃纖維膜或?yàn)V紙制成，所述吸水墊7由濾紙制成。本實(shí)施例膠體金免疫層析速測(cè)卡的使用(I)待測(cè)樣品前處理若待測(cè)樣品為水和植物組織提取液等液體物質(zhì)時(shí)，可直接取50iU樣品檢測(cè)。若待檢樣品為植物葉片、莖干、種子等樣品時(shí)，則需要將樣品進(jìn)行預(yù)處理，即將樣品磨碎，加入樣品處理液(5mM PBS pH 7. 4)搖勻，靜置后取上清50 檢測(cè)。(2)檢測(cè)將所取樣品滴入加樣孔8內(nèi)，室溫下作用5-10min，然后從觀察窗9觀察結(jié)果。(3)檢測(cè)結(jié)果分析陽(yáng)性檢測(cè)線61、質(zhì)控線62均呈現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明樣本中有CrylC蛋白存在，如圖4所示。陰性檢測(cè)線61不出現(xiàn)紅色條帶，質(zhì)控線62呈現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明樣本中沒(méi)有CrylC蛋白存在，如圖5所示。失效如果僅有檢測(cè)線61出現(xiàn)紅色條帶或檢測(cè)線61、質(zhì)控線62均不出現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明試紙條失效，如圖6、圖7所示。
權(quán)利要求1.一種殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，包括卡殼和卡殼內(nèi)的試紙條，其特征在于，所述試紙條包括底板、粘著在底板上依次相連的樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水墊。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述卡殼上設(shè)有加樣孔和觀察窗；所述加樣孔設(shè)于對(duì)應(yīng)所述樣品墊上方殼體，所述觀察窗設(shè)于對(duì)應(yīng)所述反應(yīng)膜上方殼體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水墊之間設(shè)有l(wèi)_2mm的重疊區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述金標(biāo)墊包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體-膠體金結(jié)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述反應(yīng)膜上設(shè)有包被殺蟲蛋白BT-CrylC多克隆抗體的檢測(cè)線和包被羊抗兔IgG的質(zhì)控線。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線間隔O. 5-1. Ocm0
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述底板為PVC板，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺蟲晶體蛋白BT-CrylC膠體金免疫層析速測(cè)卡，其特征在于，所述樣品墊由玻璃纖維膜或?yàn)V紙制成，所述吸水墊由濾紙制成。
專利摘要一種殺蟲晶體蛋白BT-Cry1C膠體金免疫層析速測(cè)卡，包括卡殼和卡殼內(nèi)的試紙條，所述試紙條包括底板、粘著在底板上依次相連的樣品墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水墊；所述卡殼上開有加樣孔和觀察窗；所述加樣孔設(shè)于對(duì)應(yīng)所述樣品墊上方殼體，所述觀察窗設(shè)于對(duì)應(yīng)所述反應(yīng)膜上方殼體，本實(shí)用新型的膠體金免疫層析速測(cè)卡特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中BT-Cry1C蛋白的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)以及安全性評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK202583212SQ201220149539
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者唐雪明, 趙凱, 楊奇, 吳瀟, 王金斌, 何建華, 蔣瑋, 陳建中, 陳大超 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院