專利名稱：一種ev71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種酶聯(lián)診斷試劑盒及其用途，具體說，是涉及一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(英文名為Human enterovirus 71),簡稱EV71 :EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結(jié)構(gòu)。由于EV71引起的手足口病(hand - footand mouth disease ;HFMD)影響范圍的廣泛性、危害的嚴(yán)重性,該病在中國已納入丙類傳染病管理。鑒于此，世界各國學(xué)者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結(jié)構(gòu)。其基因組為單股正鏈RNA,長度約為7，408個核苷酸,編碼開放讀碼框(open-reading frame, 0RF)。EV71基因組編碼的多聚蛋白(polyprotein)約含2，193個氨基酸,該多聚蛋白可進一步被水解成Pl、P2、P3三個前體蛋白(圖I)。經(jīng)過進一步的剪切，Pl前體蛋白可以進一步成熟為VP1、VP2、VP3和VP4四個病毒結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)責(zé)病毒顆粒的裝配和穩(wěn)定；P2前體蛋白則進一步成熟為非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein, nsp)2A(特異性蛋白酶)、2B和2C ；P3前體蛋白則用以形成非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B (VPg，5’末端結(jié)合蛋白)、3C (特異性蛋白酶)和 3D(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。腸病毒的流行與季節(jié)轉(zhuǎn)換、環(huán)境變異有著極大的關(guān)聯(lián)性，腸病毒只在夏季及初秋流行，每年六 九月為高峰期，氣溫過低的地區(qū)并不利于腸病毒生存。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，腸病毒之傳染途徑主為糞一口傳染(stool - oral)，感染腸病毒的患者會經(jīng)由糞便排出病毒，這些含有高濃度腸病毒的糞便會污染環(huán)境甚至地下水源，在公共衛(wèi)生條件不佳的地區(qū)，極易經(jīng)由污染的水源而散播該病毒。EV71對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性，故臨床上出現(xiàn)之癥狀包括腦炎(encephalitis)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、急性無力肢體麻痹(acute flaccid paralysis)、手足口癥(hand - foot - mouth disease)、泡疫性咽峽炎(herpangina)、急性出血性結(jié)膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonic jerk)、頭痛(headache)、發(fā)燒(fever)及嘔吐(vomoting)等，而其中以手足口癥及泡疹性咽峽炎最為常見。一般而言，感染腸病毒多為無癥狀(約50 80%)或出現(xiàn)輕微類似感冒的癥狀，病人會自然痊愈而產(chǎn)生抗體，但因感染腸病毒且轉(zhuǎn)成重癥之患者卻有極高的機率死于心肺衰竭及廣泛性的腦干傷害，實不容小覷。加強對EV71型感染病患的防控工作，已成為我國病毒性傳染病管理工作的目標(biāo)之一。而相關(guān)疫苗的研究開發(fā)和病毒抗原的快速檢測試劑盒是預(yù)防控制此傳染病的關(guān)鍵。在EV71病毒所編碼的四個結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用來形成包裝病毒顆粒的衣殼(capsid)，而VP4則被包埋在病毒衣殼的內(nèi)部，負(fù)責(zé)與核心(core)相互作用，用以穩(wěn)定病毒的基因組，因此VP1、VP2和VP3形成了 EV71病毒的主要抗原決定簇，其中又以VPl的抗原性最強，而成為目前抗體研究與設(shè)計開發(fā)的主要靶點。同時，研究表明腸道病毒存在著眾多的型內(nèi)、型間的交叉反應(yīng)性，并且存在著較高的重組性。其中EV71與Cox A16的相似性達到了 80%，擁有很多共同表位，許多克隆抗體EV71的單抗具有了與Cox A16的交叉反應(yīng)性。成為EV71抗原檢測方法建立的一項制約。常規(guī)的針對EV71病毒的診斷方法主要通過分離病毒，中和抗體檢測和免疫組織化學(xué)法來進行。但這些方法費時、費力，無法滿足疾病流行期間同時大量處理大量標(biāo)本的需要。同時，鑒于EV7·1病毒的危害性,有必要開發(fā)一種簡單快速易行的檢測EV71病毒抗原表位含量的檢測方法。該研究使用的特異性識別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體具有高效的EV71病毒的中和效果，同時與Cox A16交叉反應(yīng)性，有效避免了抗原檢測中與EV71 80%相似性的Cox A16的假陽性干擾。因此，所述方法的成功開發(fā)對于疫苗的研發(fā)中抗原表位這一有效組分的檢測有著重要的意義，同時該方法也為EV71疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準(zhǔn)確、簡便、有效的監(jiān)測手段，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會需求。

實用新型內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本實用新型的目的是提供一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述實用新型目的，本實用新型采用的技術(shù)方案如下一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。作為一種優(yōu)選方案，所述的抗EV71抗體為特異性識別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段，且可被生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的；所述陽性對照品為EV71抗原對照品；所述陰性對照品為陰性血清；所述的標(biāo)記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標(biāo)記或葡萄糖氧化酶標(biāo)記或是熒光素、生物素、膠體金離子標(biāo)記的。作為進一步優(yōu)選方案，所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。作為進一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致。作為進一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條，每條微孔反應(yīng)條上設(shè)有數(shù)個可拆卸的微反應(yīng)孔。