專利名稱：一種細胞染色試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種細胞染色試劑盒，尤其是指一種用于宮頸癌早期診斷和鑒別的細胞染色試劑盒。
背景技術(shù)：
宮頸癌是影響婦女健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌而居女性腫瘤的第二位。全世界每年約有50萬新發(fā)宮頸癌病例，亞洲約38萬，中國約15萬例，全世界每年約23萬婦女死于宮頸癌，亞洲約19萬，中國約8萬。這個數(shù)據(jù)顯示宮頸癌已成為中國婦女健康的巨大威脅(Ng E 等，CMAL，2004，170 (10): 1545-1549 ;喬友林，2006，26 (12):1293-1295)。宮頸癌中 95% 是鱗狀細胞癌(Squmous Cells Carcinoma, SCC)，臨床一期的治愈率可達到80 90%，二期時是60 70%，進入三期是40 50%，但發(fā)展到四期只有10%的治愈率。因此對宮頸癌前病變包括宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical IntraepitheliumNeoplasia, CIN)的防治和早期診斷宮頸癌是控制其發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)鍵(Huth WK, JNatl ComprCanc Netw, 2010,8:1329-1330),進一步探索針對宮頸癌早期診斷的特異性檢測方法就顯得尤為重要。由于宮頸癌常繼發(fā)感染伴有明顯的炎癥反應(yīng)，在H&E染色中癌細胞常淹沒在炎癥細胞中難以辨認,或H&E染色中癌細胞質(zhì)為紅色,核為藍色，而紅細胞常為紅色，炎癥細胞為藍色，使尋找癌細胞較為困難，容易漏診?，F(xiàn)有細胞染色試劑盒設(shè)計復(fù)雜，試劑瓶大小不一，取用不方便，操作復(fù)雜，染色效率低，有時試劑瓶為玻璃等易碎材質(zhì)制成。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種設(shè)計合理、結(jié)構(gòu)簡單、取用方便、染色效率和細胞的辨別率高的細胞染色試劑盒。為了達到上述目的，本實用新型提供了一種細胞染色試劑盒，其特征在于，包括外包裝紙盒，所述的外包裝紙盒中設(shè)有無花果葉提取液包裝試劑瓶、堿性染料包裝試劑瓶、酸性染料包裝試劑瓶和細胞核染色試劑包裝試劑瓶。所述的外包裝紙盒為方體結(jié)構(gòu)，包括盒體以及盒蓋，盒蓋與盒體活動連接。盒蓋可掀開。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶、堿性染料包裝試劑瓶、酸性染料包裝試劑瓶和細胞核染色試劑包裝試劑瓶皆包括瓶體及瓶蓋，瓶體和瓶蓋緊密結(jié)合。四種試劑瓶均為塑料材質(zhì)。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶、堿性染料包裝試劑瓶、酸性染料包裝試劑瓶和細胞核染色試劑包裝試劑瓶的試劑體積規(guī)格皆為10(T500mL。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶、堿性染料包裝試劑瓶、酸性染料包裝試劑瓶和細胞核染色試劑包裝試劑瓶的試劑體積規(guī)格相同。[0011]本實用新型的細胞樣本可以是細胞涂片或組織切片。其中細胞涂片可以是細胞手工涂片或液基膜式薄層細胞學(xué)涂片，組織切片可以是冰凍切片或石蠟切片本實用新型設(shè)計合理，結(jié)構(gòu)簡單，取用方便，可以對細胞在保持形態(tài)的基礎(chǔ)上增加了不同顏色鑒別，該項技術(shù)具有顏色區(qū)別和細胞形態(tài)分析的雙重功能，本實用新型染色的反應(yīng)速度快，操作步驟簡單，耗時短，同時能滿足篩選非典型細胞所需的技術(shù)要求，為宮頸癌早期診斷和鑒別診斷提供了有效的工具。本實用新型首次采用四種試劑體積規(guī)格一致的細胞染色試劑包裝試劑瓶，包裝簡潔，克服了傳統(tǒng)細胞染色試劑盒試劑瓶試劑體積規(guī)格不一，取用容易出錯的缺點。同時，本實用新型采用塑料材質(zhì)的試劑瓶，不易破碎，克服了傳統(tǒng)試劑盒有時采用玻璃等易碎材質(zhì)試劑瓶的缺點，大大提高了安全性和可靠性。

