用于測定睪酮在樣品中的存在或量的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】公開了用于使用支撐液萃取和液相色譜-質(zhì)譜法分析樣品中的睪酮的方法和系統(tǒng)。
【專利說明】用于測定睪酮在樣品中的存在或量的方法和系統(tǒng)
[0001]與相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求保護(hù)2011年2月7日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/440，282的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，如同在本文中完全顯示一樣將所述臨時(shí)專利申請通過引用并入。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本申請?zhí)峁┝擞糜跍y定生物標(biāo)志物在樣品中的存在或量的方法和系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明提供了使用液相色譜和質(zhì)譜法分析樣品中的睪酮的方法和系統(tǒng)。
[0004]背景
[0005]生物標(biāo)志物例如激素、維生素和/或代謝物可被用于多種病癥的臨床診斷和在內(nèi)分泌學(xué)中用作內(nèi)源性生物標(biāo)志物。類固醇激素例如睪酮是一類重要的激素。睪酮產(chǎn)生并且維持男性第二性征，以及促進(jìn)精子的生長和發(fā)育。
[0006]腎上腺和性腺合成睪酮。水平可因酶阻斷而在先天性腎上腺增生患者中升高，這減少了皮質(zhì)醇的產(chǎn)生并且增加了導(dǎo)向產(chǎn)雄激素途徑的前體水平。睪酮還可在具有多毛癥的女性中升高。卵巢可以是這類患者中該激素的重要來源。由于在睪丸中產(chǎn)生，睪酮在成年男性中通常比其在女性和兒童中高得多。在男性中的水平在性腺機(jī)能減退狀態(tài)中可下降。
[0007]內(nèi)分泌學(xué)中內(nèi)源性生物標(biāo)志物的臨床診斷測試的需要可包括高度靈敏性和特異性測定，分析小的樣品容積(例如，兒科樣品容積可被限定為小于約200 u L)的能力和篩選多個(gè)分析物以精確診斷疾病狀態(tài)例如內(nèi)分泌病癥的能力。在歷史上，放射性免疫測定(RIA)和酶聯(lián)免疫測定(ELISA)法已被用于這樣的臨床診斷測試。然而，免疫測定法(IA)例如RIA和EIA可遭受低通量、抗體交叉反應(yīng)性的困擾，這可需要針對特異性和不良可擴(kuò)展性(poorscalability)的額外準(zhǔn)備。同樣地，通過RIA分析內(nèi)源性生物標(biāo)志物可需要多個(gè)系列稀釋來分析每一種個(gè)體標(biāo)志物，這可引起對進(jìn)行多次調(diào)整來使樣品容積標(biāo)準(zhǔn)化的需要和/或?qū)Χ鄠€(gè)單獨(dú)的測試的需要。同樣地，免疫測定測試對于分析每一個(gè)樣品中的多個(gè)生物標(biāo)志物也不是特別有幫助的。單個(gè)測定中多個(gè)分析物的分析可允許使用減少的尺寸的樣品，這產(chǎn)生具有增加的靈敏性和效率/樣品的測定。
[0008]因此，存在對開發(fā)可用于測量內(nèi)源性生物標(biāo)志物的分析技術(shù)和提供比RIA更強(qiáng)的靈敏性和更高的通量的方法的需要。然而，直至最近，僅有伴有衍生化的GC-MS或LC-MS/MS對于小的樣品容積是成功的。因此，本領(lǐng)域中存在對用于分析內(nèi)分泌學(xué)中的臨床診斷的內(nèi)源性生物標(biāo)志物的LC-MS/MS技術(shù)的需要，該技術(shù)能夠提供可接受水平的檢測限，而無需繁復(fù)的衍生過程。
[0009]發(fā)明概述
[0010]在至少一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測定睪酮在樣品中的存在或量的方法，所述方法包括:(a)提供包含睪酮的樣品；(b)使用支撐液萃取(supported liquidextraction)部分純化樣品，從而提供經(jīng)部分純化的包含睪酮的樣品；(c)使用液相色譜法將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離；和(d)通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以測定睪酮在樣品中的存在或量。在下文中對這類方法的其它實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。[0011]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測定睪酮在生物學(xué)樣品的量的方法，所述方法包括:(a)提供樣品，所述樣品包括含有睪酮的生物學(xué)樣品；(b)使用支撐液萃取部分地純化樣品，從而提供部分純化的包含睪酮的樣品；(C)使用反相液相色譜法色譜地將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分分離；和(d)通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮，以測定睪酮在生物學(xué)樣品中的量。在下文中對這類方法的其它實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)描述。
[0012]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生用于診斷與異常睪酮水平相關(guān)的疾病或病況的報(bào)告的方法，所述方法包括:(a)提供樣品，所述樣品包括含有睪酮的生物學(xué)樣品；(b)使用支撐液萃取部分純化樣品以提供含有睪酮的經(jīng)部分純化的樣品；(C)使用液相色譜法將睪酮色譜地與部分純化的樣品中的其它組分分離；(d)通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以測定睪酮在生物樣中的量；和(e)產(chǎn)生引述生物學(xué)樣品中的睪酮的濃度的報(bào)告。在下文中對這類方法的其它實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)描述。
[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測定睪酮在樣品中的存在或量的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:(a)用于使用支撐液萃取部分純化樣品的工作站(station)，樣品包含睪酮；(b)用于使用液體相色譜法將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離的工作站；和(C)用于通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以測定睪酮在樣品中的存在或量的工作站。在下文中對這類方法的其它實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)描述。
[0014]下文中對本發(fā)明的其它方面進(jìn)行了詳細(xì)描述。
[0015]附圖概述
[0016]不適用。
[0017]詳述