作為進一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板上共設(shè)有96個微反應(yīng)孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設(shè)有封套。作為更進一步優(yōu)選方案，所述樣品稀釋液通過在牛血潰白蛋白IOg加入0.01 MPBS IOOOml和混合生物素防腐劑O. 5ml即得；所述濃縮洗液為取NaH2PO4. 2H20 2. 96g、Na2HPO4. 12H20 29. 0g、NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加純化水至 1000ml 即得；所述終止液為取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得；所述顯色液A為取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3.2g、30%H2020. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得；所述顯色液B為取ΤΜΒ0. 4g,EDTA-Na2O. 4g、檸檬酸I. 9g、甘油IOOml加入雙蒸水至IOOOmlo[0020]本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒具有較好的特異性，尤其是對于Cox A16無交叉反應(yīng)性；雙人對于EV71純化前、后的樣品進行抗原含量重復(fù)檢測，兩人的變異系數(shù)〈10%，重復(fù)性良好；3次的線牲相關(guān)系數(shù)均>0. 99，線性較好；對于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測。采用本實用新型提供的試劑盒，可快速、準(zhǔn)確有效地的對手足口病感染患者進行EV71檢測，從而為EV71病毒感染診斷和預(yù)防提供了一種新的途徑，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

圖I為本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒中的96孔酶聯(lián)版的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例，進一步闡明本實用新型。應(yīng)理解，下述實施例僅用于說明本·實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
以下結(jié)合附圖及其實施例對本實用新型進一步詳細說明
實施例如圖I和圖2所示，本實用新型提供的一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，包括盒體(1)，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位(2)，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶組(3)、一塊多孔酶聯(lián)板
(4)及一張封板膜(5)，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品(31)、陰性參考品(32)、樣品稀釋液(33)、濃縮洗液(34)、顯色液A (35),顯色液B (36)和終止液
(36)各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體；所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致；所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架(41)，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條(42 )，每條微孔反應(yīng)條上設(shè)有數(shù)個可拆卸的微反應(yīng)孔(43);所述多孔酶聯(lián)板上共設(shè)有96個微反應(yīng)孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設(shè)有封套(6)。試劑盒中的多孔酶聯(lián)板及試劑的制備(I)抗原參考品的制備；(2)單克隆抗體的制備；(3)抗EV71單抗包被板的制備；(4)酶標(biāo)抗體的制備；(5)樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液的配置；(6)顯色液的配置；其中，所述的EV71抗原檢測方法是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法；(I)所述的抗原參考品制備方法如下將通過基因工程方法制備的EV71病毒Vpl純化液配制為含有抗原的溶液，然后向該溶液添加牛血清白蛋白作為保護劑。對其進行分裝，即制得EV71抗原參考品；(2)所述的單克隆抗體制備方法如下①采用制備的EV71純化液免疫小鼠.效價測定后，采用效價最高的小鼠取脾臟細胞與骨髓瘤細胞按比例進行融合，在培養(yǎng)液上培養(yǎng)融合雜交的瘤細胞；②進行三次亞克隆，每次亞克隆時，檢測各細胞孔的效價，對于OD值大于O. 6的孔的細胞進行克隆化，獲得高效價的針對不同位點的單克隆抗體的細胞株；③通過對獲得的細胞株進行大規(guī)模培養(yǎng)，并將培養(yǎng)后的細胞注射到小鼠腹腔，制備抗EV71單克隆抗體腹水，即得所述的單克隆抗體；(3)所述的抗EV71單抗包被板的制備方法如下 使用制備的純化的抗EV71克單隆抗體作為包被抗體，以最佳包被抗體濃度加于酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)，并于低溫下放置。棄去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封閉液于孔中，封閉，棄去封閉液，拍干，干燥，真空封裝，最后將封裝后的包被板于低溫下保存；(4)所述的酶標(biāo)抗體的制備方法如下；將獲得的純化抗EV71單克隆抗體BE2采用過碘酸鈉氧化法標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP )，標(biāo)記后加等體積甘油分裝，-20 V放置。其中所述的酶標(biāo)抗體使用前采用方陣滴定法確定最適工作濃度；(5)所述的樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液配置方法如下I)樣品稀釋液取牛血潰白蛋白10g，加入O. 01 M PBS 1000ml，混合生物素防腐劑O. 5ml即得樣