圖1是本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中:1、無花果葉提取液包裝試劑瓶；2、堿性染料包裝試劑瓶；3、酸性染料包裝試劑瓶；4、細胞核染色試劑包裝試劑瓶；5、外包裝紙盒。
具體實施方式
為使本實用新型更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。實施例1如圖1所示，本實用新型的細胞染色試劑盒，包括外包裝紙盒5，所述的外包裝紙盒5中設(shè)有無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4。所述的外包裝紙盒5為方體結(jié)構(gòu)，包括盒體以及盒蓋，盒蓋與盒體活動連接。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4皆包括瓶體及瓶蓋，瓶體和瓶蓋緊密結(jié)合。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4的試劑體積規(guī)格皆為100mL。堿性染料為新品紅，酸性染料為亮綠，細胞核染色試劑為Harris蘇木素。使用方法如下:(I)將細胞涂片于質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去離子水洗滌IOsec0(2)用Harris蘇木素對細胞核進行染色6min，用自來水沖洗Imin后，用去離子水洗30sec,再浸入去離子水lOsec。(3)用無花果葉提取液孵育3min，用去離子水洗lmin，再浸入去離子水lOsec。(4)用新品紅染色液孵育lmin，用去離子水洗lmin，再浸入去離子水lOsec。(5)用亮綠染色液孵育3min，用去離子水洗30sec，再浸入去離子水lOsec。(6 )晾干，用中性樹膠封片。實施例2如圖1所示，本實用新型的細胞染色試劑盒，包括外包裝紙盒5，所述的外包裝紙盒5中設(shè)有無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4。所述的外包裝紙盒5為方體結(jié)構(gòu)，包括盒體以及盒蓋，盒蓋與盒體活動連接。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4皆包括瓶體及瓶蓋，瓶體和瓶蓋緊密結(jié)合。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4的試劑體積規(guī)格皆為500mL。堿性染料為新品紅，酸性染料為亮綠，細胞核染色試劑為Harris蘇木素。使用方法如下:(I)將細胞涂片于質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去離子水洗滌IOsec0(2)用Harris蘇木素對細胞核進行染色6min，用自來水沖洗Imin后，用去離子水洗30sec,再浸入去離子水lOsec。(3)用無花果葉提取液孵育3min，用去離子水洗lmin，再浸入去離子水lOsec。(4)用新品紅染色液孵育lmin，用去離子水洗lmin，再浸入去離子水lOsec。(5)用亮綠染色液孵育3min，用去離子水洗30sec，再浸入去離子水lOsec。(6 )晾干，用中性樹膠封片。實施例3一、試劑盒及試劑的制備方法:如圖1所示，本實用新型的細胞染色試劑盒，包括外包裝紙盒5，所述的外包裝紙盒5中設(shè)有無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4。所述的外包裝紙盒5為方體結(jié)構(gòu)，包括盒體以及盒蓋，盒蓋與盒體活動連接。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4皆包括瓶體及瓶蓋，瓶體和瓶蓋緊密結(jié)合。所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶1、堿性染料包裝試劑瓶2、酸性染料包裝試劑瓶3和細胞核染色試劑包裝試劑瓶4的試劑體積規(guī)格皆為300mL。所述的無花果葉提取液通過將無花果葉提取物(10:1)(購自西安斯諾特生物