[0018]下面的描述陳述了.本發(fā)明的不同方面和實(shí)施方案。具體的實(shí)施方案無意界定本發(fā)明的范圍。相反地，實(shí)施方案僅提供至少包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的不同方法和系統(tǒng)的非限定性實(shí)例。要從本領(lǐng)域技術(shù)人員的角度來閱讀所述描述；因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的信息不必然包括在內(nèi)。
[0019]各種縮寫可用于本申請。在大多數(shù)(如果不是全部的話)情況下，此類縮寫的含義對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。這些縮寫包括提供了其含義的下列縮寫。
[0020]APCI=大氣壓化學(xué)電離
[0021]CBP=競爭性結(jié)合蛋白
[0022]HTLC=高湍流(通量)液相色譜
[0023]HPLC=高效液相色譜
[0024]LLE=液-液提取
[0025]LOQ=定量限
[0026]LLOQ=定量下限
[0027]IA=免疫測定
[0028]ELISA=酶聯(lián)免疫測定
[0029]RIA=放射免疫測定
[0030]SST=系統(tǒng)適用性測試
[0031]ULOQ=定量上限
[0032]2D-LC-MS/MS =接合至串聯(lián)質(zhì)譜的二維液相色譜[0033](LC)-LC-MS/MS =接合至質(zhì)譜的二維液相色譜串聯(lián)
[0034](LC) -MS/MS =接合至串聯(lián)質(zhì)譜的液相色譜
[0035]SLE=支撐液萃取
[0036]定義
[0037]下列術(shù)語，除非另有所指，應(yīng)被理解為具有下列含義:
[0038]如本文中所用，術(shù)語“一個(gè)/ 一種(a)”、“一個(gè)/ 一種(an)”和“所指物(the) ”，除非另外指出，可指一個(gè)或多個(gè)。
[0039]如本文中所用，術(shù)語“生物標(biāo)志物”是可提供關(guān)于生物體的生理狀態(tài)的生物學(xué)信息的任何生物分子。在某些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物的存在或不存在是可提供信息的。在其它實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物的水平是可提供信息的。生物標(biāo)志物可以是激素例如睪酮或激素的代謝物。
[0040]在整個(gè)本申請中，術(shù)語“約”用于表示值，其包括裝置、用于測定值的方法的固有誤差變化，或研究受試者之間存在的變化。
[0041 ] 如本文中所用，術(shù)語“受試者”、“個(gè)體”和“患者”可互換地使用。這些術(shù)語的使用不表示與醫(yī)學(xué)專業(yè)人員例如醫(yī)生的任何類型的關(guān)系。
[0042]如本文中所用的，用語“液相色譜”或“LC”用于指用于將樣品中的一種或多種分子或分析物與樣品中其它分析物分離的方法。LC包括當(dāng)流體均勻地運(yùn)動通過細(xì)碎物質(zhì)的柱子時(shí)對流體溶液的一種或多種分析物的減緩。減緩產(chǎn)生自混合物的組分在一個(gè)或多個(gè)固定相與流動相之間的分配。LC包括例如反相 液相色譜(RPLC)和高壓液相色譜(HPLC)。
[0043]如本文中所用的，術(shù)語“分離”或“純化”等不一定用于指從樣品基質(zhì)除去除目標(biāo)分析物外的所有材料。相反地，在一些實(shí)施方案中，此術(shù)語用于指相對于存在于樣品基質(zhì)中的一種或多種其它組分而富集一種或多種目標(biāo)分析物的量的方法。在一些實(shí)施方案中，“分離”或“純化”可用于從樣品種除去或減少可干擾分析物的檢測(例如，通過質(zhì)譜法)的一種或多種組分的量。
[0044]如本文中所用的，術(shù)語“質(zhì)譜法”或“MS”分析是指用于鑒定和/或定量樣品中的分子的技術(shù)。MS包括電離樣品中的分子，形成帶電荷的分子；按照它們的質(zhì)荷比分離帶電荷的分子；和檢測帶電荷的分子。MS允許定性和定量檢測樣品中的分子。分子可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉黼婋x和檢測。用語“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“MS/MS”在本文中用于指用于鑒定和/或定量樣品中的分子的技術(shù)，其中使用超過一個(gè)質(zhì)量分析器同時(shí)地、或使用單個(gè)質(zhì)量分析器相繼地進(jìn)行多輪質(zhì)譜法。如本文中所用的，“質(zhì)譜儀”是包括用于電離分子和檢測帶電荷的分子的工具的裝置。
[0045]如本文中所用的，“電噴霧電離”或“ESI”是指在質(zhì)譜法中用于電離樣品中的分子同時(shí)避免分子片段化的技術(shù)。使樣品通過電噴霧分散成為細(xì)微的氣霧。通常將樣品與溶劑(通常為與水混合的揮發(fā)性有機(jī)化合物(例如，甲醇或乙腈))混合。隨后將氣霧劑通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜儀，所述毛細(xì)管可被加熱以幫助溶劑從帶電荷的微滴進(jìn)一步蒸發(fā)。
[0046]如本文中所用的，“四極質(zhì)量分析器(quadrupole analyzer) ”是MS中使用的一種類型的質(zhì)譜分析儀。其由彼此高度平行放置的4個(gè)圓桿體(兩對)組成。四極質(zhì)量分析器是基于其質(zhì)荷比組織樣品的帶電 荷的顆粒的儀器組件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解使用四極質(zhì)量分析器可引起增加的結(jié)果特異性。將一對桿體設(shè)置在正電位，另一組桿體設(shè)置在負(fù)電位。為了被檢測，離子必須通過與對齊的桿體鄰接和平行的軌道路徑的中央。當(dāng)在給定的直流電波幅和射頻電壓下操作四極桿時(shí)，只有具有給定的質(zhì)荷比的離子才將共振，并具有穩(wěn)定的通過四極桿的軌道，且被檢測到。如本文中所用的，“正離子模式(positive ionmode) ”是指其中帶正電荷的離子被質(zhì)譜分析儀檢測到的模式負(fù)離子模式(negative ionmode) ”是指其中帶負(fù)電荷的離子被質(zhì)譜分析儀檢測到的模式。對于“選擇的離子監(jiān)測”或“SIM”，直流電荷的波幅和射頻電壓被設(shè)置至僅觀察特定的質(zhì)量。
[0047]如本文中所用的,術(shù)語“分析柱(analytical column) ”是指具有實(shí)現(xiàn)測試樣品基質(zhì)的組分的分離的充足的色譜板(chromatographic plates)的色譜柱。優(yōu)選地，以下述方式分離從分析柱洗脫的組分以允許測定目標(biāo)分析物的存在或量。在一些實(shí)施方案中，所述分析柱包含具有約5 u m的平均直徑的顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述分析柱是官能化的二氧化硅或聚合物-二氧化硅混合體，或聚合物顆?；蚬枘z整體固定相，例如苯基-己基官能化分析柱。
[0048]分析柱可與“萃取柱(extraction column) ”不同，所述萃取柱通常用于從非保留的材料中分離或提取保留的材料，以獲得“純化的”樣品以用于進(jìn)一步純化或分析。在一些實(shí)施方案中，萃取柱是官能化的二氧化硅或聚合物-二氧化硅混合體或聚合物顆?；蚬枘z整體固定相例如Poroshell SBC-18柱。
