專利名稱：新霉素檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種新霉素檢測試劑盒，特別是檢測動物源性食品中新霉素殘留量的試劑盒。背景技術：
新霉素是氨基糖甙類抗生素，被廣范應用于動物疾病的治療，由于其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒性，在動物食品中的殘留會影響人類健康，歐美國家及我國均要求其限量使用。新霉素殘留量的常規(guī)檢測方法主要有薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)等，由于復雜的儀器設備和繁瑣的過程以及對檢驗人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。(三)實用新型內(nèi)容本實用新型提供一種小巧輕便的新霉素檢測試劑盒，其操作簡便，檢測靈敏度高，成本低，可進行一次連續(xù)進行多個樣品中新霉素殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。新霉素檢測試劑盒，包括固相載體、放試劑的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，固相載體上設有微孔條，微孔條包括微孔、包被層；試劑瓶包括裝有新霉素單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。所述包被層由新霉素偶聯(lián)抗原組成。所述試劑盒還包括6瓶裝有新霉素標準液的試劑瓶，2瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。所述固相載體由96孔聚苯乙烯試劑板組成。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定，既可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢 測。檢測時，樣本中的新霉素將和微孔條包被層的新霉素偶聯(lián)抗原競爭新霉素單克隆抗體，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體后，用底物顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中新霉素的殘留量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中新霉素殘留量。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度檢測靈敏度為0. 5 μ g/L。相對于其他新霉素檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于動物源性食品中新霉素殘留量的檢測。


圖1本實用新型試劑盒的固相載體一列微孔條圖。圖2本實用新型固相載體圖。圖3本實用新型盒體、下凹瓶位結構示意具體實施方式
如圖1至圖3所示，新霉素檢測試劑盒，盒體I內(nèi)具有固定模具形成的下凹瓶位2，下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶，96孔聚苯乙烯試劑板組成的固相載體3，固相載體的的微孔條4包括微孔5和包被層6，包被層由新霉素偶聯(lián)抗原組成，試劑瓶包括裝有新霉素單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。為了更有利于檢測新霉素殘留的檢測，試劑盒還可以包括有6瓶裝有新霉素標準液的試劑瓶，2瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。試劑盒的試劑瓶內(nèi)的具體成分如下(I)新霉素單克隆抗體工作液I瓶/7ml ；(2)新霉素標準品溶液Iml/瓶，濃度分別為Oy g/L、0. 5μ g/L、l. 5μ g/L、4. 5μ g/L、13. 5 μ g/L、40. 5 μ g/L ；(3)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體工作液7ml/瓶；(4)底物顯色液，分別為底物顯色A液，底物顯色B液，底物顯色液A液為過氧化脲7ml/瓶，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺7ml/瓶；(5)終止液 7ml/瓶； (6)緩沖液50ml/瓶，為含有1%甲醇、O. 01-0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液。使用時2
倍稀釋。(7)洗滌液40ml/瓶，為含有O. 8%-1. 2%吐溫_20、0. 5%疊氮化鈉、O. 01mol/L磷酸鹽緩沖液。使用時20倍稀釋。試劑盒中用到的主要材料的制備方法新霉素偶聯(lián)抗原的制備(I)新霉素偶聯(lián)抗原的制備將新霉素與血藍蛋白通過碳化二亞胺法偶聯(lián)得到新霉素偶聯(lián)抗原。新霉素單克隆抗體的制備( I)動物免疫將免疫原(新霉素與卵清蛋白通過碳化二亞胺法偶聯(lián)得到)注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。(2)細胞融合和克隆化小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按9:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。(3)細胞凍存和復蘇將新霉素單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成I X IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。(4)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射新霉素單克隆雜交瘤細胞株5X107個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，_20°C保存。(5)羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。(6)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的制備將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯(lián)得到。(一)使用新霉素檢測試劑盒檢測新霉素的操作步驟1、取出需要數(shù)量的微孔板。2、加標準品/樣本加標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，隨即加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體50 μ I/孔，在加入新霉素單克隆抗體工作液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，置25 °C避光環(huán)境中反應30min。3、洗板將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4 — 5次，每次間隔IOs,用吸水紙拍 干。4、顯色加入底物液顯色液各50 μ I/孔，混勻，置25°C避光環(huán)境中反應15min。5、測定加入終止液50 μ I/孔,混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔OD值。(二)結果判定(I)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，即
權利要求1.一種新霉素檢測試劑盒，包括固相載體、放試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，其特征在于固相載體上設有微孔條，微孔條包括微孔、包被層；試劑瓶包括裝有新霉素單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。
2.如權利要求1所述的新霉素檢測試劑盒，其特征在于所述包被層由新霉素偶聯(lián)抗原組成。
3.如權利要求1所述的新霉素檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括6瓶裝有新霉素標準液的試劑瓶，2瓶裝有顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。
4.如權利要求1所述的新霉素檢測試劑盒，其特征在于所述固相載體由96孔聚苯乙烯試劑板組成。
專利摘要本實用新型涉及一種新霉素檢測試劑盒。該試劑盒包括固相載體、放試劑的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，固相載體上設有微孔條，微孔條包括微孔、包被層，包被層由新霉素偶聯(lián)抗原組成；試劑瓶包括裝有新霉素單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。本實用新型試劑盒可用于新霉素的殘留量檢測，與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度、檢測樣本量大等特點。
文檔編號G01N33/577GK202903800SQ20122056076
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權日2012年10月30日
發(fā)明者何方洋, 余厚美, 劉福林, 王建霞, 何麗霞, 蒲小容, 段盈盈 申請人:北京勤邦生物技術有限公司