技術(shù)有限公司)溶解在體積濃度為70%的乙醇溶液中配制得到，其中無花果葉提取物的終濃度為 30% (w/v)0所述的堿性染料為新品紅染色液(New Fuchsin solution),通過將新品紅粉末(購自美國Sigma公司)溶解在體積濃度為20%的酒精溶液中配制得到，其中新品紅的終濃度為0.5% (w/v)，使用前靜置避光24 h。所述的酸性染料為亮綠染色液(Light Green solution),通過將亮綠粉末(購自美國Merck公司)溶解在體積濃度為20%的酒精溶液中配制得到，亮綠的終濃度為0.4%(w/V),使用前靜置避光24 ho所述的細胞核染色試劑為Harris蘇木素染色劑，采用常規(guī)方法配制。其它試劑包含10%三氯乙酸溶液(Trichloroacetic acid, TCA)和乙醇溶液，皆采用常規(guī)方法配制。[0046]二、病例來源:病例600例陰道細胞涂片分別來自南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、昆山市第一人民醫(yī)院、如東縣人民醫(yī)院、南通市八仙花苑社區(qū)杏林婦科病診所，其中手工涂片440例，TCT涂片160例。分別對手工涂片和TCT涂片用本實用新型試劑盒染色和H&E染色，對涂片診斷的宮頸SCC和高級別上皮內(nèi)瘤變CIN3病例進一步手術(shù)活檢確診。三、染色:步驟1、涂片準備:(I)手工涂片440例，每例涂4片，其中2片采用噴霧細胞固定(Spray CYT0FIX )，分別用步驟2中本實用新型試劑盒染色和步驟3中H&E染色，另外2片采用體積濃度為95%的乙醇溶液固定，分別用步驟2中本實用新型試劑盒染色和步驟3中H&E染色。噴霧細胞固定(Surgipath Medical Industries,INC.P.0.BOX 528/5205 Rte.12 Richmond,IL60071)在手工涂片完成2-5seC內(nèi)，距離涂片30cm從左至右均勻噴至整個細胞區(qū)，重復(fù)3次，噴霧固定IOmin自然晾干。乙醇固定:手工涂片完成后將玻片浸入體積濃度為95%的乙醇溶液IOmin以上，自然晾干。(2) TCT涂片160例，宮頸刷刷到細胞后浸入體積濃度為95%的乙醇溶液10 min以上，待細胞離心后經(jīng)TCT儀(ZP-b膜式，湖北孝感宏翔生物醫(yī)械技術(shù)有限公司)每例制備2張TCT涂片，分別用步驟2中本實用新型試劑盒染色和步驟3中H&E染色。步驟2、使用本實用新型試劑盒染色如下(手工涂片和TCT涂片步驟相同):(I)將細胞涂片于質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去離子水洗滌IOsec0(2)用Harris蘇木素對細胞核進行染色9min，用自來水沖洗Imin后，用去離子水洗30sec,再浸入去離子水lOsec。(3)用無花果葉提取液孵育3min，用去離子水洗lmin，再浸入去離子水lOsec。(4)用新品紅染色液孵育lmin，用去離子水洗lmin，再浸入去離子水lOsec。(5)用亮綠染色液孵育lmin，用去離子水洗30sec，再浸入去離子水lOsec。(6)晾干，用中性樹膠封片，染色完成后4°C存放、爾后觀察。步驟3、H&E染色:手工涂片按常規(guī)操作方法分別用Harris蘇木素染色劑染色細胞核，用伊紅染色劑染色細胞質(zhì)。TCT涂片按液基儀器預(yù)先設(shè)計的程序自動化控制染色。步驟4、組織切片染色:對涂片診斷的宮頸SCC和高級別上皮內(nèi)瘤變CIN3病例進一步手術(shù)活檢，標本經(jīng)質(zhì)量濃度為4%的甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片4 y m厚，采用與步驟2和步驟3相同的方法分別進行本實用新型試劑盒染色和H&E染色，進行病理診斷。四、觀察:在10倍鏡下仔細觀察本實用新型試劑盒染色涂片，平均每個視野至少有8個細胞。20倍和40倍鏡下觀察任何可疑或成簇細胞，特別關(guān)注紅染或紫染細胞。對于幾項檢查進行95%可信區(qū)間(Confidence Intervals, Cl)估價,采用公式:敏感性=真陽性病例/ (真陽性病例+假陰性病例)X100% ;特異性=真陰性病例/ (真陰性病例+假陽性病例)X100%。五、結(jié)果:1、本實用新型試劑盒染色陰道細胞的形態(tài)和顏色表現(xiàn):[0066]在手工涂片和TCT涂片中本實用新型試劑盒染色陰道細胞較好的顯示了細胞的形態(tài)學(xué)特征，細胞輪廓清晰，細胞膜完整(有時可出現(xiàn)〈20%的細胞喪失了膜的完整性，但未見胞質(zhì)溢出)。同時各類細胞顯示的顏色和形態(tài)密切相關(guān)。在手工涂片440例中診斷為宮頸SCC 14例、CIN58例(CIN3:21例，CIN1-2:37例)、炎癥改變(包括霉菌、滴蟲感染等)328例和相對正常細胞40例。