[0049]術(shù)語“中心切割(heart-cutting) ”是指在色譜圖中選擇目標(biāo)區(qū)域，使在該目標(biāo)區(qū)域內(nèi)洗脫的分析物經(jīng)歷第二分離例如第二維度中的分離。
[0050]如本文中所用的，術(shù)語“溶血的(hemolysed) ”是指紅細(xì)胞膜的破裂，這導(dǎo)致血紅蛋白和其它細(xì)胞內(nèi)容物釋放至血漿或血清中，術(shù)語“脂血的(Iipemic) ”是指血液中脂肪或脂質(zhì)的過量。
[0051]用于測定睪酮的存在或暈的方法
[0052]在至少一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測定樣品中睪酮的存在或量的方法，所述方法包括:(a)提供含有睪酮的樣品；(b)使用支撐液萃取(supported liquid extraction)部分純化所述樣品，從而提供含有睪酮的經(jīng)部分純化的樣品；(c)使用液相色譜將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離；和(d)通過質(zhì)譜分析色譜分離的睪酮以測定睪酮在樣品中的存在或量。
[0053]這些方法包括提供含有睪酮的樣品。在本說明書中，術(shù)語“提供”將在廣義上進(jìn)行解釋。此術(shù)語無意專門指提供生物學(xué)樣品的受試者。例如，非現(xiàn)場臨床實(shí)驗(yàn)室(off-siteclinical laboratory)中的技術(shù)人員可被認(rèn)為“提供”樣品，例如，當(dāng)制備樣品以用于通過提取和/或色譜法進(jìn)行純化時(shí)。
[0054]樣品不限于任何特定的樣品類型。樣品包含睪酮，但通常還包括其它組分。在一些實(shí)施方案中，樣品是已被加工并且被制備用于通過提取和/或色譜法進(jìn)行純化的樣品。這樣的加工可用于最優(yōu)化隨后的純化步驟的效率。這樣的加工法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。
[0055]本發(fā)明不限于樣品處理的任何具體方法。在一些實(shí)施方案中，在通過提取和/或色譜法進(jìn)行純化之前將樣品分成兩個(gè)或更多個(gè)級分可以是有用的。在一些這樣的實(shí)施方案中，可以不同地制備兩個(gè)或更多個(gè)這樣的級分，例如以幫助提高對于特定柱化學(xué)(columnchemistry)的分離的靈敏性或選擇性。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括制備用于跨多個(gè)液相色譜系統(tǒng)的重復(fù)注射的單一樣品。
[0056]本發(fā)明不限于任何具體的樣品尺寸。在一些實(shí)施方案中，樣品包括生物學(xué)樣品。在這樣的實(shí)施方案中，樣品還可包括其它組分例如溶劑、緩沖劑、抗凝劑等。在其中樣品包括生物學(xué)樣品的實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品可以是全血、血漿、血清、尿、腦脊髓液、組織勻漿、唾液、羊水、膽汁、粘液、腹膜液或淋巴液中的一種或多種。
[0057]此外，樣品中的睪酮不限于睪酮的任何特定形式。例如，睪酮包括碳、氧和氫原子。這些原子的每一種都具有天然存在的同位素。因此，樣品中一定量的睪酮可具有這類天然存在的同位素的一種或多種。此術(shù)語還包括陽離子和陰離子形式(例如，鹽形式)，如果存在的話。相反，本說明書在通過質(zhì)譜法分析睪酮的討論中特別是指睪酮離子(或電離的睪酮)。在下文中描述的這類情況下，僅涉及電離的睪酮。
[0058]所述方法還包括使用支撐液萃取(SLE)部分純化樣品。如上文中所指出的，樣品(除睪酮和一種或多種溶劑外)可包含各種其它組分。因此，樣品的部分純化提供了含有睪酮的部分純化的樣品。在一些實(shí)施方案中，各種其它組分的一種或多種的濃度已被除去，意指它們的濃度相對于部分純化的樣品中的睪酮的濃度已被減小。因此，術(shù)語“除去”或“去除”不一定意指組分的完全去除。一定量的除去的組分仍可存在于部分純化的樣品中，雖然其相對于睪酮的濃度的濃度將比在提取前的樣品中低。在一些實(shí)施方案中，除去的組分相對于部分純化的樣品中的睪酮的濃度的相對濃度不超過90%，或不超過75%，或不超過50%，或不超過33%,或不超過25%,或不超過10%,或不超過5%,或不超過1%的其相對于提取前的樣品中的睪酮的相對濃度。
[0059]本發(fā)明不限于任何特定類型的除去的組分。在一些實(shí)施方案中，所述除去的組分的一種或多種是可干擾通過質(zhì)譜法對睪酮進(jìn)行的分析的化合物，例如，因?yàn)樗龌衔锟删哂信c睪酮相似的質(zhì)量，或因?yàn)?，在片段化后，其產(chǎn)生具有與通過片段化睪酮產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)片段相同的質(zhì)量的一個(gè)或多個(gè)片段離子。這樣的化合物包括但不限于可的松、皮質(zhì)醇、21-去氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、11-去氧皮質(zhì)醇、曲安奈德、四氫皮質(zhì)醇、四氫-可的松、DHEA> 17a-輕孕麗、表辜麗(epitesterone)、二氧雄麗、5a_雄燒-3a-醇_17_麗(5a-androstan-3a-ol-17-one)、5b_ 孕燒-3a-17a_20a-三醇、etiocolan_3a- 二醇和孕二醇。
[0060]本發(fā)明不限于進(jìn)行SLE的任何特定方式。在一些實(shí)施方案中，樣品被吸附至惰性固相材料上?？墒褂酶鞣N這樣的材料。在一些實(shí)施方案中，將樣品吸附至硅藻土上。隨后使樣品和與水不混溶的有機(jī)溶劑系統(tǒng)接觸。此類溶劑系統(tǒng)在本領(lǐng)域是公知的。所述與水混溶的有機(jī)溶劑系統(tǒng)包括但不限于乙酸乙酯、己烷、甲苯、辛醇、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、環(huán)己烷、戊烷、N-庚烷、苯、正-丁基氯、丁醇、亞甲基氯及上述中任意兩種或更多種的混合物。在一些實(shí)施方案中，所述與水混溶的有機(jī)溶劑系統(tǒng)還可包括一定量的一種或多種極性溶齊U。在這樣的實(shí)施方案中，所述極性溶劑的量必須足夠低以確保溶劑系統(tǒng)一般保持與水不混溶。用于這樣的實(shí)施方案中的適當(dāng)?shù)臉O性溶劑包括但不限于甲醇、丙酮、乙腈、異丙醇、二乙醚或甲基-叔-丁基醚。在一些實(shí)施方案中，SLE中使用的與水不混溶的有機(jī)溶劑包括二氯甲烷與己烷的混合物。
[0061]可使用針對其設(shè)計(jì)的任何適當(dāng)?shù)难b置進(jìn)行SLE。適當(dāng)?shù)难b置包括但不限于板和柱子。在一些實(shí)施方案中，所述SLE采用一個(gè)或多個(gè)板。在一些這樣的實(shí)施方案中，SLE采用具有多個(gè)孔的板，例如96孔板。這樣的板是商購可得的。此外，可人工地或以自動化方式進(jìn)行SLE。此外，在一些實(shí)施方案中，部分純化步驟可通過對SLE裝置施加機(jī)械作用以促進(jìn)提取來實(shí)現(xiàn)。這樣的機(jī)械作用可包括攪拌、震動等。
