紙質(zhì)支持物和從其中回收生物材料的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，所述紙質(zhì)支持物用于生物材料的儲存和進(jìn)一步處理。本發(fā)明具體地涉及至少一個表面包被有化學(xué)品的紙質(zhì)支持物，所述化學(xué)品提高生物材料從所述支持物的回收率。還描述了制備和使用所述紙質(zhì)支持物的方法。
【專利說明】紙質(zhì)支持物和從其中回收生物材料的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，特別地涉及可用于儲存、回收和進(jìn)一步處理生物材料例如生物制藥藥物的的紙質(zhì)支持物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]使用固體支持物例如濾紙來收集和分析人血液可回溯至I960年代早期，當(dāng)時Robert Guthrie博士為檢測苯丙酮尿癥而使用干血斑(DBS)樣本測定新生兒中的苯丙氨酸(Mei, J.等,2001 Journal of Nutrition, 131:1631S-1636S)。這一收集血液的新應(yīng)用引發(fā)了新生兒的群體篩查以檢測可治療的遺傳代謝疾病。現(xiàn)在DBS用于篩查大量的新生兒代謝疾病已經(jīng)40多年了。
[0004]DBS樣本通過將來自靜脈血或直接來自指尖或足跟針刺的全血點(diǎn)在固體支持物例如膜、玻璃纖維或紙上進(jìn)行收集，使得這種方法特別適合樣本從周邊診所運(yùn)輸?shù)街行膶?shí)驗(yàn)室。此外，包裝在帶有干燥劑的拉鎖(zip-lock)塑料袋中的DBS能夠在室溫下儲存和運(yùn)輸，因此避免需要i)冷鏈儲存和ii)快速專用運(yùn)輸。通過將血滴涂到吸收材料例如Whatman903新生兒STD紙上收集的DBS不受IATA危險物品規(guī)定(IATA Dangerous Goods Regulations)(附錄II，2005年3月)的管制。
[0005]其他用于收集、運(yùn)輸和儲存用于嬰兒和新生兒篩查目的的DBS和其他體液的固體紙質(zhì)支持物包括:
[0006]1.Ahlstrom226
[0007]2.MunktellTFN(CE 標(biāo)記)
[0008]3.Toyo Roshi grade545Advantec Toyo, Tokyo (參見Elvers L等 2007 ;J.1nheritMedtab Dis30,4,609)。
[0009]所有這些紙,例如Whatman903新生兒STD紙，由棉毛纖維構(gòu)成。Whatman903新生兒STD紙和Ahlstr0m226紙被劃分為II類醫(yī)療衛(wèi)生器材。有潛力發(fā)展為用于嬰兒和新生兒篩查目的的器材的固體紙質(zhì)支持物包括由Macherey Nagel (例如MN818)、Reeve Angel (例如Doublering)和Hahnemuhle Grade2292生產(chǎn)的那些固體紙質(zhì)支持物。
[0010]DBS的消耗費(fèi)用小于I美元/測試，而且與需要液體形態(tài)和專用運(yùn)輸條件的血漿相化，運(yùn)輸費(fèi)用顯著下降(Johannessen, A.等，2009;J Antimicrobial Chemotherapy, 64,1126-1129)。盡管實(shí)際測試費(fèi)用保持未變，并且在中心實(shí)驗(yàn)室從DBS提取分析物包含一些額外的操作時間，但DBS和特別的固體紙質(zhì)支持物的使用正越來越多地用于儲存和/或分析生物材料例如核酸、蛋白質(zhì)等。此外，DBS還被用于藥物發(fā)現(xiàn)過程中，其中將候選的低分子量藥物化合物注入測試動物，并監(jiān)測血液中的濃度水平。
[0011]近年來，生物技術(shù)來源的重組蛋白、肽和基于抗體的藥物以及用于基因治療的反義寡核苷酸和DNA已發(fā)展成為主流的治療藥劑，并且現(xiàn)在構(gòu)成臨床開發(fā)下的化合物的主要部分。這些藥劑通常被稱為“生物技術(shù)藥物”或“生物制藥藥物”，以將其與低分子量藥物化合物區(qū)分。
[0012]生物技術(shù)藥物和低分子量藥物化合物的藥物代謝和藥代動力學(xué)(DMPK)分析很重要，因?yàn)镈MPK分析對藥物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，其對候選藥物可能如何被機(jī)體吸收、代謝和排出提供深入的了解。分析通常在藥物發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行，并包括將目的化合物給予動物和測定生物液體中藥物(或代謝物)濃度作為時間函數(shù)。這產(chǎn)生了有價值的信息，例如藥物清除、生物利用度等，但是需要大量時間和資源(Beaudette, P.等，2004 ;J.0fChromatographyB809,153—158)。
[0013]與通常在藥物篩選程序中進(jìn)行的DMPK分析有關(guān)的主要問題是明顯缺乏合適的用于在分析前保持血液樣本穩(wěn)定性和完整性的儲存介質(zhì)。目前的方法使用在指定時間從給藥的動物收集的血漿或全血。然而，這種方法有許多缺陷，包括涉及耗時步驟，其造成分析過程中的瓶頸。此外，對于時程實(shí)驗(yàn)，單只動物多次抽血是有限制的。這給高通量帶來了限制并增加了動物的使用，其結(jié)果是較少的先導(dǎo)化合物能夠得以開發(fā)。
