專利名稱：檢測β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測0 -內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素的試紙條，特別是檢測牛奶中￠-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素的試紙條。
背景技術(shù)：
抗生素主要指由微生物產(chǎn)生的、能抑制或殺死其他微生物的一類化學(xué)物質(zhì)，在乳業(yè)中常用￠-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等抗生素藥物作用畜類乳房炎、子宮炎等疾病的治療，也有生產(chǎn)者在飼料中添加抗生素，以改善畜禽的飼料轉(zhuǎn)化率。美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)的調(diào)查表明不注意休藥期、用藥不合理或是使用違禁藥物，是導(dǎo)致動物性食品中抗生素殘留的主要原因。長期攝入含抗生素的食品，可造成藥物積累，當(dāng)達到一定濃度后，就會對人體的健康帶來一系列負面影響，如產(chǎn)生過敏反應(yīng)、破壞胃腸道菌群平衡和增強細菌耐藥性等。更為重要的是，抗生素被過量食入健康人腸道，會破壞健康人的正常菌群環(huán)境，導(dǎo)致人體免疫力的降低，從而危害消費者的身體健康，同時也影響牛奶及乳制品的出口貿(mào)易。我國的原料乳中￠-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素殘留嚴重，對其開展監(jiān)控檢測是我國乳品業(yè)發(fā)展中極為關(guān)注的問題。為使牛奶中抗生素問題得到有效監(jiān)控，符合最大殘留限量標準，奶牛場、乳制品廠、政府監(jiān)督部門、出入境檢測、大型食品流通領(lǐng)域等都在努力尋求準確可行的檢測方法，許多大型化學(xué) 試劑和儀器公司也致力于開發(fā)￠-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素殘留檢測的方法和儀器。目前，牛奶及生鮮奶中￠-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素殘留的檢測方法依據(jù)不同的檢測原理，大體可分為三大類微生物受阻檢測、理化檢測法、免疫學(xué)分析法。微生物受阻檢測方法，主要有抑菌圈試驗、渾濁度試驗、變色型檢測金標試紙條方法，微生物檢測方法檢測成本價低，但是靈敏度低、耗時長、耐藥菌的存在容易導(dǎo)致誤檢；理化檢測方法，是目前檢測內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素主要方法，有液相色譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜法等，理化檢測方法精確度高，但其存在檢測成本高，檢測設(shè)備復(fù)雜，對檢測人員的要求較高，檢測耗時長等缺點，目前常用的免疫學(xué)分析法，主要為酶聯(lián)免疫檢測法和放射免疫分析法需要的檢測費用還是較高，不適合企業(yè)低成本的檢測需要。目前免疫分析領(lǐng)域缺乏能夠同時檢測P-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類這兩類抗生素的技術(shù)及其應(yīng)用。因此，在實踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、檢測藥物種類多、適合大規(guī)模推廣的檢測方法。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種同時檢測檢測￠-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素的試紙條。本實用新型所提供的試紙條，包括凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標記物和四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑和試紙，試紙由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成，所述反應(yīng)膜上具有包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”、四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”和一條包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“ I ”。兩條檢測線印跡“ I ”和一條質(zhì)控線印跡“ I ”互相平行，并且與試紙的長相垂直。包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”靠近樣品吸收墊一端，包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“ I ”靠近吸水墊一端，包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”在包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線之間。其中包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線用檢測線(T)表示，包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線用檢測線(B)表示，包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線用質(zhì)控線(C)表示。質(zhì)控線(C)距離反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連的一端為5-8mm，檢測線(B)距離質(zhì)控線(C)4-6mm，檢測線(T)距離檢測線(B)4-6mm。在試紙上標記有MAX標記線的樣品吸收墊上的檢測端粘貼有保護膜。微孔試劑上具有微孔塞。為了便于運輸和使用，試紙條盛裝于具有密封塞的試劑桶中，試劑桶放置于具有固定用的盒體中。本實用新型試紙條中的試紙底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；保護膜為PE材質(zhì)保護膜；盒體為硬紙盒；試劑桶為塑料試劑桶；固定用具為硬質(zhì)支撐材料。