[0062]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，部分純化的樣品可在色譜分離之前經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)處理步驟。例如，在一些實(shí)施方案中，蒸發(fā)所述經(jīng)部分純化的樣品。隨后，在溶劑系統(tǒng)中重構(gòu)所得的殘留物。任何適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)均可用于重構(gòu)含睪酮的殘留物。在一些實(shí)施方案中，溶劑系統(tǒng)是與色譜分離相容的溶劑系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，用于重構(gòu)的溶劑系統(tǒng)包括但不限于水、甲醇或其混合物。
[0063]所述方法包括使用液相色譜法來色譜分離睪酮。本發(fā)明不限于進(jìn)行液相色譜的任何特定方式。一般而言，色譜分離步驟包括使用至少一個(gè)液相色譜(LC)柱。在一些實(shí)施方案中，使用多個(gè)LC柱，例如2個(gè)或更多個(gè)，或3個(gè)或更多個(gè)，或4個(gè)或更多個(gè)LC柱。在一些這樣的實(shí)施方案中，使用2、3、4、5、6、8或10個(gè)LC柱。在一些這樣的實(shí)施方案中，將兩個(gè)或更多個(gè)此類LC柱彼此平行排列，并且內(nèi)聯(lián)至相同的質(zhì)譜儀。
[0064]本發(fā)明不限于柱子的任何特定類型?？墒褂眠m用于睪酮分離的任何柱子。在一些實(shí)施方案中，使用一個(gè)或多個(gè)分析柱。在一些此類實(shí)施方案中，使用一個(gè)或多個(gè)反相柱。在一些實(shí)施方案中，所述方法采用兩個(gè)或更多個(gè)平行的反向柱子，所述柱子被內(nèi)聯(lián)至相同的質(zhì)譜儀。
[0065]此外，本發(fā)明不限于任何特定的流動相?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)牧鲃酉?，只要流動相適合用于特定的LC柱和適用于在LC柱中色譜分離睪酮。在一些實(shí)施方案中，流動相是極性溶劑系統(tǒng)。極性溶劑系統(tǒng)可包括一種或多種極性溶劑，包括但不限于水、甲醇、乙腈或上述溶劑的兩種或更多種的混合物。在一些這樣的實(shí)施方案中，流動相采用梯度，以便使所述兩種或更多種溶劑的相對比率隨時(shí)間變化。
[0066]如上文中所指出的，可平行使用兩個(gè)或更多個(gè)LC柱(例如，反相柱)，并可將所述柱子內(nèi)聯(lián)至相同的質(zhì)譜儀，例如以提高通量。在一些這樣的實(shí)施方案中，將含有睪酮的樣品(即，例如蒸發(fā)和重構(gòu)后的經(jīng)部分純化的樣品)在不同的時(shí)間引入所述兩個(gè)或更多個(gè)LC柱。在一些實(shí)施方案中，交錯(cuò)將測試樣品引入至所述兩個(gè)或更多個(gè)LC柱，意思是在將樣品引入至兩個(gè)或更多個(gè)LC柱之間相隔預(yù)定的時(shí)間間隔?？苫诟鞣N因素來選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，包括洗脫時(shí)間、柱化學(xué)和避免干擾對從其它LC柱的一個(gè)或多個(gè)柱洗脫的睪酮的分析的潛在需要。
[0067]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可將另一個(gè)LC柱與另一個(gè)柱系列放置。例如，在一些實(shí)施方案中，可采用合適的保護(hù)柱(guard column)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)柱來用于本方法。在一些實(shí)施方案中，將保護(hù)柱與另一個(gè)LC柱平行放置，且保護(hù)柱和LC柱都是反相柱。還可平行地排列兩個(gè)或更多個(gè)柱子的此類系列，從而有平行運(yùn)行的兩個(gè)或更多個(gè)柱子系列，其中每一個(gè)系列包含兩個(gè)或更多個(gè)柱子。
[0068]所述方法包括通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以測定睪酮的存在或量。在一些實(shí)施方案中，將兩個(gè)或更多個(gè)LC柱子加至相同的質(zhì)譜儀。在一些其它實(shí)施方案中，將3個(gè)或更多個(gè)LC柱加至相同的質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，所述質(zhì)譜儀是組合的LC-MS系統(tǒng)的一部分。
[0069]本發(fā)明不限于質(zhì)譜儀的任何特定類型?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)馁|(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，所述方法采用串聯(lián)質(zhì)譜儀。在一些這樣的實(shí)施方案中，分析睪酮可包括電離睪酮，分析電離的睪酮，將睪酮離子片段化為兩個(gè)或更多個(gè)片段離子，以及分析所述片段離子。本發(fā)明不限于使用任何特定電離法的質(zhì)譜儀?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)碾婋x。適當(dāng)?shù)碾婋x包括但不限于光電離、電噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離和電子捕獲電離。在采用片段化的實(shí)施方案中，可使用任何適當(dāng)?shù)钠位夹g(shù)。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)包括但不限于碰撞誘導(dǎo)的解離、電子捕獲解離、電子傳遞解離(electron transfer dissociation)、紅外多光子解離、福射解離、電子 _ 脫離解離(electron-detachment dissociation)和表面誘導(dǎo)解離(surface-1nduceddissociation)。
[0070]在一些實(shí)施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜儀是MDS-Sciex API5000三重四極質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜儀具有大氣壓電離源，并且分析步驟包括選自光電離、電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、電子俘獲電離(electron capture ionization)、電子電離(electron ionization)、快原子轟擊 / 液體次級電離(liquid secondary ionization)(FAB/LSI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix assisted laser desorption ionization)(MALDI),場電離(field ionization)、場解吸附(field desorption)、熱噴霧 / 等離子體噴霧電離(plasmaspray ionization)和粒子束電離的電離法。所述電離法可以為正離子模式或負(fù)離子模式。分析步驟還可包括多反應(yīng)監(jiān)控或選擇性離子監(jiān)控(SIM)，同時(shí)或相繼地分析兩種或更多種生物分子。在一些實(shí)施方案中，所述分析步驟使用四極質(zhì)量分析器。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜儀是三重四極質(zhì)譜儀。