[0014]DBS需要少的血液體積，使得能夠從一只動物連續(xù)取血,而不是從數(shù)只動物混合取血，這顯著改善了 DMPK和毒理動力學(xué)數(shù)據(jù)和評估的質(zhì)量。對于“3R” (減少、優(yōu)化和代替)，DBS所需要的減少的血液體積(通常15-20 μ I/斑點(diǎn))的倫理學(xué)益處在臨床前藥物研發(fā)中是顯而易見的。測試動物的數(shù)量能夠顯著降低。此外，在幼年毒理學(xué)研究中非末端取血是可能的，當(dāng)局正逐漸要求幼年毒理學(xué)研究作為兒科用藥的安全生評估的一部分。調(diào)整的動物毒理學(xué)研究的另一優(yōu)點(diǎn)是數(shù)據(jù)質(zhì)量的提高。
[0015]因此，由于在藥代動力學(xué)研究中迅速分析大量血液樣本的需要的增長，DBS已經(jīng)成為一個有吸引力的選擇。對于作為DBS固體支持物的紙，以下的紙是合乎需要的:所述紙結(jié)合了令人滿意的力學(xué)性能和在穩(wěn)定狀態(tài)下保存目的生物材料的能力，以這樣一種方法致使其可在儲存后經(jīng)受進(jìn)一步處理和/或分析。用于DMPK分析的這類紙的實(shí)例為被稱為903新生兒樣本收集紙的那些紙，以及例如在US專利號5，75，126和5，939，259中描述的稱為FTA和FTA Elute的那些紙。
[0016]為了有效地下游處理和分析，目的分析物(例如內(nèi)源蛋白質(zhì)或生物技術(shù)藥物)必須易于使用符合高通量處理的相對簡單的技術(shù)從固體紙質(zhì)支持物提取。
[0017]DBS和內(nèi)源蛋白質(zhì)檢測的組合在科學(xué)文獻(xiàn)中已有所描述。例如，囊性纖維化病(CF)的生物標(biāo)志物免疫反應(yīng)性胰蛋白酶(IT)，Ryley等人在1981發(fā)表了來自DBS的內(nèi)源性IT首次報道用于CF篩查(J.Clin,Pathol.34，906-910)。從那以后，使用來自新生兒的DBS, IT已經(jīng)被常規(guī)用作CF指示物。許多商業(yè)化機(jī)構(gòu)提供FDA批準(zhǔn)的免疫測定試劑盒用于該應(yīng)用。許多人簡單地使用“紙內(nèi)(paper-1n)”的方法，其中含有DBS的紙孔片(punch)直接應(yīng)用于免疫測定并在原位提取目的分析物。最近(Lindau-Shepard&Pass, 2010, ClinicalChem.56,445-450)證實(shí)IT以兩種不同的同工型存在。這些作者報道開發(fā)了一種基于混懸液(或紙內(nèi))陣列的免疫測定法用于診斷CF，其利用了 IT的兩種不同的同工型。所有這些基于蛋白質(zhì)的研究在未包被的Guthrie卡(Whatman903紙)上進(jìn)行。
[0018]自從匿名人類免疫缺陷(HIV)篩查開始，已經(jīng)進(jìn)行了超過120萬份的DBS測試，用于在孕婦血液中的內(nèi)源性抗-HIV抗體的血清學(xué)檢測。
[0019]這些研究已經(jīng)證實(shí):i)證實(shí)關(guān)于血液和任何相關(guān)目的蛋白的長期儲存的擔(dān)憂是沒有根據(jù)的；和ii)DBS中存在的血紅素不干擾測定進(jìn)行。
[0020]因此，生產(chǎn)為生物材料提供簡單、穩(wěn)定的儲存介質(zhì)的紙質(zhì)支持物是合乎需要的，所述生物材料包括i)內(nèi)源性部分和ii)生物制藥或生物技術(shù)藥物，所述紙質(zhì)支持物在進(jìn)一步處理中提供生物材料的高產(chǎn)率或回收率。本發(fā)明提出這些需求并提供提高從固體紙質(zhì)支持物上的以DBS儲存的生物樣本中生物材料例如生物制藥藥物的回收水平的方法。
[0021]定義
[0022]本文所用術(shù)語“生物材料”意指如下定義的任何“生物分子”、“合成來源的生物分子”、“生物制藥藥物”或“細(xì)胞包組分”:
[0023]i)生物分子是由生命體產(chǎn)生的任何有機(jī)分子，包括大的多聚體分子例如蛋白質(zhì)、多糖和核酸，以及小的低分子量分子例如初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物和天然產(chǎn)物。
[0024]ii)合成來源的生物分子是采用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生或通過其他非生命的體外方法化學(xué)合成的如上文i)中定義的“生物分子”。
[0025]iii)生物制藥藥物(或“生物技術(shù)藥物”)是生物技術(shù)來源的重組蛋白質(zhì)、肽或基于抗體的藥物，或用于基因治療的反義寡核苷酸、蛋白質(zhì)核酸(PM)或脫氧核糖核酸(DNA)。
[0026]iv)細(xì)胞組分是獨(dú)特的、高度組織化的構(gòu)成細(xì)胞和有機(jī)體的一種或多種物質(zhì)。實(shí)例包括膜、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸。同時，細(xì)胞組分的大部分位于細(xì)胞本身內(nèi)部，而一些可能存在于生物體的細(xì)胞外區(qū)域。
[0027]發(fā)明簡述