本實用新型試紙條具有如下有益效果1.靈敏度高傳統(tǒng)的試紙卡均具有固定試紙的卡殼固定裝置，卡殼固定裝置緊緊地將試紙固定其中，在對樣品檢測時，由于卡殼與試紙結(jié)合的比較緊密，致使檢測樣品溶液不能夠充分滲透到樣品吸收墊一段，并在試紙上進行層析的速度十分緩慢，導(dǎo)致檢測樣品中的藥物不能夠與檢測線上包被的包被原充分接觸，致使試紙卡的靈敏度下降。本實用新型試紙條比傳統(tǒng)試紙卡的檢測靈敏度高，由于本實用新型試紙為裸條狀，無需殼體緊固裝置，檢測樣品可以直接接觸試紙的樣品吸收墊一端，并且樣品在試紙上的層析速度比較快，使樣品中的待檢藥物能夠充分的與檢測線上包被的包被原結(jié)合，從而提高了試紙條的檢測靈敏度。內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素檢測試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。其中的頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物和四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。因此，本實用新型試紙條具有較高的特異性和靈敏度。本試紙條對3 -內(nèi)酰胺類藥物檢測靈敏度分別為青霉素G 2iig/L、氨芐青霉素
g/L、阿莫西林g/L、苯唑青霉素g/L、鄰青霉素g/L、雙青霉素g/L、萘夫西林20 ii g/L、頭孢喹肟20 u g/L、頭孢哌酮40 u g/L、頭孢曲松50 u g/L、頭孢噻呋90 u g/L、頭孢洛寧IOy g/L;對四環(huán)素類檢測靈敏度為四環(huán)素、土霉素、強力霉素、氯四環(huán)素分別為80u g/L。2.操作簡便快速對于以往的試紙卡檢測原料奶必須要將原料奶加入稀釋液進行稀釋才能夠點樣檢測，原因是由于固定試紙的塑料殼體緊緊地把試紙固定在殼體內(nèi)，而原料奶比較粘稠，直接將原料奶在試紙卡的加樣孔進行點樣檢測，由于殼體與試紙結(jié)合緊密以及奶液粘稠所致，原料奶樣品無法完全滲透到樣品吸收墊和結(jié)合物釋放墊中，并且在試紙上的層析速度比較緩慢，以至于無法檢測，故要將原料奶加入稀釋液進行稀釋后方可檢測。使用本實用新型試紙條檢測時無需任何其它試劑，檢測原料奶時，也不需要對原料奶進行稀釋，原因由于本實用新型試紙為裸條狀，即無需用殼體對其進行固定，只要將待檢樣品溶液直接滴加于微孔試劑中，混勻后，孵育5min，再將試紙標有MAX線標記端向下，插入孵育后的微孔試劑中，試紙可以與樣品溶液充分接觸，5min后觀察結(jié)果。對于牛奶樣品的檢測，本實用新型試紙條比傳統(tǒng)試紙卡檢測時間短，由于本實用新型試紙條無需對樣品進行稀釋，可直接對樣品進行檢測。3.顯示檢測結(jié)果形象、直觀準確。檢測結(jié)果的判定是以試紙的兩條檢測線和一條質(zhì)控線是否顯色作為陰性和陽性判斷標準。如果反應(yīng)膜上的檢測線(T)顯示一條紅色條帶，檢測線(B)也顯示一條紅色條帶，同時質(zhì)控線(C)也顯示一條紅色條帶，以“ I I I ”表示，表示樣品中P-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物均分別低于試紙條對P-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物的最低檢測限；如果反應(yīng)膜上的檢測線(T)顯示一條紅色條帶，同時質(zhì)控線(C)也顯示一條紅色條帶，而檢測線(B)不顯色，以“| |”表示，表示檢測樣品中只有￠-內(nèi)酰胺類藥物含量等于或高于試紙條對￠-內(nèi)酰胺類藥物的最低檢測限；如果在反應(yīng)膜上的檢測線
(B)顯示一條紅色條帶，同時質(zhì)控線(C)也顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)不顯色，以“I I ”表示，表示檢測樣品中只有四環(huán)素類藥物含量等于或高于試紙條對四環(huán)素類藥物的最低檢測限；如果反應(yīng)膜上只有質(zhì)控線(C)顯示紅色條帶，而檢測線(T)和檢測線(B)均不顯示紅色條帶，以“I”表示，表示檢測樣品中的四環(huán)素類藥物和￠-內(nèi)酰胺類藥物的含量同時等于或高于試紙條對四環(huán)素類藥物和￠-內(nèi)酰胺類藥物的最低檢測限；如果反應(yīng)膜上的質(zhì)控線
(C)沒有顯示紅色條帶，無論檢測線(T)和(或)檢測線(B)是否顯示紅色條帶，試紙條檢測結(jié)果均視為無效。結(jié)果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不容易出現(xiàn)結(jié)果誤判。4.成本低，投資少使用本實用新型試紙條，不需另配儀器設(shè)備及其他試劑，也不需要固定試紙的卡殼固定裝置，成本低廉，投資少，見效快，使現(xiàn)場檢測一步到位。5.易于大范圍推廣應(yīng)用試紙條操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如
專業(yè)化驗、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、乳業(yè)企業(yè)等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效
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圖1為本實用新型試紙結(jié)構(gòu)剖面圖；圖2為本實用新型試紙俯視圖；圖3為本實用新型微孔試劑和微孔塞圖；圖4為本實用新型試紙條檢測結(jié)果判定圖；圖5為本實用新型試劑桶結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為本實用新型固定用具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定用具的側(cè)視圖。
具體實施方式