[0071]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。在這樣的實(shí)施方案中，可在色譜分離步驟之前在任何適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)引入內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)膬?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的睪酮。在一些這樣的實(shí)施方案中，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是通過碳-13和/或氘標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是2，3，4-13C-標(biāo)記的睪酮。
[0072]在一些實(shí)施方案中，不需要測定睪酮的量。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于確定睪酮在樣品中的存在或不存在。在其它實(shí)施方案中，所述方法用于測定樣品中睪酮的量。例如，在一些實(shí)施方案和/或方面中，本發(fā)明提供了用于測定生物學(xué)樣品中睪酮的量的方法，所述方法包括:(a)提供樣品，所述樣品包括含有睪酮的生物學(xué)樣品；(b)使用支撐液萃取來部分純化樣品，從而提供含有睪酮的部分純化的樣品；(C)使用反相液相色譜來將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離；和(d)通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以測定生物學(xué)樣品中睪酮的量。
[0073]在一些實(shí)施方案中，所述方法不限于檢測的任何下限和/或上限。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于測量樣品(例如，包括生物學(xué)樣品的樣品)中濃度在2.5ng/dL至5000ng/dL 或 5ng/dL 至 5000ng/dL 或 IOng/dL 至 5000ng/dL 或 2.5ng/dL 至 2000ng/dL 的范圍內(nèi)變化的睪酮。
[0074]產(chǎn)生報(bào)告的方法
[0075]在至少一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生用于診斷受試者中與異常睪酮水平相關(guān)的疾病或病況的報(bào)告的方法，所述方法包括:(a)提供樣品，樣品包括含有睪酮的生物學(xué)樣品；(b)使用支撐液萃取部分純化樣品以提供含有睪酮的部分純化的樣品；(c)使用液相色譜將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離；(d)通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以測定生物學(xué)樣品中睪酮的量；和(e)產(chǎn)生陳述生物學(xué)樣品中睪酮的濃度的報(bào)告。[0076]除步驟(e)外所有步驟的特征和實(shí)施方案剛才已在上文中進(jìn)行了描述。如上文中所指出的，所述方法可采用超過一個(gè)柱子，例如兩個(gè)或更多個(gè)平行地內(nèi)聯(lián)至相同質(zhì)譜儀的柱子。
[0077]所述方法還包括產(chǎn)生陳述樣品中至少一種睪酮的量的報(bào)告。在一些實(shí)施方案中，該信息可用于測定生物學(xué)樣品中睪酮的濃度。由這樣的信息，可評估受試者具有異常高還是異常低的睪酮量。
[0078]這樣的信息可被用于診斷受試者中的一種或多種可與睪酮的異常水平相關(guān)的疾病或病癥。這類疾病或病況在本領(lǐng)域中是公知的。這類疾病或病況包括但不限于先天性腎上腺增生、多毛癥和各種性腺機(jī)能減退狀態(tài)(hypergonadal state)。
[0079]用于分析生物分子的系統(tǒng)
[0080]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測定樣品中睪酮的存在或量的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:(a)用于使用支撐液萃取部分純化樣品的工作站，所述樣品包含睪酮；(b)用于使用液相色譜將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離的工作站；和(C)用于通過質(zhì)譜法分析色譜分離的睪酮以確定睪酮在樣品中的存在或量的工作站。
[0081]這樣的系統(tǒng)可包括與上文中描述的分析睪酮的方法的實(shí)施方案類似的各種實(shí)施方案和亞實(shí)施方案(subembodiment)。
[0082]這些系統(tǒng)包括各種工作站。如本文中所用的，術(shù)語“工作站”被廣義地定義并且包括適用于進(jìn)行所述方法的任何適當(dāng)?shù)难b置或裝置的集合。工作站無需以任何特定的方式相對于彼此整合連接或放置。本發(fā)明包括工作站相對于彼此的任何適當(dāng)?shù)呐帕?。例如，所述工作站甚至無需在相同的房間中。但在一些實(shí)施方案中，所述工作站在整體裝置中彼此連接。
實(shí)施例
[0083]下列實(shí)施例被包括來給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供指導(dǎo)來實(shí)施目前公開的主題的代表性實(shí)施方案。根據(jù)本公開的內(nèi)容和本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，下列實(shí)施方案意欲為僅僅說明性的并且可采用許多變化、修飾和改變而不背離目前公開的主題的范圍。
_4] 實(shí)施例1:睪酮的分析
[0085]將13C-睪酮添加至血清等分以評價(jià)和修正睪酮從每一個(gè)樣品的回收。用緩沖液以1:1稀釋睪酮，隨后將其添加至SLE+板。用己烷和二氯甲烷的混合物從血清和血漿樣品中提取睪酮。蒸發(fā)樣品，并用甲烷/水溶液重構(gòu)樣品。隨后將樣品注射至LC-MS/MS系統(tǒng)上。將以正離子大氣壓化學(xué)電離模式運(yùn)行的MDS-Sciex API5000三重四極質(zhì)譜儀用于檢測。在所選的反應(yīng)監(jiān)控模式(SRM)中進(jìn)行分析物和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的定量。根據(jù)通過將已知量的2.5至5000ng/dL的純化的分析物摻入活性炭處理血清產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線測定每一個(gè)樣品中單個(gè)分析物的反算(back-calculated)量。
[0086]樣本
