專利名稱：人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELI SA)試劑盒。
背景技術(shù)：
胃泌素(GT)是一種重要的胃腸激素，它主要由G細(xì)胞分泌。G細(xì)胞是典型的開(kāi)放型細(xì)胞，以胃竇部最多，其次是胃底、十二指腸和空腸等處。人胰島的D細(xì)胞亦能分泌胃泌素，1978年Rehfeld證明人的腦脊液和某些腦組織中存在胃泌素，胃泌素幾乎對(duì)整個(gè)胃腸道均有作用，它可促進(jìn)胃腸道的分泌功能，能刺激ECL細(xì)胞分泌組胺，間接促進(jìn)壁細(xì)胞分泌鹽酸；促進(jìn)胃竇，胃體收縮，增加胃腸道的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)促進(jìn)幽門(mén)括約肌舒張，故其主要作用是促進(jìn)胃排空；促進(jìn)胃及上部腸道粘膜細(xì)胞的分裂增殖；促進(jìn)胰島素和降鈣素的釋放。胃泌 素還能刺激胃泌酸腺區(qū)黏膜和十二指腸黏膜的DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。產(chǎn)物以氨基酸的長(zhǎng)度分成五種GT-71、GT-52、GT-34、GT-17、GT-14。GT-14有14個(gè)氨基酸，而14個(gè)氨基酸就有全部的生理活性。近年發(fā)現(xiàn)，頰粘膜、舌、食道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)也含有胃泌素。在臨床上能觀察到，切除胃竇的病人，血清胃泌素水平下降，同時(shí)可發(fā)生胃粘膜萎縮；在患有胃泌素瘤的病人，血清胃泌素水平很高，且多伴有胃粘膜的增生、肥厚。血清胃泌素是胃泌素瘤診斷和療效監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。血清胃泌素測(cè)定是一種特殊的診斷手段，正常人和消化性潰瘍病患者空腹血清胃泌素為50 150pg/ml，本病常大于500pg/ml，甚者高達(dá)1000pg/ml。當(dāng)空腹血清胃泌素大于1000pg/ml，伴有相應(yīng)的臨床癥狀者，可確診為本病。惡性貧血患者的空腹血清胃泌素顯著增高，平均值為1000pg/ml，甚至高達(dá)10000pg/ml。其他如胃竇G細(xì)胞增生、腎功能衰竭、甲狀腺功能亢進(jìn)、萎縮性胃炎、殘留胃竇及H2受體阻斷劑、酸泵抑制劑的治療，均可使血清胃泌素增高，應(yīng)注意鑒別。通過(guò)胃液分析和血清胃泌素的測(cè)定，約95%以上的患者可確立診斷。目前報(bào)道的GT定量測(cè)定方法主要是放射免疫法。放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好，常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)等諸多不足，RIA將逐漸被取代。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。利用抗原-抗體之間特異性的免疫反應(yīng)識(shí)別生物液體中的靶分子，并利用酶-底物的顯色反應(yīng)定量的反應(yīng)待測(cè)樣本中靶分子的含量。它是基于RIA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，ELISA在繼承了 RIA的高靈敏度、精密度好的特點(diǎn)，同時(shí)ELISA還克服了 RIA的一些缺點(diǎn)，如放射污染、試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)等，現(xiàn)廣泛用于生物樣本的定量檢測(cè)試驗(yàn)中。制備高質(zhì)量的ELISA試劑盒的關(guān)鍵因素是抗原和其對(duì)應(yīng)的高特異性、高親和力的抗體。但是如前所述，GT是分子量小于IOkD的多肽。通常情況下，分子量在5kD以下的肽類一般無(wú)免疫原性；分子量在5-10kD之間的肽類的免疫原性較弱。因此，本專利旨在將GT偶聯(lián)到大分子的載體蛋白上，賦予GT較強(qiáng)的免疫原性，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生大量針對(duì)GT的高特異性和高親和力的抗體，為試劑盒的制備提供高質(zhì)量的原材料。因此，有必要選用一種快速、簡(jiǎn)便能夠定量且靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性高的方法來(lái)進(jìn)行胃泌素的測(cè)定。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型目的是提供人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，成本低，穩(wěn)定性好，可以滿足普通實(shí)驗(yàn)室的要求。為了實(shí)現(xiàn)本實(shí)用新型的目的，擬采用如下技術(shù)方案本實(shí)用新型一方面涉及人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述封閉層位于包被層上。在本實(shí)用新型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的包被層含有人胃泌素抗體，所述的封閉層包含有牛血清白蛋白。在本實(shí)用新型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的多個(gè)微孔是指96個(gè)微孔。在本實(shí)用新型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的固相載體是聚苯乙烯試劑板。本實(shí)用新型的試劑盒一次可處理大量樣品，節(jié)約了大量的人力、物力，提高了工作效率。

圖I為本實(shí)用新型一具體實(shí)施例酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖。I固相載體，2包被層,3封閉層。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本實(shí)用新型并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本實(shí)用新型的限定。本試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定血清或血漿樣本中GT的水平。制備過(guò)程如下使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時(shí)，使PS板活化。在試劑板微孔條上預(yù)先包被一定濃度的抗體，4°C過(guò)夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板。檢測(cè)時(shí)，依次加入待測(cè)標(biāo)本及生物素化的GT，形成待測(cè)標(biāo)本中的GT和生物素化的GT競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)板上包被的抗體的局面，再通過(guò)親和素化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)放大信號(hào)，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的制備。人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的制備方法，其具體步驟為a、GT全抗原的制備將60mg GT與50mg牛血清白蛋白溶于4mL O. lmol/L磷酸鈉緩沖液(PB, pH 7. 4)中，加O. 2mL 25%的偶聯(lián)劑戊二醛(GA)連接成GT-GA-BSA復(fù)合物，室溫反應(yīng)20h后，用
