專利名稱：一種檢測畜肉中萊克多巴胺的免疫膠體金試劑板的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測畜肉中萊克多巴胺的免疫膠體金試劑板，具體涉及一種檢測畜肉中萊克多巴胺的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術：
萊克多巴胺(Ractopamine)與鹽酸克倫特羅(瘦肉精)同屬β_興奮劑類藥物中的一員，對人體危害性同樣很大。而且本品能夠顯著提高肥育豬的生產性能，改善飼料利用效率，顯著提高豬的瘦肉率，在豬體內代謝較克倫特羅迅速更加不易檢測。美國FDA于2003年7月份批準該藥品僅作為飼料添加劑在養(yǎng)豬生產中使用，目前我國農業(yè)部和別的國家全面禁止該物質的使用。隨著克倫特羅等藥物被世界各國禁止作為飼料添加劑使用，萊克多巴胺的非法使用日趨嚴重。但其檢測方法與克倫特羅等其它β_興奮劑相比較為落后。因此建立動物食品中萊克多巴胺的殘留檢測方法迫在眉睫。國外在對萊克多巴胺的檢測方面已經進行了較多的研究但是國內尚未見有關這方面的報道。萊克多巴胺屢禁不止的原因還因為目前的檢測方法主要為高效液相色譜質譜聯(lián)用法(HPLC-MS)和氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)。這些檢測方法不能適應市場監(jiān)督需要快速、簡便、價廉的要求。免疫分析法常用的有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫層析法(GICA)。ELISA法具有檢測量大，操作相對簡單等優(yōu)點，越來越多地被用于動物性食品中萊克多巴胺殘留的檢測，但是ELISA法整個操作時間仍需要l_2h，且需用到特殊的儀器設備，具有一定局限性。膠體金免疫層析法是二十世紀九十年代興起的一項新型的快速免疫學檢測技術。該方法將反應所需要原料的全部或大部分整合到試劑中，可在5-10min內完成對樣品中β_興奮劑類藥物的定性和半定量測定，具有簡單、快速、靈敏度高等特點，無須儀器設備配合測定，檢測既可在實驗室中進行，也可在養(yǎng)殖場等進行實地測定。

實用新型內容本實用新型針對檢測需求，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測時間短，適合現(xiàn)場快速檢測，技術產品或儀器設備成本較低，運行費用低的快速檢測試劑。本實用新型試劑板應用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應顯色，特異性檢測畜肉中的萊克多巴胺殘留水平。如果樣品溶液中含有萊克多巴胺殘留，萊克多巴胺先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的萊克多巴胺藥物占據(jù)而無法與檢測線上萊克多巴胺特異性抗原結合；當樣品中的萊克多巴胺含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色比控制線淺或無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中萊克多巴胺含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色比控制線深或一樣深，判定為陰性。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1-2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。膠體金結合墊上包被有抗萊克多巴胺單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有萊克多巴胺-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯(lián)萊克多巴胺的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白
坐寸o本實用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標示各功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部 分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結合墊，由聚酯膜制成，其上有抗萊克多巴胺單克隆抗體與膠體金顆粒的結合物，為樣品溶液中有效成分和金標抗體反應提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應過程中多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本實用新型試劑板對萊克多巴胺的交叉反應率為100%，對如鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇等￠-興奮劑類藥物的交叉反應率均低于I %?？梢?，本實用新型試劑板對萊克多巴胺反應具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實用新型試劑板對樣品中萊克多巴胺的檢出限為5ppb(樣品制備方法簡單)、lppb (樣品制備方法復雜)，試劑板適用于各類企業(yè)及檢測機構。(3)操作簡單快捷。本實用新型試劑板將反應所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顏色深淺讀取結果。檢測實施過程不依賴任何實驗設備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓。(4)成本低，易推廣。本實用新型試劑板生產工藝簡單,流程成熟。生產成本低廉，投資少，收效快。

圖I為萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結構示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結合墊，3為硝酸纖維素膜,4為檢測線,5為控制線,6為吸水墊,7為不干膠,8為PVC底板。圖2為萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定陰性示意圖，圖4為萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定陽性示意圖，圖5為萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定無效示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。
具體實施方式
