專利名稱：T-2毒素elisa檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測Τ-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
Τ-2毒素(T-2 toxin)是鐮刀菌所產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的一種，能導(dǎo)致動物產(chǎn)生中毒反應(yīng)的次級代謝物質(zhì)，它廣泛分布于自然界，常在被污染的田間作物和庫存谷物中發(fā)現(xiàn)。無論飼料中T-2毒素的含量是高水平還是低水平均會導(dǎo)致動物采食量下降、增重緩慢、免疫系統(tǒng)損傷等。研究表明，T-2毒素對人和動物表現(xiàn)出基因毒性、免疫毒性、血液毒性等多種毒性，并可致多種細(xì)胞凋亡。1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在日內(nèi)瓦召開的聯(lián)席會議上，把T-2毒素同黃曲霉毒素一樣作為自然存在的最危險(xiǎn)的食品污染源。T-2毒素的測定方法主要有薄層色譜法(TCL)、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、放射性免疫檢測法、酶聯(lián)免疫法等，TLC法是最早最常用的檢測方法之一，具有操作簡單、費(fèi)用低廉、分離效果好、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，是一種常見的檢測方法，但是還存在樣品提純繁瑣、定量不夠精確、成本較高等缺點(diǎn)，而且同時TLC法涉及到一個可視化顏色定量的問題，還是不如氣相色譜和液相色譜方便、準(zhǔn)確。氣相色譜和液相色譜分析方法需要對T-2毒素進(jìn)行衍生化處理；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用靈敏度較高，不需要進(jìn)行衍生化處理，因而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是檢測T-2毒素比較理想的方法。目前報(bào)道比較多的方法為單極質(zhì)譜選擇離子技術(shù)(SIM)。然而，對于復(fù)雜基質(zhì)樣品(如谷物)，采用多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以更為有效地去除基質(zhì)的干擾，保證痕量物質(zhì)分析的準(zhǔn)確性。TCL法、色譜法等有的太復(fù)雜，有的缺乏靈敏度，有的價格昂貴，不適于常規(guī)毒素分析。免疫學(xué)檢測因其靈敏、快速、簡單，而被用于T-2毒素的測定。應(yīng)用于T-2毒素測定的免疫學(xué)方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法及免疫熒光法等。由于放射性同位素儲存、使用不便，近年來非放射性標(biāo)記應(yīng)用較多。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)已被我國于1992年定為檢測標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法作為一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大量樣品的快速篩選。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的T-2毒素殘留檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，可同時進(jìn)行多個樣品中T-2毒素殘留的檢測，減少了檢測樣本所需要的時間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種T-2毒素ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、11瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋，酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被T-2毒素偶聯(lián)抗原制成檢測板，11瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃縮酶結(jié)合物、酶結(jié)合物稀釋液、底物液A液、底物液B液、終止液。[0006]盒體為硬紙盒，96孔試劑板為96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放入真空鋁箔袋中，蓋板膜是塑料硬膜，將6瓶Iml梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1. 2ml濃縮酶結(jié)合物、12ml酶結(jié)合物稀釋液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml終止液用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，濃縮酶結(jié)合物用紅色帽的白色PE塑料瓶，酶結(jié)合物稀釋液用綠色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔預(yù)包被T-2毒素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，Iml/瓶，濃度分別為O μ g/L，I μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L, 27 μ g/L, 81 μ g/L ;濃縮酶結(jié)合物I瓶，1. 2ml ;酶結(jié)合物稀釋液I瓶，12ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml。每一個試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測時，樣本中的T-2毒素將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭T-2毒素的酶結(jié)合物，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含殘留物T-2毒素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中T-2毒素含量，其操作簡便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒檢測飼料(原料、配合料和濃縮料)樣本中T-2毒素殘留，具有很高的靈敏度(I μ g/L)，樣本的最低檢測限為IOy g/kg，回收率為90%±20%。本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、微量加樣器等，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡便、準(zhǔn)確地用于T-2毒素殘留量的檢測。


圖1為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的俯視圖；圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具側(cè)視圖。參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被T-2毒素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(I)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；白色帽的白色塑料試劑瓶(5)用于封裝7ml底物液A液，紅色帽的黑色塑料試劑瓶(5)用于封裝7ml底物液B液，黃色帽的白色塑料試劑瓶(5)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試劑瓶