一、P -內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素檢測試紙條的組裝制備( I)試紙[0024]樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板6上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，保護膜7覆蓋在樣品吸收墊的檢測端，在檢測端保護膜上印有MAX標記線。反應(yīng)膜上的兩條檢測線和一條質(zhì)控線互相平行，并且與試紙的長相垂直。檢測線4-1即為檢測線(T)，靠近樣品吸收墊一端，質(zhì)控線5即為質(zhì)控線(C)，靠近吸水墊一端，檢測線4-2即為檢測線(B)，在檢測線(T)和質(zhì)控線(C)之間。質(zhì)控線(C)距離反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連的一端為5-8mm，檢測線(B)距離質(zhì)控線(C) 4_6mm，檢測線(T)距離檢測線(B)4-6mm。檢測線(T)包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，檢測線(B)包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線(C)包被有羊抗鼠抗抗體。底板為PVC底板，樣品吸收墊為吸濾紙，反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，吸水墊為吸水紙，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。(2)微孔試劑微孔試劑8具有微孔塞9，微孔試劑中凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物和四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標記物。(3)將(I)試紙和(2)微孔試劑裝入具有密封塞的試劑桶10中，將試劑桶放置于盒體12內(nèi)的固定用具11中。二、試紙條的使用取待檢牛奶樣品溶液滴加200 U I到微孔試劑中，混勻后，孵育5min，將試紙標有MAX線標記端向下，插入鮮育后的微孔試劑后計時，5min后觀察結(jié)果。三、檢測結(jié)果分析^ -內(nèi)酰胺類抗生素和(或)四環(huán)素類抗生素在檢測陽性樣品中的含量等于或高于試紙條的對上述兩類藥物的 檢測限時，頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物和(或)四環(huán)素類單克隆抗體-膠體金標記物與對應(yīng)的藥物結(jié)合，金標抗體上的抗原結(jié)合位點被封閉，從而在檢測線上因為競爭反應(yīng)，不會與對應(yīng)藥物-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣品在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，將會在兩條檢測線和一條質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖4所示，其中檢測線(T)表示包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線，檢測線(B)表示包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線，質(zhì)控線
(C)表示包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線，陰性結(jié)果用“一”表示，陽性結(jié)果用“ + ”表示。^ -內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物均呈陰性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，檢測線(T)和檢測線(B)也同時分別出現(xiàn)紅色條帶，以“| I |”表示，￠-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物均呈陰性。如圖4a所示。^ -內(nèi)酰胺類藥物或四環(huán)素類藥物呈陽性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，同時檢測線(T)出現(xiàn)紅色條帶，而檢測線(B)不出現(xiàn)紅色條帶時，以“ I I ”表示，P -內(nèi)酰胺類藥物呈陽性，如圖4b所示；當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，同時檢測線(B)出現(xiàn)紅色條帶，而檢測線(T)不出現(xiàn)紅色條帶時，以“ I I ”表示，四環(huán)素類藥物呈陽性，如圖4c所示。^ -內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物均呈陽性當(dāng)質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，而檢測線(T)和檢測線(B)都不出現(xiàn)紅色條帶時，以“ I ”表示，P -內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類藥物均呈陽性，如圖4d所示。試紙條無效當(dāng)質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)和(或)檢測線(B)顯示出紅色條帶與否，該試紙條判為無效，如圖4el_4e4所示。四、檢測試紙條中用到的材料制備方法如下1、抗原的制備I)、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定頭孢類藥物是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。a.免疫原的制備-頭孢類藥物與卵清白蛋白偶聯(lián)物合成取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1. 5ml雙蒸水溶解，得到(I )液；取碳化二亞胺(EDC)40mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 60mg用0. 5ml水溶解得到(II)液；在攪拌狀態(tài)下將(II )加入(I )中，反應(yīng)lh，得到(III)液；取卵清白蛋白(OVA) 60mg用8ml水溶解，得到(IV)液；將(IV)加入(III)中，室溫攪拌反應(yīng)24h得到免疫原，用0. 02mol/L PBS透析3天，分裝、凍存。b.包被原的制備-頭孢類藥物與牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用L 5ml雙蒸水溶解，得到(I )液；取EDC 40mg和NHS60mg用0. 5ml水溶解得到(II)液；在攪拌狀態(tài)下將(II)加入(I )中，反應(yīng)lh，得到(III)液；取牛血清白蛋白(BSA) IOOmg用8ml水溶解，得到(IV)液Jf(IV)加入(III)中，室溫攪拌反應(yīng)24h得到包被原，用0. 02mol/L PBS透析3天，分裝、凍存。c.頭孢類藥物-載體偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物用PH7.4的PBS配成