[0028]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，其具有至少一個表面包被有提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非尚子去垢劑和二糖。
[0029]一方面，所述化學(xué)品是聚乙烯醇(PVA)。
[0030]另一方面，所述非離子去垢劑是Tween20。
[0031]又一方面，所述二糖是α-β-海藻糖。
[0032]一方面，所述紙質(zhì)支持物是903新生兒STD紙。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種從紙質(zhì)支持物回收生物材料的方法，包括以下步驟:
[0034]i)將上文所述的紙質(zhì)支持物的表面與包含生物材料的樣本接觸；
[0035]ii)干燥紙質(zhì)支持物表面上的樣本；
[0036]iii)儲存紙質(zhì)支持物；和
[0037]iv)從所述表面提取生物材料。
[0038]一方面，步驟iii)包括在15_40°C的溫度范圍內(nèi)儲存紙質(zhì)支持物。優(yōu)選溫度在20-300C的范圍內(nèi)。另一方面，根據(jù)生物材料的熱穩(wěn)定性，將紙質(zhì)支持物儲存在較低的溫度。
[0039]樣本的性質(zhì)取決于生物材料的來源。例如，所述來源可以是來自一定范圍的生物有機(jī)體，包括但不限于病毒、細(xì)菌、植物和動物。優(yōu)選所述來源是哺乳動物或人類受試者。對于哺乳動物和人類來源，樣本可以選自組織、細(xì)胞、血液、血漿、唾液和尿液。
[0040]另一方面，所述生物材料選自生物分子、合成來源的生物分子、細(xì)胞組分和生物制藥藥物。
[0041 ] 又一方面，所述生物材料是生物制藥藥物。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種制備上文所述的紙質(zhì)支持物的方法，包括將紙質(zhì)支持物的至少一個表面用提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品的溶液包被，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非離子去垢劑和二糖。
[0043]—方面,所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、Tween20和α-β-海藻糖。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供上文所述的紙質(zhì)支持物在提高生物材料從其中的回收率中的用途。
[0045]一方面，所述生物材料是生物制藥藥物。
[0046]附圖簡述
[0047]圖1表示從施加到各種紙質(zhì)基質(zhì)上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。
[0048]圖2表示從施加到包被有各種化學(xué)品的903新生兒STD紙上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。
[0049]發(fā)明詳述
[0050]重組IL一2 土 載體(R&D Syshems ;分別為目錄號 202-1L-CF-10 μ g ;批次AE4309112 和目錄號 202-1L-10 μ g ;批次 AE4309081)以 50pg 或 lOOpg/μ I 溶解于不含鈣和鎂的Dulbecco’s PBS (PAA ;目錄號H15-002，批次H00208-0673)，EDTA抗凝的人、兔或馬血(TCS BiOsciences)。
[0051]將等份試樣(I μ I包含0、50或IOOpg IL-2)施加于下列GE Healihcare濾紙:903新生兒STD卡，目錄號10538069，批次6833909W082 ;DMPK_A卡，目錄號WB129241，批次FT6847509 ；DMPK-B 卡，目錄號 WB129242，批次 FE6847609 和 DMPK-C 卡，目錄號 WB129243，批次FE6847009。在室溫和環(huán)境濕度下過夜使樣本干燥。
[0052]用合適大小的Harris Un1-core 打孔器(Sigma,目錄號 Z708860_25ea,批次 3110)從各紙質(zhì)類型打取孔片(直徑3毫米)。將單個孔片放入源自人IL-2Quantikine ELISA (R&DSystems,目錄號D0250，批次273275)的IL一2微孔板的單獨(dú)孔中。這些板由小鼠抗IL-2單克隆抗體包被。使用Quantikine試劑盒提供的測試緩沖液(100 μ I)將IL_2蛋白從紙孔片上洗脫。所有后續(xù)步驟都按照Quantikine試劑盒提供的說明書使用“紙內(nèi)”的方法(直接將紙孔片置入測定緩沖液中并原位直接洗脫分析物)進(jìn)行。測定完成，使用ThermoElectron Corporation, Multiskan Ascent在450nm監(jiān)測微孔板的光密度。通過與已知IL-2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較數(shù)值確定IL-2的回收率。對于每一單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)制作新的IL-2標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0053]另外的實(shí)驗(yàn)包括903新生兒STD卡在數(shù)種化學(xué)溶液(如下文所述)中飽和浸泡之后，將加有IL-2的血液施加到所述卡上。
