專利名稱：一種軍團菌電化學(xué)dna生物傳感檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及電化學(xué)傳感器和預(yù)防醫(yī)學(xué)監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置。
背景技術(shù)：
1976年美國費城退伍軍人協(xié)會會員中曾爆發(fā)急性發(fā)熱性呼吸道疾病，經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)一種致病細(xì)菌并將之命名為嗜肺軍團菌。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過30種軍團桿菌，其中至少19種是人類肺炎的病原。最常見病原體為嗜肺軍團菌(占病例的859^90%)，該菌存在于水和土壤中，常經(jīng)供水系統(tǒng)、溶洞和霧化吸入而引起肺炎型和非肺炎型感染。除呼吸道癥狀外還有明顯的多器官損害，致死率較高。據(jù)最近的調(diào)查統(tǒng)計軍團菌引起的醫(yī)院感染也可高達(dá)23%，還可合并其他微生物感染，形成難治性肺炎，致死率高達(dá)45%。故軍團菌在機會感染或醫(yī)院內(nèi)感染中的位置日益被人們所重視。目前檢測軍團菌的免疫檢測技術(shù)有免疫層析法、酶免疫法、放射免疫法、細(xì)胞計量術(shù)及免疫傳感器技術(shù)。此外，還有熒光素原位分子雜交檢驗。但軍團菌不易分離培養(yǎng)，種類又繁多，目前尚無簡易、快速實驗室檢驗方法，故研究新的快速、特異、敏感的軍團菌檢測技術(shù)是當(dāng)今軍團菌檢驗技術(shù)研究的首要問題。而DNA電化學(xué)生物傳感器是近幾年國際熱點研究的一類新型生物傳感器，它是將單鏈DNA (ssDNA)修飾到電極表面，構(gòu)成DNA修飾電極，由于電極上的探針ssDNA與溶液中的互補鏈雜交的高度序列選擇性，使得該ssDNA修飾電極具有極強的分子識別能力。在適當(dāng)條件下，ssDNA探針分子與待測序列DNA(靶序列)雜交，在電極表面形成雙鏈的DNA(dsDNA)，從而導(dǎo)致雜交前后的電極表面結(jié)構(gòu)的改變，這種雜交前后的差異可以通過電化學(xué)檢測技術(shù)的響應(yīng)變化進行測定，從而達(dá)到檢測靶序列。這種新型DNA電化學(xué)生物傳感器不僅快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價，還具有分子識別、分離純化基因等功能，從而在分子生物學(xué)和生物工程醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。本研究將電化學(xué)生物傳感器技術(shù)應(yīng)用到軍團菌的檢測上來，從而開辟了快速、特異、敏感的軍團菌檢測技術(shù)的新思路與方法。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的在于提供一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置?？赏ㄟ^軍團菌電化學(xué)DNA傳感器的設(shè)計實現(xiàn)通過電化學(xué)方法對樣品中軍團菌核酸進行檢測的目的，并通過軍團菌電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)工作站和計算機的連接，實現(xiàn)軍團菌的電化學(xué)DNA生物傳感檢測，充分發(fā)揮了其快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價等特點，從而提高軍團菌監(jiān)測和檢測的應(yīng)急反應(yīng)速度。本實用新型的目的是這樣實現(xiàn)的，所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，包括一個軍團菌電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)工作站和計算機，其特點為軍團菌電化學(xué)DNA傳感器通過電極線與電化學(xué)工作站相連接，電化學(xué)工作站通過數(shù)據(jù)線連接計算機。所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，其特點為軍團菌電化學(xué)DNA傳感器包括參比電極、輔助電極、工作電極、反應(yīng)池、磁力攪拌子和帶溫控的磁力攪拌器；反應(yīng)池放置于帶溫控的磁力攪拌器上，磁力攪拌子放置于反應(yīng)池底部，參比電極、輔助電極和工作電極放置于反應(yīng)池中的反應(yīng)液內(nèi)。所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，其特點為工作電極采用玻碳電極，在玻碳電極表面上設(shè)置有特異性的軍團菌DNA探針。所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，其特點為在玻碳電極表面上通過工作電極表面的-COOH基團連接有特異性的軍團菌DNA探針。本實用新型的優(yōu)點對比以往水樣中軍團菌檢測的常規(guī)方法，本方法無需分離培養(yǎng)耗時大大減少，采用了軍團菌特異性片段為探針可使檢測的特異性和靈敏度大大提升，并且此傳感器便于攜帶，可以用于多種環(huán)境下的現(xiàn)場檢測，尤其適用于現(xiàn)場定性檢測，做到現(xiàn)場快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測。

圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為圖1中的軍團菌電化學(xué)DNA傳感器的工作電極的放大結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為圖2的軍團菌電化學(xué)DNA傳感器的工作電極與待檢的軍團菌DNA片段結(jié)合的放大結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為軍團菌電化學(xué)DNA傳感器；2為電化學(xué)工作站；3為計算機；4為參比電極；5為輔助電極；6為工作電極；7為反應(yīng)池；8為磁力攪拌子；9為帶溫控的磁力攪拌器；10為電極線；11為數(shù)據(jù)線；12為工作電極表面的-COOH基團；13為特異性的軍團菌DNA探針；14為待檢的軍團菌DNA片段。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進行詳細(xì)說明如圖1、圖2和圖3所示，所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，包括一個軍團菌電化學(xué)DNA傳感器1、電化學(xué)工作站2和計算機3，其結(jié)構(gòu)特點為軍團菌電化學(xué)DNA傳感器I通過電極線10與電化學(xué)工作站2相連接，電化學(xué)工作站2通過數(shù)據(jù)線11連接計算機3。軍團菌電化學(xué)DNA傳感器1，包括參比電極4、輔助電極5、工作電極6、反應(yīng)池7、磁力攪拌子8和帶溫控的磁力攪拌器9。反應(yīng)池7放置于帶溫控的磁力攪拌器9上，磁力攪拌子8放置于反應(yīng)池7底部，參比電極4、輔助電極5和工作電極6放置于反應(yīng)池7中的反應(yīng)液內(nèi)。電化學(xué)工作站2經(jīng)電極線10采集軍團菌電化學(xué)DNA傳感器I上通過參比電極4、輔助電極5和工作電極6的產(chǎn)生電信號，并傳輸?shù)接嬎銠C3進行數(shù)據(jù)分析處理。本實用新型的制作如下包括以下4個步驟(I)首先構(gòu)建軍團菌電化學(xué)DNA傳感器I中的工作電極6，先將玻碳電極進行預(yù)處理，然后用裝有IOOmL的偶聯(lián)劑[5 mmol/L EDC (鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)_ 8 mmol/L NHS (羥基丁二酰亞胺)]浸泡后雙蒸水沖洗，N2吹干后，直接在電極表面滴加特異性的軍團菌DNA探針13，用
O.2%SDS洗滌后用電化學(xué)工作站測其阻抗值；(2)搭建軍團菌電化學(xué)DNA傳感器1，將反應(yīng)池7放置于帶溫控的磁力攪拌器9上，磁力攪拌子8放置于反應(yīng)池7底部，在電極支架上固定上參比電極4、輔助電極5和工作電極6，調(diào)節(jié)支架高低，將參比電極4、輔助電極5和工作電極6放置于反應(yīng)池7中的反應(yīng)液內(nèi)。(3)電化學(xué)信號檢測平臺的搭建，軍團菌電化學(xué)DNA傳感器I通過電極線10與電化學(xué)工作站2相連接，電化學(xué)工作站2通過數(shù)據(jù)線11連接計算機3。實驗過程先將本實用新型的軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置按上述步驟組裝，打開電源、電化學(xué)工作站2和計算機3 ;將待檢測的樣品放入反應(yīng)池7中，將表面修飾特異性的軍團菌DNA探針13的工作電極6浸沒在待測樣本溶液中35°C雜交40min后并雜交連接上待檢的軍團菌DNA片段14，用0. 2%SDS洗滌3分鐘，用電化學(xué)工作站2在0. OOlmol/L鐵氰電對(K3Fe(CN)6/ K4 Fe (CN) 6)溶液中測定雜交后的阻抗值，測定條件為方法選擇為交流阻抗法，初始電位選擇為即時開路電位，高頻選擇100000Hz，低頻選擇1Hz，振幅為0. 005V ;或在2X l(T5mol/L亞甲藍(lán)溶液中富集5min后于0. 02mol/L Tris-HCl溶液做差分脈沖伏安法(DPV)掃描，測定條件為方法選擇為差分脈沖伏安法，初始電位為-1V終止電位為IV，電位增量為0. 004V，振幅為0. 05V，脈沖寬度為0. 2秒。通過交流阻抗譜圖判斷分析，當(dāng)雜交后雙鏈的阻抗值大于雜交前單鏈阻抗值則表明樣本中含有軍團菌屬；通過差分脈沖伏安法譜圖判斷分析，當(dāng)雜交后雙鏈的DPV峰值小于雜交前單鏈的DPV峰值則表明樣本中含有軍團菌屬。
權(quán)利要求1.一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，包括一個軍團菌電化學(xué)DNA傳感器(I)、電化學(xué)工作站(2)和計算機(3)，其特征在于軍團菌電化學(xué)DNA傳感器(I)通過電極線(10 )與電化學(xué)工作站(2 )相連接，電化學(xué)工作站(2 )通過數(shù)據(jù)線(11)連接計算機。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，其特征在于軍團菌電化學(xué)DNA傳感器(I)包括參比電極(4)、輔助電極(5)、工作電極(6)、反應(yīng)池、磁力攪拌子(8)和帶溫控的磁力攪拌器(9);反應(yīng)池(7)放置于帶溫控的磁力攪拌器(9)上，磁力攪拌子(8)放置于反應(yīng)池(7)底部，參比電極(4)、輔助電極(5)和工作電極放置于反應(yīng)池(7)中的反應(yīng)液內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，其特征在于工
作電極(6)采用玻碳電極，在玻碳電極表面上設(shè)置有特異性的軍團菌DNA探針(13)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，其特征在于在玻碳電極表面上通過工作電極表面的-COOH基團(12)連接有特異性的軍團菌DNA探針(13)。
專利摘要本實用新型公開一種軍團菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測裝置，將DNA電化學(xué)生物傳感技術(shù)應(yīng)用于軍團菌的檢測。通過軍團菌電化學(xué)DNA傳感器的設(shè)計實現(xiàn)通過電化學(xué)方法對樣品中軍團菌核酸進行檢測的目的，并通過軍團菌電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)工作站和計算機的連接，實現(xiàn)軍團菌的電化學(xué)DNA生物傳感檢測，充分發(fā)揮了其快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價等特點，從而提高軍團菌監(jiān)測和檢測的應(yīng)急反應(yīng)速度。使用該裝置無需分離培養(yǎng)，耗時大大減少，采用了軍團菌特異性片段為探針可使檢測的特異性和靈敏度大大提升，并且此傳感器便于攜帶，可以用于多種環(huán)境下的現(xiàn)場檢測，尤其適用于現(xiàn)場定性檢測，做到現(xiàn)場快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測。
文檔編號G01N27/48GK202870030SQ20122053643
公開日2013年4月10日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者蔡怡珊, 肖武, 黃金寶, 劉愛林, 鄭暉, 劉海濤 申請人:福建國際旅行衛(wèi)生保健中心