0.5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200-800 nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)成功。2)、四環(huán)素類半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定a.四環(huán)素類半抗原合成取1.1g四環(huán)素,0. 37g 4-哌唳甲酸,2ml 37%甲醒,在50ml乙醇中混合,利用曼尼希反應(yīng)在60%微波強度下反應(yīng)3-5min，在四環(huán)素的酰胺的胺基上引入了 N-甲基-4-哌啶甲酸基團，除去溶劑后，反相柱層析分離，得到黃色固體，即為四環(huán)素半抗原。b.免疫原的制備-四環(huán)素類藥物與BSA偶聯(lián)物合成取IOmg四環(huán)素半抗原用Iml 二甲基甲酰胺(DMF)溶解得到I溶液,冷卻至10°C,取氯甲酸異丁酯10 Ul加入I溶液中，10°C攪拌反應(yīng)30min得到II溶液。取40mg BSA用3ml 50mmol/L的似20)3溶解并與II溶液于10°C反應(yīng)4h，然后4°C過夜。用0. 01mol/L PBS在4°C下透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩.包被原的制備-四環(huán)素類藥物與OVA偶聯(lián)物合成取18mg四環(huán)素半抗原溶解于2ml DMF中，得到I溶液，取25mg碳化二亞胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后加入I溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液II溶液。稱取0VA36mg，使之充分溶解在8ml PBS (pH7. 2)中，將II溶液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用O.Olmol/L PBS在4°C下透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆?。[0054]d、四環(huán)素類藥物半抗原-載體偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、四環(huán)素類藥物半抗原、四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用PH7. 4的PBS配成0. 5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200-800 nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、四環(huán)素類藥物半抗原、四環(huán)素類藥物半抗原_載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明四環(huán)素類藥物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、頭孢類藥物和四環(huán)素類藥物的單克隆抗體的制備(I)制備單抗a.動物免疫將步驟I得到的兩種免疫原分別注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150呢/只，使其產(chǎn)生抗血清。b.細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 :1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌頭孢類藥物單克隆抗體的頭孢類藥物單克隆雜交瘤細胞株和穩(wěn)定分泌四環(huán)素類藥物單克隆抗體的四環(huán)素類藥物單克隆雜交瘤細胞株。c.細胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細胞培養(yǎng)基為向RPM1-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為
0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、單克隆抗體-膠體金標記物的制備(I)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號T09041)稀釋成0. 01%(質(zhì)量百分含量)，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每IOOml 0. 01%氯金酸加入2. 5 ml 1%檸檬酸三鈉(購于廣州化學(xué)試劑廠，產(chǎn)品目錄號BG11-AR-01KG)，繼續(xù)攪拌加熱反應(yīng)至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。(2)單克隆抗體-膠體金標記物的制備在磁力攪拌下,用0. 2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7. 0,按100-150 ii g抗體/ml膠體金的標準向膠體金溶液中分別加入上述頭孢類藥物單克隆抗體和四環(huán)素類單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10%BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置30min。12000rpm、4°C離心30min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物溶液和四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標記物溶液的濃度分別為50 y g單抗/ml溶液，置4°C備用。復(fù)溶緩沖液含酪蛋白、吐溫-80的0. 02mol/L、pH7. 