O.Olmo 1/L磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0-7. 4)透析。b、抗人GT抗體的制備[0021]健康雄性新西蘭大白兔I只，用GT-GA-BSA復(fù)合物免疫。將上述透析后的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行紫外掃描、蛋白質(zhì)譜、BCA(或其它方法如Bradford)進(jìn)行偶聯(lián)比例的分析及蛋白的定量。蛋白定量后分裝凍干_80°C保存。取上述凍干偶聯(lián)產(chǎn)物若干，用高壓除菌的蒸餾水或去離子水重懸GT-GA-BSA至終濃度為200 μ g/mL。取600 μ I重懸好的GT-GA-BSA然后加入等體積的弗氏完全佐劑充分乳化混勻。兔后足墊、背部皮下多點(diǎn)免疫。14d后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量與基礎(chǔ)免疫劑量相同。每?jī)芍苊庖咭淮?，共免疫四次，第四次免疫?4天，從頸動(dòng)脈取全血，測(cè)定抗體效價(jià)。C、人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的研制人胃 泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定血清或血漿樣本中GT的水平。制備過(guò)程如下使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時(shí)，使PS板活化。在試劑板微孔條上預(yù)先包被一定濃度的抗體，4°C過(guò)夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板。檢測(cè)時(shí)，依次加入待測(cè)標(biāo)本及生物素化的GT，形成待測(cè)標(biāo)本中的GT和生物素化的GT競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)板上包被的抗體的局面，再通過(guò)親和素化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)放大信號(hào)，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的制備。2、經(jīng)過(guò)對(duì)試劑盒一系列的質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)，包括靈敏度、重復(fù)性、特異性、回收率及線性測(cè)定，表明該檢測(cè)體系成熟，本試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果a.標(biāo)準(zhǔn)曲線
濃度 Log
、標(biāo)準(zhǔn)品OD值OD值平均值
(pg/ml) (濃度)
18. 52I. 27I. 9182.038I. 978
55.56I. 74I. 372I. 3911.3815
166.672.22O. 912O. 881O. 8965
5002. 70O. 533O. 511O. 522
I, 5003. 18O. 2550.2660.2605表I人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線b.靈敏度ELI SA法檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí)最低檢測(cè)限為6. 14pg/ml ；c.回收率用同一血清樣本分別添加不同量的定值標(biāo)準(zhǔn)品，作回收試驗(yàn)(η = 5)。平均回收率98. 73% (表2)。
定值標(biāo)準(zhǔn)品(pg/ml) 回收率(％ )
~1200106. 78500^~102. 52
10097.86
平均回收率98. 73表2人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒回收率測(cè)試3、實(shí)用新型專利技術(shù)路線I中所述的人胃泌素酶聯(lián)免疫試劑盒的研制方法，其特征在于本實(shí)用新型的原料的制備和試劑盒的制備方法，比常規(guī)的檢測(cè)方法靈敏度更高、特異性好。技術(shù)效果我們對(duì)比了 ELISA法(本公司生產(chǎn)的人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒)和RI A 法定量檢測(cè)，可見(jiàn)ELI SA試劑盒有操作簡(jiǎn)單、快捷、試驗(yàn)成本低的特點(diǎn)。
ELISA 法RIA 法
保質(zhì)期 6個(gè)月6周
檢測(cè)限 15. 6-1000 pg/ml10-1280 pg/ml
靈敏度4. 83 pg/ml45. 7pg/ml
操作時(shí)間 2. 5小時(shí)2-3天
防護(hù)措施放射人員防護(hù)服，防護(hù)眼鏡，手
普通實(shí)驗(yàn)服，手套
套
實(shí)驗(yàn)室條件普通實(shí)驗(yàn)室放射性同位素實(shí)驗(yàn)室
實(shí)驗(yàn)廢物毒性小，無(wú)需特殊處理對(duì)環(huán)境影哈大，需特殊處理表3EL I SA法和RI A法比較實(shí)施例I.精密度實(shí)驗(yàn)用兩法對(duì)高、中、低值質(zhì)控品分別進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法為分別用這兩個(gè)試劑盒測(cè)定三個(gè)定值樣本967. 3pg/ml、405. 6pg/ml、57. 8pg/ml，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定20次，表4中結(jié)果可見(jiàn)ELISA方法精密度較好。
權(quán)利要求1.人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述封閉層位于包被層上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，所述的包被層含有人胃泌素抗體，所述的封閉層包含有牛血清白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，所述的多個(gè)微孔是指96個(gè)微孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，所述的固相載體是聚苯乙烯試劑板。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了人胃泌素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述封閉層位于包被層上。本實(shí)用新型的試劑盒一次可處理大量樣品，節(jié)約了大量的人力、物力，提高了工作效率。
文檔編號(hào)G01N33/543GK202583193SQ20122022443
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月13日
發(fā)明者楊娟, 李華淵, 李慶, 童曉玲, 從旭霞, 何峰容 申請(qǐng)人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司