(6)用于封裝1. 2ml濃縮酶結(jié)合物，綠色帽的白色塑料試劑瓶(6)用于封裝12ml酶結(jié)合物稀釋液，白色帽的白色塑料瓶(7)用于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(8)瓶位放置位置依次為7ml底物液A液瓶位(10)，7ml底物液B液瓶位(11)，7ml終止液瓶位(12)，12ml酶結(jié)合物稀釋液瓶位(13)，1. 2ml濃縮酶結(jié)合物瓶位(14)，6種Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(15 )，盒體(9 )是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理1.配液配液1:50%甲醇溶液用去離子水將甲醇(分析純)按1:1體積比進(jìn)行稀釋(I份甲醇+1份去離子水)用于樣本前處理。配液2 10% NaCl水溶液稱取10. Og氯化鈉粉末加IOOmL去離子水溶解混勻。2.飼料(原料、配合料和濃縮料)樣本前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)飼料樣本；稱取5. 0g±0. 05g均質(zhì)后的飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入25ml 50%甲醇，用振蕩器劇烈振蕩5min，3000g以上，室溫(20-250C /68-77 0F)離心5min ;取500 μ I上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入500 μ I10%氯化鈉水溶液用振蕩器振蕩lmin，混勻；取20μ I用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20_25°C /68-77 °F)回溫，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
`[0028]2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。4、酶結(jié)合物工作液配制根據(jù)需要量將濃縮酶結(jié)合物用酶結(jié)合物稀釋液按照1:10的體積進(jìn)行稀釋(即I份濃縮酶結(jié)合物加入10份酶結(jié)合物稀釋液)。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、酶結(jié)合物工作液加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20 μ I到對應(yīng)的微孔中，隨即加入酶結(jié)合物工作液100μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C (77 °F)避光環(huán)境中反應(yīng)lOmin。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用去離子水250 μ I/孔充分洗滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、顯色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)5min。8、測定加入終止液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含T-2毒素的含量成負(fù)相關(guān)。1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(yg/L)。假設(shè)樣本I的吸光度值為1. 249，樣本2的吸光度值為O. 813，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是0μ g/L為1. 768 ; I μ g/L 為1. 436 ;3 μ g/L 為1. 055 ；9 μ g/L 為 O. 569 ；27 μ g/L 為 0. 273 ；81 μ g/L 為
0.124。則樣本I的濃度范圍是I μ g/L-3 μ g/L再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中T-2毒素殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是3μ g/L-9y g/L再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中T-2毒素殘留的濃度范圍。2、定量分析(I)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
權(quán)利要求1.一種T-2毒素ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、11瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被T-2毒素偶聯(lián)抗原制成的檢測板，11瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃縮酶結(jié)合物、酶結(jié)合物稀釋液、底物液A液、底物液B液、終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，濃縮酶結(jié)合物用紅色帽的白色PE塑料瓶，酶結(jié)合物稀釋液用綠色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔預(yù)包被T-2毒素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，Iml/瓶，濃度分別為01^/1，11^/1，31^/1，91^/1，271^/1，811^/1;濃縮酶結(jié)合物 I 瓶，·1.2ml ;酶結(jié)合物稀釋液I瓶，12ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、濃縮酶結(jié)合物、酶結(jié)合物稀釋液、6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物液A液、底物液B液、終止液。采用競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的T-2毒素與酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭T-2毒素的酶結(jié)合物，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含T-2毒素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中T-2毒素的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在T-2毒素的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/545GK202903791SQ20122035097
公開日2013年4月24日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者萬宇平, 何方洋, 余厚美, 羅曉琴, 彭鴿, 石麗麗, 汪善良 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司