2的磷酸鹽溶液，其中酪蛋白在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 05%-0. 1% (體積百分含量)，吐溫-80在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 05%-0. 15% (質(zhì)量百分含量)。5、單克隆抗體-膠體金標記物微孔試劑凍干到微孔條中向微孔條的微孔中加入50 U I頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物和50 ill四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，冷阱溫度為-70°C條件下，預(yù)凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到的微孔條中凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物和四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑。6、樣品吸收墊的準備將樣品吸收墊置于含BSA (BSA在緩沖液中的終濃度為0. 5% (體積百分含量))、pH為7. 2、0. lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C烘2h備用。7、反應(yīng)膜的制備包被過程用磷酸緩沖液將頭孢類藥物-牛血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(B)包被量為1. Oy g/cm2 ;用磷酸緩沖液將四環(huán)素類藥物半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(T)，包被量為1. 5u g/cm2 ;用0. Olmol/L、pH 7. 4 PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200ii g/ml，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(C)，包被量為l.Oyg/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
權(quán)利要求1.一種檢測3 -內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素的試紙條，其特征在于包括微孔試劑和試紙，試紙由底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述反應(yīng)膜上具有包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”，包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“ I ”。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試紙條，其特征在于所述反應(yīng)膜上的兩條檢測線印跡“I ”和一條質(zhì)控線印跡“ I ”互相平行，并且與試紙的長相垂直。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試紙條，其特征在于所述的包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”靠近樣品吸收墊一端，包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線印跡“ I ”靠近吸水墊一端，包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線印跡“ I ”在包被有四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述試紙上貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX標記線。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述底板可為PVC底板，樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙，吸水墊為吸水紙，反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，保護膜為PE材質(zhì)保護膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙條，其特征在于所述微孔試劑上具有微孔塞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述試紙裝入具有密封塞的試劑桶中，試劑桶放置于具有固定用具的盒體中，試劑桶為塑料試劑桶，固定用具是硬質(zhì)支撐材料，盒體為硬紙盒。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素和四環(huán)素類抗生素的試紙條。試紙條包括微孔試劑和試紙。試紙由底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護膜組成，微孔試劑上凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標記物和四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標記物，反應(yīng)膜上分別有一條包被頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物檢測線印跡“∣”、一條包被四環(huán)素類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物檢測線印跡“∣”和一條包被抗抗體的質(zhì)控線印跡“∣”。試紙放置于具塞試劑桶中，12個具塞試劑桶放置于具有12個孔的固定用具的盒體中。本實用新型試紙條可用于檢測乳制品中β-內(nèi)酰胺類抗生素和四環(huán)素類抗生素。
文檔編號G01N33/558GK202903789SQ201220298548
公開日2013年4月24日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者萬宇平, 羅曉琴, 吳鵬, 羅貴昆, 劉玉梅, 余厚美, 陳煒玲, 張荃 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司