[0024]本實用新型試劑板的制備包括載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗萊克多巴胺單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標記抗萊克多巴胺單克隆抗體的制備和萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。I.半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)稱取34mg鹽酸萊克多巴胺,溶于2mL卩比唳中，加入12mg戍二酸酐，室溫下攪拌過夜；氮氣吹干；將產物溶解到4mLN’ N-二甲基甲酰胺(DMF)和1，4_ 二氧六環(huán)混合溶液中(兩者體積比為I : 1)，加入26.2yL三正丁胺，冰浴攪拌lOmin，加入氯甲酸異丁酯14. 3 μ L，室溫攪拌反應Ih ;將上述混合物逐滴加入到預冷的BSA溶液中(IOOmg BSA溶于O. lmol/LpH8. 5的硼酸鈉溶液)，室溫攪拌過夜；用O. OlmoL/L ρΗ7· 4的PBS緩沖液透析3天，每天換液3次。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同樣方法制備萊克多巴胺半抗原-卵清蛋白偶聯(lián) 物。2.抗來克多巴胺單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的萊克多巴胺半抗原-BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規(guī)方法進行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初篩選擇10mg/L萊克多巴胺半抗原-BSA包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(l 1000)，oro顯色。篩選出的陽性孔再用卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L萊克多巴胺溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標板中。另外用PBS(O. Olmol/L、pH7. 4)替代萊克多巴胺溶液作對照，其余步驟同上。若萊克多巴胺阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細胞株擴大培養(yǎng)，細胞濃度達5 X 105/mL時停止換液，細胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株IO7個細胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1%檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標記抗萊克多巴胺單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8. O。邊攪拌邊加入I. 5mg抗萊克多巴胺單抗，攪拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 緩沖液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解,用0. 22 μ m無菌過濾器過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點膜機把適當濃度的載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標記萊克多巴胺單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.萊克多巴胺免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. I樣品制備(I)樣品簡單制備方法稱取4g左右剪碎的動物組織樣本裝于5mL刻度冷凍管中，蓋緊管蓋，于90°C以上水浴鍋中水浴10分鐘；冷卻至常溫后，取3滴煮出的溶液(盡量吸取上清)于1.5ml離心管中，再加入3滴SAL專用PBST緩沖液，充分混合，待檢。(2)樣品復雜制備方法取去脂肪組織樣本于均質機中均質Imin ;稱取2. 5g均質物于15mL離心管中，力口A 5mL0. IM HCl，振蕩混勻IOmin ;加入100 u L 4M NaOH,劇烈振蕩30秒后，室溫下4，OOOr/min,離心15min ;轉移全部上清于15mL離心管中，加入50 y L4MNaOH,振蕩混勻，再加入8mL乙酸乙酯，振蕩5min;取上層有機相6mL于試管中，65°C氮(空)氣吹干；向吹干的試管中依次加入0. 3mL正己烷和0. 3mL SAL專用PBST緩沖液，充分溶解試管壁上殘留物，靜置分層后，吸取下層溶液，待檢。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100 U L滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結果應在3 5min讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結果判讀讀取結果時，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側所示。陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表示樣品中萊克多巴胺殘留含量低于檢測限或不含萊克多巴胺殘留。如圖3所示。陽性(+) :T線線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中萊克多巴胺殘留含量高于檢測限。如圖4所示。無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，并用新的試劑板重新測試。如圖5所示。
權利要求1.一種檢測畜肉中萊克多巴胺的免疫膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l(wèi)-2mm的重疊。
2.如權利要求I所說的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線。
3.如權利要求I所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權利要求I所說的試劑板，其特征在于，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測畜肉中萊克多巴胺的免疫膠體金試劑板，可用于檢測畜肉中是否有萊克多巴胺殘留。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程最短只需15分鐘左右，且無需任何昂貴實驗設備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合屠宰企業(yè)及政府檢測機構檢測需求。
文檔編號G01N33/577GK202814979SQ20122027061
公開日2013年3月20日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權日2012年6月4日
發(fā)明者王森, 張少恩, 桑麗雅 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司, 紹興市農業(yè)科學研究院