[0087]推薦的樣品是0.3-0.SmL血清或血漿。使用含有分離膠的標(biāo)準(zhǔn)取樣管收集了血清。應(yīng)當(dāng)在收集的I小時(shí)內(nèi)使血清/血漿與細(xì)胞分離，將其轉(zhuǎn)移至塑料轉(zhuǎn)運(yùn)管。血清和血漿應(yīng)當(dāng)被存儲于_20°C下直至使用。[0088]設(shè)各和材料
[0089]使用下列供給和設(shè)備。
[0090]手動移液器w/尖頭汸類容量移液管和燒瓶；各種玻璃試劑瓶；石蠟封口膜(Fisher Healthcare) ；Easy Pierce 熱封箱(Fisher Healthcare);多管潤旋器(Mult1-Tube Vortex) (Fisher Scientific) ；Turbovap 板蒸發(fā)器(Turbovap PlateEvaporator) (Biotage, LLC) ;Thermo 手動熱封機(jī) ALPS25 或等同物(Thermo Scientific)；96 孔聚丙烯深孔板(SPEware Corp.) ;96 孔 SLE+400 板(Biotage, LLC) ；Agilent ZorbaxXDB C-182.1X50，5um(KrackeIer Scientific)；和 VacMaster-96 樣品加工歧管系統(tǒng)(Biotage, LLC) 0
[0091]96孔板5804R離心機(jī)或等同物(Eppendorf) ；API5000串聯(lián)質(zhì)譜儀和用APCI的Turbo Vtm 離子源(Sciex，Toronto, Canada);由 8 個(gè) 1200SL 系列二兀泵和 4 個(gè) 1200 系列真空脫氣器組成的 Aria Transcend TX4 系統(tǒng)(Thermo-Fisher，MA，USA) ；HTS Twin PAL 系統(tǒng)自動米樣器(CTC Analytics AG, Switzerland) ;Analystl.4 版或更高版本(AppliedBiosystems, CA, USA) ；Aria OSl.6 版或更高版本(Thermo-Fisher, MAj USA) 0
[0092]試逝
[0093]使用了下列試劑:
[0094]辜麗(USP);[13C3]_ 辜麗(Isosciences);亞甲基氣(Fisher Healthcare);己焼(Fisher Healthcare);甲醇(Fisher Healthcare);活性炭處理的人血清(Golden West)；混合血清(內(nèi)部收集)；乙醇(Sigma-Aldrich)；甲酸(Sigma-Aldrich);乙腈(FisherHealthcare)。
[0095]將下列溶劑用作用于液相色譜的流動相:
[0096]萃取溶劑(50:50己烷:亞甲基氯):在刻度量筒中稱量500mL己烷，轉(zhuǎn)移至IL的瓶中。單獨(dú)地在刻度量筒中稱量500mL亞甲基氯，將其添加至IL含有己烷的瓶中。充分混
口 O
[0097]洗脫泵A流動相(Millipore H2O中0.1%的甲酸):稱量9"mL的I型Millipore水，將其傾倒入IL試劑瓶中。在通風(fēng)廚中，向MilliporeH2O中緩慢地添加ImL甲酸。充分混合。
[0098]洗脫泵B流動相(乙腈中0.1%的甲酸):稱量999mL的乙腈，將其傾倒入IL的試劑瓶中。在通風(fēng)廚中，向乙腈中緩慢地添加ImL甲酸。充分混合。
[0099]內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)儲液(lmg/mL):稱取約10mg[13C3]_睪酮至分析天平上的玻璃閃爍瓶中。在就純度進(jìn)行調(diào)整后，添加適當(dāng)量的甲醇以使溶液達(dá)到lmg/mL的終濃度。充分混合以溶解。存儲在_20°C ;在玻璃閃爍瓶中穩(wěn)定至少I年。
[0100]內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)儲液(10000ng/mL):將ImL[13C3]-睪酮內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)儲液(lmg/mL)添加至IOOmL A類容量瓶中，用MeOH補(bǔ)足體積。充分混合。終濃度為10000ng/dL。冷凍貯存(-20 0C );穩(wěn)定至少一年。
[0101]工作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液(120ng/dL):將0.12mL[13C3]_睪酮內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)儲液(IOOOOng/mL)添加至IOOOmL A類容量瓶，利用50:50Me0H:Millipore H2O補(bǔ)足體積。充分混合。終濃度為120ng/dL?？梢砸韵嗤臐舛群徒M成制備備選的體積。冷藏貯存(2-8°C)。
[0102]重構(gòu)溶液(1:1甲醇:水):將500mL的HPLC級甲醇添加至I升玻璃試劑瓶。將500mL的I型水添加至相同的瓶中。充分混合并存儲于室溫。
[0103]睪酮系統(tǒng)適用性測試溶液(SST):注射35 ii L的工作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液(120ng/dL)以在使批次經(jīng)受分析之前建立系統(tǒng)適用性。系統(tǒng)適用性注射采用35yL的、50:50甲醇:水中的120ng/dL[13C3]_睪酮的注射；接受標(biāo)準(zhǔn):所有分析物0.05-0.30分鐘；對于292/100轉(zhuǎn)換(transition)峰強(qiáng)度> 12000cps。
[0104]針洗滌液UMillipore H2O中0.1%的甲酸):稱量999mL的I型Millipore水，將其傾倒入IL試劑瓶中。在通風(fēng)廚中，將ImL甲酸緩慢地添加至Millipore H2O中。充分混
入
口 o
[0105]針洗滌液2 (甲醇):將IOOOmL甲醇轉(zhuǎn)移至玻璃瓶。于室溫下貯存。
[0106]柃準(zhǔn)
[0107]制備校準(zhǔn)器,在Esoterix Endocrinology, Calabasas, CA, USA 測試準(zhǔn)確性。將散裝材料(bulk material)在干冰上運(yùn)送至CET，隨后在CET中將其亞等分和貯存。將亞等分于-20°C貯存5.58年。
[0108]在每一個(gè)分析批次開始時(shí)包括全套校準(zhǔn)器。添加額外的空白+IS、LLOQ和ULOQ作為每一個(gè)批次的最后3個(gè)樣品。
[0109]質(zhì)量控制
[0110]制備質(zhì)量控制樣品,在Esoterix Endocrinology, Calabasas CA, USA 進(jìn)行測試其以建立范圍。將散裝材料在干冰上運(yùn)送至CET，隨后在CET中將其亞等分和貯存。將亞等分于-20°C貯存5.58年。
[0111]手動方法
[0112]準(zhǔn)備批次:解凍及混合標(biāo)準(zhǔn)、樣品和對照。對于每一種樣品、對照和標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記一套12x75mm的玻璃測試管。
[0113]移取樣品:將200 ii L的空白、標(biāo)準(zhǔn)、對照和樣品移液至適當(dāng)標(biāo)記的管內(nèi)。將200 ii L工作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液移液至除雙空白之外的每一個(gè)管內(nèi)。雙空白接受400 ii L Millipore水。在多管渦旋器上將架上的管混合I分鐘。