品稀釋液。2)濃縮洗液取NaH2PO4. 2H20 2. 96g,Na2HPO4. 12H20 29. 0g,NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加純化水至1000ml即得。3)終止液取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得。(6)所述的顯色液配置方法如下I)顯色液A取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3. 2g、30%H2020. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得。2)顯色液B取ΤΜΒ0. 4g、EDTA-Na2O. 4g、檸檬酸 I. 9g、甘油 IOOml 加入雙蒸水至 1000ml。實施例2 EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒的使用本發(fā)明所述的檢測方法是通過ELISA方法來實現(xiàn)的；本發(fā)明的試劑盒或?qū)嶋H是通過ELISA進行對EV71抗原進行定量的。EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒的檢測操作程序如下A.定性檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做高倍數(shù)稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，加檢樣品、陽性對照；(3)恒溫水浴箱避光孵育，用洗液洗滌，拍干；(4)將標(biāo)記抗體用加入各反應(yīng)孔；[0065]( 5 )恒溫水浴箱避光孵育；(6)用洗滌液洗滌，拍干；(7)加入顯色液A于孔中，再加入顯色液B，震蕩將其混勻；(8)恒溫水浴箱避光孵育；(9)滴加終止液于孔中，震蕩混勻；(10)用酶標(biāo)儀于450nm波長下讀數(shù)；(11)結(jié)果判定；Cut off值=2 · I X N (N為陰性對照平均A值) a陰性對照平均A值應(yīng)小于O. 3，否則實驗不成立。b標(biāo)本A值小于Cut off值為陰性，大于等于Cut off值為陽性。定量檢測( I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做高倍數(shù)稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，將抗原標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為不同年度，每稀釋度各加一孔；(3)加待檢樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品；(4)恒溫水浴箱避光孵育，用洗液洗滌，拍干；( 5 )將標(biāo)記抗體用加入各反應(yīng)孔；(6)恒溫水浴箱避光孵育；(7)用洗滌液洗滌，拍干；(8)加入顯色液A、顯色液B，震蕩將其混勻；(9)恒溫水浴箱避光孵育；(10)滴加終止液，震蕩混勻；(11)用酶標(biāo)儀于450nm波長下讀數(shù)；(12)結(jié)果判定；Cut off值=2 . I X N (N為陰性對照平均A值)a陰性對照平均A值應(yīng)小于O. 3，否則實驗不成立。b采用直線回歸法計算樣品抗原滴度，R2值應(yīng)大于O. 97。組裝所得的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒的特異性及靈敏度、線性和線性范圍檢測采用現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法，具體結(jié)果如下A.特異性特異性評價組裝的EV71病毒ELISA檢測試劑盒用于檢測腸道病毒以及其它病毒，結(jié)果表明該試劑盒的特異性很高。結(jié)果表明該檢測試劑盒的特異性高，與HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒、HAV等多種病毒沒有交叉。、靈敏度、線性、線性范圍靈敏度檢測的Vpl范圍5ng 1000ng/ml。病毒定量檢測(原液TCID50=107/100ul)培養(yǎng)的EV71病毒原液檢測的TCID50為107/100ul，可以檢測100倍稀釋的培養(yǎng)病
毒上清。[0099]本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒具有較好的特異性，尤其是對于Cox A16無交叉反應(yīng)性；雙人對于EV71純化前、后的樣品進行抗原含量重復(fù)檢測，兩人的變異系數(shù)〈10%，重復(fù)性良好；3次的線牲相關(guān)系數(shù)均>0. 99，線性較好；對于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測。最后有必要在此說明的是以上實施例只用于對本實用新型的技術(shù)方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本實用新型保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本實用新型的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本實用新型的保護范圍。
權(quán)利要求1.一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，其特征在于它包括盒體，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，其特征在于所述的抗EV71抗體為特異性識別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段，且可被生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的； 所述陽性對照品為EV71抗原對照品； 所述陰性對照品為陰性血清； 所述的標(biāo)記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標(biāo)記或葡萄糖氧化酶標(biāo)記或是熒光素、生物素、膠體金離子標(biāo)記的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，其特征在于所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，其特征在于所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，其特征在于所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條，每條微孔反應(yīng)條上設(shè)有數(shù)個可拆卸的微反應(yīng)孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，其特征在于所述多孔酶聯(lián)板上共設(shè)有96個微反應(yīng)孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設(shè)有封套。
專利摘要本實用新型公開了一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測試劑盒具有較好的特異性，尤其是對于CoxA16無交叉反應(yīng)性；雙人對于EV71純化前、后的樣品進行抗原含量重復(fù)檢測，重復(fù)性良好，線性較好；對于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測。
文檔編號G01N33/543GK202735348SQ20122037619
公開日2013年2月13日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者史晉, 吳克, 劉昊智, 鮑路偉, 王文灝, 程超, 張愛暉 申請人:上海博沃生物科技有限公司