[0054]使用的化學(xué)品
[0055]下文給出化學(xué)品及其來源的列表。
[0056]聚乙烯醇(Sigma;目錄號 P8136，批次 039k0147)。
[0057]聚乙烯亞胺，含50%于水中(Fluka，目錄號P3143，批次29kl492)。
[0058]菊粉，含1%于水中(Sigma，目錄號 12255-lOOg，批次 079F7110)。
[0059]Tween20，含 1%于水中(Sigma，目錄號 P7949_100ml，批次 109k01021)。
[0060]α-β -海藻糖，10mg/ml (Sigma,目錄號 T0299_50mg，批次 128kl337)。
[0061]聚乙二醇1000，含 1%于水中(Biochemika,目錄號 81189，批次 1198969)。
[0062]聚乙二醇200，含I %于水中(Fluka，目錄號81150，批次1384550)。
[0063]實(shí)駘結(jié)果[0064]當(dāng)IL-2溶解于EDTA抗凝血中時，903和DMPK-C卡促進(jìn)該細(xì)胞因子的回收率為45-55%，而從DMPK-A和B卡只有2-3%被回收(見表I和圖1)。903和DMPK-C卡是基礎(chǔ)紙，沒有被任何化學(xué)品浸泡或包被，而DMPK-A和B卡分別被促進(jìn)蛋白質(zhì)、微生物和細(xì)胞變性和失活的化學(xué)品的專有混合物包被。這些卡被設(shè)計(jì)為利于核酸的運(yùn)輸和長期儲存。因此，使用DMPKA和B卡時發(fā)現(xiàn)的低IL-2回收水平實(shí)際上可能是存在這些變性試劑和所用的基于ELISA的抗體檢測系統(tǒng)的反映。ELISA檢測系統(tǒng)要求洗脫的IL-2顯示完整的天然結(jié)構(gòu)。
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，其具有至少一個表面包被有提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非離子去垢劑和二糖。
2.權(quán)利要求1的紙質(zhì)支持物，其中所述化學(xué)品是聚乙烯醇(PVA)。
3.權(quán)利要求1的紙質(zhì)支持物，其中所述非離子去垢劑是TWeen20。
4.權(quán)利要求1的紙質(zhì)支持物，其中所述二糖是α-β_海藻糖。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物，其中所述支持物是903新生兒STD紙。
6.一種從紙質(zhì)支持物回收生物材料的方法，包括以下步驟: i)將前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物的表面與含有生物材料的樣本接觸； ii)干燥在所述紙質(zhì)支持物的所述表面上的所述樣本； iii)儲存所述紙質(zhì)支持物；和 iv)從所述表面提取所述生物材料。
7.權(quán)利要求6的方法，其中步驟iii)包括在15-40°C的溫度范圍內(nèi)儲存所述紙質(zhì)支持物。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述樣本選自組織、細(xì)胞、血液、血漿、唾液和尿液。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物材料選自生物分子、合成來源的生物分子、細(xì)胞組分和生物制藥藥物。
10.權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物材料是生物制藥藥物。
11.一種制備權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物的方法，包括將紙質(zhì)支持物的至少一個表面用提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品的溶液包被，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非離子去垢劑和二糖。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、TWeen20和α-β-海藻糖。
13.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物在提高生物材料從其中的回收率中的用途。
14.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物在提高生物制藥藥物從其中的回收率中的用途。
【文檔編號】G01N33/96GK103460052SQ201280010443
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月25日
【發(fā)明者】J·K·霍頓, P·J·塔特內(nèi)爾, S·L·J·斯圖布斯 申請人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)英國有限公司