TCT涂片160例中宮頸SCC 18例、CIN 58例(CIN3:23例，CIN1-2:35例)、炎癥改變(包括霉菌、滴蟲感染)75例和相對正常細胞9例。(I)正常上皮細胞淺表鱗狀上皮細胞包括基底細胞、中間細胞和成熟細胞。從基底細胞到成熟細胞的細胞形狀是從橢圓形到多邊形，細胞單核從大到小，細胞質(zhì)從少到多。本實用新型試劑盒染色后正常單個鱗狀細胞(非成團細胞)胞質(zhì)為藍色或綠色。萎縮鱗狀細胞通常是中間細胞的5倍。自溶可能導(dǎo)致裸核。本實用新型試劑盒染色后細胞核呈紅粉色，細胞質(zhì)絕大多數(shù)是藍色或者綠色?；镊[狀細胞橢圓形，本實用新型試劑盒染色后細胞核大多數(shù)呈紅粉色，細胞質(zhì)呈藍色/綠色或者紅粉色。在成團宮頸鱗狀細胞(多于5個細胞)中，多數(shù)外周細胞胞質(zhì)和胞核為綠色或藍色，細胞團中心細胞為粉紅色或紅色。子宮頸管上皮細胞立方形，核圓較小，胞質(zhì)少，細胞成團排列。本實用新型試劑盒染色后胞質(zhì)和核呈鮮紅色。(2)不典型細胞與癌細胞不典型細胞往往出現(xiàn)在重度炎癥或CIN的病灶中，后者進一步分為低級別CIN1-2和高級別CIN3。炎癥中不典型細胞的主要特點為核增大，約為中間細胞核的2.5 3倍，但核染色質(zhì)或核形態(tài)規(guī)則。CIN1-2細胞核增大至中間細胞核的3倍以上，核染色質(zhì)分布均勻呈粗顆粒狀，或密集深染，常無核仁或不顯著。CIN3細胞大小不一、核異形，常見顯著的核裂或凹槽，核染色質(zhì)可細膩或粗糙(顆粒狀)，核仁缺如或偶見。SCC細胞與CIN3特征相似，但核異型更明顯，常出現(xiàn)大核仁或裸核，細胞核染色質(zhì)分布不均、粗糙塊狀。癌細胞的背景中常伴有較多的紅細胞，提示由癌細胞侵襲所致的出血。經(jīng)本實用新型試劑盒染色后不典型細胞與癌細胞胞質(zhì)和胞核均呈紅色。(3)炎癥細胞和紅細胞炎癥細胞核較小分葉狀，細胞質(zhì)少或缺失，胞核呈紅色(有時可呈藍色或綠色〈20%),炎癥細胞胞質(zhì)為藍色或綠色。紅細胞胞質(zhì)均呈綠色。2本實用新型試劑盒染色與H&E染色的比較:(I)在手工涂片和TCT涂片中分別比較本實用新型試劑盒染色和H&E染色的診斷結(jié)果(表I)表I本實用新型試劑盒染色和H&E染色比較
權(quán)利要求1.一種細胞染色試劑盒，其特征在于，包括外包裝紙盒(5)，所述的外包裝紙盒(5)中設(shè)有無花果葉提取液包裝試劑瓶(I)、堿性染料包裝試劑瓶(2)、酸性染料包裝試劑瓶(3)和細胞核染色試劑包裝試劑瓶(4)。
2.如權(quán)利要求1所述的細胞染色試劑盒，其特征在于，所述的外包裝紙盒(5)為方體結(jié)構(gòu)，包括盒體以及盒蓋，盒蓋與盒體活動連接。
3.如權(quán)利要求1所述的細胞染色試劑盒，其特征在于，所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶(I)、堿性染料包裝試劑瓶(2)、酸性染料包裝試劑瓶(3)和細胞核染色試劑包裝試劑瓶(4)皆包括瓶體及瓶蓋，瓶體和瓶蓋緊密結(jié)合。
4.如權(quán)利要求1所述的細胞染色試劑盒，其特征在于，所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶(I)、堿性染料包裝試劑瓶(2)、酸性染料包裝試劑瓶(3)和細胞核染色試劑包裝試劑瓶⑷的試劑體積規(guī)格皆為100 500mL。
5.如權(quán)利要求1所述的細胞染色試劑盒，其特征在于，所述的無花果葉提取液包裝試劑瓶(I)、堿性染料包裝試劑瓶(2)、酸性染料包裝試劑瓶(3)和細胞核染色試劑包裝試劑瓶(4)的試劑體積規(guī)格相同。
專利摘要本實用新型提供了一種細胞染色試劑盒，其特征在于，包括外包裝紙盒，所述的外包裝紙盒中設(shè)有無花果葉提取液包裝試劑瓶、堿性染料包裝試劑瓶、酸性染料包裝試劑瓶和細胞核染色試劑包裝試劑瓶。本實用新型設(shè)計合理、結(jié)構(gòu)簡單、取用方便、染色效率和細胞的辨別率高的細胞染色試劑盒。
文檔編號G01N1/30GK203011760SQ201220530919
公開日2013年6月19日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者朱遠源, 陳莉, 李鐵軍, 吳美華 申請人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司