[0114]轉(zhuǎn)移至96孔板:將96孔深孔板置于VacMaster-96樣品處理歧管的下半部分。替換深孔板上方的歧管的頂部，將SLE+400板置于歧管的頂部以便所述孔與下方的深孔收集板對齊。使用多通道移液器或等同物將所有樣品轉(zhuǎn)移至SLE+40096-孔板。
[0115]SLE萃取:將歧管(含有板)置于通風(fēng)廚下，并將管道連接至真空源。應(yīng)用輕微真空(5mmHg)將樣品抽入SLE+板，隨后等待5_10分鐘。使用12-通道移液器(或等同物)抽吸，將50:50己烷:亞甲基氯分配3次。隨后在每一行中添加900 ii L的萃取溶劑。應(yīng)用輕微真空15-20秒，隨后等待10分鐘以允許萃取溶劑通過深孔板。10分鐘后，應(yīng)用高真空壓力30秒以將剩余的萃取溶劑排入96孔收集板中。
[0116]蒸發(fā)/重構(gòu):將96孔收集板置于Turbovap板蒸發(fā)器內(nèi)。在約40psi和40°C下蒸發(fā)板約20分鐘或直至干燥。用IOOii L的重構(gòu)溶液(l:lMeOH:Millipore H2O)重構(gòu)每一個(gè)孔。密封板，短暫混合I分鐘。離心5分鐘。
[0117]LC:填充所有LC系統(tǒng)試劑。準(zhǔn)備好LC泵以從流動相管道除去任何氣泡或從先前的測定/批次除去流動相(如果產(chǎn)生了新的流動相)。當(dāng)所有系統(tǒng)和自動采樣器都準(zhǔn)備好時(shí)，點(diǎn)擊“起動”。注射35 u L的樣品。[0118]自動化稈序
[0119]準(zhǔn)備批次(Prepare batch):解凍及混合標(biāo)準(zhǔn)、樣品和對照。如標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行程序N0QS-S0P-13，第10部分-程序中所建議的，初始化TECAN Freedom EVO儀。
[0120]移取樣品；將計(jì)算機(jī)/實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的條形碼標(biāo)簽置于相應(yīng)的空白、標(biāo)準(zhǔn)和QC管上。在空的來源架中，以下列順序放置條形碼標(biāo)記的試管:雙空白、空白+IS、標(biāo)準(zhǔn)1-8和雙空白。從來源架I的位置12開始直至來源架12添加患者樣品。在整個(gè)測定中隨機(jī)放置兩
(2)組質(zhì)量控制樣品。注意:只有大小為12x75mm的管才可被用作患者樣品的來源管。必需將除該尺寸外的轉(zhuǎn)移管倒出至正確的管尺寸中并且相應(yīng)地標(biāo)上條形碼。將來源架加載至TECAN Freedom EVO 平臺上。
[0121]轉(zhuǎn)移至96孔板:將96深孔板置于平臺上。將8個(gè)16x100mm玻璃試管置于空來源架的位置1-8中，用工作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液填充每一個(gè)試管。將一個(gè)16x100mm測試玻璃試管置于相同來源架的位置16作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)試管，用I型水填充。將含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)和I型水的來源架置于平臺上的適當(dāng)位置中。確保IOOOii L DiTi尖頭被加載在TECAN Freedom EVO平臺上。
[0122]在應(yīng)用軟件中，選擇睪酮腳本(Testosterone script)。點(diǎn)擊運(yùn)行以開始編寫(script)。TECAN將首先掃描所有的試管，產(chǎn)生scan, csv文件。當(dāng)提示時(shí)，檢查所產(chǎn)生的文件并且修正任何條形碼相關(guān)問題。隨后點(diǎn)擊OK以繼續(xù)編寫。TECAN現(xiàn)將向96深孔板中添加200y L空白、標(biāo)準(zhǔn)、患者樣品和質(zhì)量控制樣品。當(dāng)提示時(shí)，目測確認(rèn)所有樣品已被正確地移液。如果未添加樣品，可利用適當(dāng)?shù)囊埔浩魇謩犹砑訕悠?。?yīng)當(dāng)在批次封面上進(jìn)行注釋。如果任何樣品體積表現(xiàn)出不與其它樣品一致，則應(yīng)當(dāng)在分批封面上進(jìn)行注釋。點(diǎn)擊OK以繼續(xù)進(jìn)行。
[0123]TECAN將把200 y L I型水添加至第一 96深孔板的小瓶位置Al，將200 u L的工作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至其余的小瓶位置。當(dāng)將內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)添加至96深孔板中時(shí)，初始化BIOMEKFX液體處理器。從TECAN Freedom EVO自動化移液器取出96深孔板，將其置于BIOMEK FX自動化液體處理器上。
[0124]SLE萃取:將SLE+板置于96深孔板的頂部，將其置于BIOMEK FX平臺上。確保AP200移液器尖頭被加載在適當(dāng)?shù)奈恢弥?。在?yīng)用軟件中，取決于測定中樣品的數(shù)目而選擇I板SLE轉(zhuǎn)移或2板SLE轉(zhuǎn)移腳本。點(diǎn)擊頂部工具條中的綠色開始按鈕。BIOMEK FX將首先混合樣品與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，然后在兩步驟過程中將96深孔板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至SLE+板。如果樣品未被BIOMEK轉(zhuǎn)移，則可允許手動進(jìn)行該轉(zhuǎn)移，同時(shí)小心地將樣品轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)目住?br> [0125]將96孔深孔板置于VacMaster-96樣品處理歧管的下半部分中。替換深孔板上方的歧管的頂部部分，將SLE+400板置于歧管的頂部以便孔與下面的深孔收集板對齊。將歧管(含有板)置于通風(fēng)廚下，并將管連接至真空源。應(yīng)用輕微真空(5mm Hg)將樣品抽入SLE+板，隨后等待5-10分鐘。
[0126]使用12-通道移液器(或等同物)抽吸，將50:50己烷:亞甲基氯分配3次。隨后在每一行中添加900 UL的萃取溶劑。應(yīng)用輕微真空15-20秒，隨后等待10分鐘以允許萃取溶劑通過至深孔板。10分鐘后，應(yīng)用高真空壓力30秒以將剩余的萃取溶劑排入深孔收集板中。
[0127]蒸發(fā)/重構(gòu):將96孔收集板置于Turbovap板蒸發(fā)器內(nèi)。在約40psi和40°C下蒸發(fā)板約20分鐘或直至干燥。用IOOii L的重構(gòu)溶液(l:lMeOH:Millipore H2O)重構(gòu)每一個(gè)孔。密封板，短暫混合I分鐘。離心5分鐘。
[0128]LC:填充所有的LC系統(tǒng)試劑。準(zhǔn)備LC泵以從流動相管道除去任何氣泡或從先前的測定/批次除去流動相(如果產(chǎn)生了新的流動相)。當(dāng)所有系統(tǒng)和自動采樣器都準(zhǔn)備好時(shí)，點(diǎn)擊“開始”。注射35 u L的樣品。
[0129]報(bào)告結(jié)果
[0130]用于血清和血漿中的該測定的單位為納克/分升(ng/dL)。
[0131 ] 對于血清和血漿樣品，將結(jié)果報(bào)告為一個(gè)小數(shù)位。
[0132]該測定的定量下限是2.5ng/dL。低于2.5ng/dL的值將被報(bào)告為〈2.5ng/dL。檢測上限是5000ng/dL。高于5000ng/dL的值將用I型水稀釋直至50倍。包括稀釋在內(nèi)，定量的上限可為250000ng/dL。如果不可獲得足夠的樣品來重復(fù)稀釋，則將輸入>10000并伴以縮寫“QNSR”。該縮寫指出沒有充足的樣本來驗(yàn)證結(jié)果的說明。
[0133]臨時(shí)參照間隔
[0134]
【權(quán)利要求】
1.一種用于測定睪酮在樣品中的存在或量的方法，所述方法包括: (a)提供包含辜麗的樣品； (b)使用支撐液萃取部分純化所述樣品，從而提供部分純化的包含睪酮的樣品； (C)使用液相色譜法將睪酮與所述部分純化的樣品中的其它組分色譜分離；和 (d)通過質(zhì)譜法分析所述色譜分離的睪酮以測定睪酮在所述樣品中的存在或量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述部分純化步驟(b)包括除去干擾通過質(zhì)譜來分析睪酮的組分。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述干擾通過質(zhì)譜法來分析睪酮的組分包括如下的一種或多種:可的松、皮質(zhì)醇、21-去氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、11-去氧皮質(zhì)醇、曲安奈德、四氫皮質(zhì)醇、四氫-可的松、DHEA> 17a-輕孕酮、表睪酮、二氫雄酮、5a_雄燒-3a-醇_17_酮、5b_孕燒 _3a_17a_20a_ 二醇、etiocolan-3a— 二醇或孕二醇。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述部分純化步驟(b)包括使用利用硅藻土和與水不混溶的有機(jī)溶劑系統(tǒng)的支撐液萃取。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述與水不混溶的有機(jī)溶劑系統(tǒng)包括:乙酸乙酯、己烷、甲苯、辛醇、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、環(huán)己烷、戊烷、N-庚烷、苯、正-丁基氯、丁醇、亞甲基氯或上述的任意兩種或更多種的混合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述與水不混溶的有機(jī)溶劑系統(tǒng)還包括一定量的極性溶齊U，其中所述極性溶劑是甲醇、丙酮、乙腈、異丙醇、二乙醚或甲基-叔-丁醚。
7.權(quán)利要求1的方法，其中以自動化方式進(jìn)行所述部分純化步驟(b)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中手動地進(jìn)行所述部分純化步驟(b)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中使用液相色譜包括使用分析液相色譜。
10.權(quán)利要求9的方法，其中使用分析液相色譜包括使用反相柱。
11.權(quán)利要求9的方法，其中使用液相色譜包括使用至少一個(gè)柱子。
12.權(quán)利要求11的方法，其中使用液相色譜包括平行使用兩個(gè)或更多個(gè)液相色譜柱，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)液相色譜柱被內(nèi)聯(lián)至單個(gè)質(zhì)譜儀。
13.權(quán)利要求12的方法，其中平行使用兩個(gè)或更多個(gè)液相色譜柱包括將部分純化的樣品在交錯(cuò)的時(shí)間引入所述兩個(gè)或更多個(gè)液相色譜柱。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析步驟(d)包括使用電離技術(shù)電離睪酮，所述電離技術(shù)選自:電噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離和大氣壓光電離。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析步驟(d)包括使用四極質(zhì)譜儀檢測睪酮。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述四極質(zhì)譜儀是三重四極質(zhì)譜儀。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述分析步驟(d)包括:在第一四極中檢測完整的睪酮離子；在第二四極中片段化完整的睪酮離子以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)睪酮片段離子；和在第三四極中檢測一個(gè)或多個(gè)睪酮片段離子。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析步驟(d)包括測定樣品中睪酮的量。
19.權(quán)利要求1的方法,其中所述樣品包含內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的睪酮。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是13C-標(biāo)記的睪酮。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是2，3，4-13C-標(biāo)記的睪酮。
23.一種用于測定樣品中睪酮的量的方法，所述方法包括: (a)提供樣品，所述樣品包括含有睪酮的樣品； (b)使用支撐液萃取來部分純化所述樣品，從而提供含有睪酮的部分純化的樣品； (C)使用反相液相色譜來將睪酮與部分純化的樣品中的其它組分色譜分離；和 (d)通過質(zhì)譜法分析所述色譜分離的睪酮以測定樣品中睪酮的量。
24.一種產(chǎn)生用于診斷與異常睪酮水平相關(guān)的疾病或病況的報(bào)告的方法，所述方法包括: (a)提供樣品，所述樣品包括含有睪酮的樣品； (b)使用支撐液萃取部分純化所述樣品以提供含有睪酮的部分純化的樣品； (C)使用液相色譜將睪酮與所述部分純化的樣品中的其它組分色譜分離； (d)通過質(zhì)譜法分析所述色譜分離的睪酮以測定樣品中睪酮的量；和 (e)產(chǎn)生陳述所述樣品中睪酮的濃度的報(bào)告。
25.一種用于測定睪酮在樣品中的存在或量的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括: (a)用于使用支撐液萃取部分純化樣品的工作站，所述樣品包含睪酮； (b)用于使用液相色譜 將睪酮與所述部分純化的樣品中的其它組分色譜分離的工作站；和 (C)用于通過質(zhì)譜法分析所述色譜分離的睪酮以確定睪酮在樣品中的存在或量的工作站。
【文檔編號】G01N30/02GK103443621SQ201280013364
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月7日
【發(fā)明者】R·P·格蘭特, M·克勞福德, D·W·錢德勒, W·柯廷 申請人:美國控股實(shí)驗(yàn)室公司