利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種在使用了共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測(cè)量的掃描分子計(jì)數(shù)法中容易地設(shè)定用于去除噪聲的基準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的對(duì)樣本溶液中的發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)的光分析技術(shù)的特征在于，通過(guò)變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路，生成一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測(cè)出的來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中個(gè)別地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)。在發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)中，抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。
【專利說(shuō)明】利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種光分析技術(shù)，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測(cè)來(lái)自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對(duì)象物、或非生物學(xué)粒子的光，來(lái)獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時(shí)有用的信息，更詳細(xì)地說(shuō)，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)個(gè)別檢測(cè)來(lái)自單個(gè)發(fā)光的粒子的光并進(jìn)行各種光分析的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序。此外，在本說(shuō)明書(shū)中，發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)可以是其自身發(fā)光的粒子、或附加了任意的發(fā)光標(biāo)識(shí)或發(fā)光探針的粒子，從發(fā)光粒子發(fā)出的光可以是熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、散射光等。
【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來(lái)的光測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)量單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的測(cè)量技術(shù)對(duì)生物體分子等的特性、分子間相互作用或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的裝置或方法。例如，在熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn) 1-3、非專利文獻(xiàn)1-3)中，利用激光共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量來(lái)自出入樣本溶液中的微小區(qū)域(被稱為顯微鏡的激光會(huì)聚到的焦點(diǎn)區(qū)域-共焦區(qū)組織)內(nèi)的熒光分子或被熒光標(biāo)識(shí)的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)由測(cè)量得到的該熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值所確定的在微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)和滯留分子的個(gè)數(shù)的平均值，獲取熒光分子等的運(yùn)動(dòng)的速度或大小、濃度之類的信息，或檢測(cè)分子的構(gòu)造或大小的變化、分子的結(jié)合/離解反應(yīng)或分散/聚合之類的各種現(xiàn)象。另外，在熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn) 4、非專利文獻(xiàn)4)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)中，生成與FCS同樣地測(cè)量出的出入共焦區(qū)組織內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，使統(tǒng)計(jì)性的模型公式擬合該直方圖的分布，由此估算熒光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區(qū)組織內(nèi)的分子的個(gè)數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息估計(jì)分子的構(gòu)造或大小的變化、結(jié)合/離解狀態(tài)、分散/聚合狀態(tài)等。另外，除此以外，在專利文獻(xiàn)6、7中，提出了根據(jù)利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)量出的樣本溶液的熒光信號(hào)的時(shí)間經(jīng)過(guò)來(lái)檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)8提出了一種信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)，其用于使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量來(lái)自流通于流式細(xì)胞儀的熒光微粒子或固定在基板上的熒光微粒子的微弱光，來(lái)檢測(cè)流體中或基板上的熒光微粒子的存在。
[0003]特別是，根據(jù)FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行微小區(qū)域的熒光測(cè)量的技術(shù)的方法，進(jìn)行測(cè)量所需要的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測(cè)量中使用的量至多為幾十yL左右)，測(cè)量時(shí)間也大幅縮短(在一次測(cè)量中反復(fù)多次進(jìn)行秒級(jí)時(shí)間的測(cè)量。)。因而，期待這些技術(shù)特別是在對(duì)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等檢測(cè)體數(shù)多的情況下，成為與以前的生物化學(xué)方法相比能夠廉價(jià)或迅速地執(zhí)行實(shí)驗(yàn)或檢查的強(qiáng)力工具。
[0004]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2005-098876
[0005]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-292371
[0006]專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2009-281831
[0007]專利文獻(xiàn)4:日本專利第4023523號(hào)
[0008]專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)2008-080417
[0009]專利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2007-20565
[0010]專利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)2008-116440
[0011]專利文獻(xiàn)8:日本特開(kāi)平4-337446號(hào)公報(bào)
[0012]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝，蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438頁(yè)1999年
[0013]非專利文獻(xiàn)2:F.J.Meyer-Alms,突光相關(guān)譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 編,Springer,柏林,2000 年,204-224 頁(yè)
[0014]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子及其他4名，遺傳醫(yī)學(xué)，Vol.6，N0.2，271-277頁(yè)
[0015]非專利文獻(xiàn)4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美國(guó)科學(xué)學(xué)院紀(jì)要，1999年，96卷，13756-13761 頁(yè)(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的光學(xué)分析技術(shù)中，所測(cè)量的光是從熒光單分子或多分子發(fā)出的光，但在該光的分析中，執(zhí)行時(shí)序地測(cè)量出的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的自相關(guān)函數(shù)的運(yùn)算或?qū)χ狈綀D擬合之類的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)性的處理，并非個(gè)別地參照或分析來(lái)自各個(gè)熒光分子等的光的信號(hào)。即，在這些光分析技術(shù)中，對(duì)來(lái)自多個(gè)熒光分子等的光的信號(hào)統(tǒng)計(jì)性地進(jìn)行處理，針對(duì)熒光分子等檢測(cè)統(tǒng)計(jì)平均性的特性。因而，為了在這些光分析技術(shù)中得到統(tǒng)計(jì)上有意義的結(jié)果，需要樣本溶液中的作為觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度在平衡狀態(tài)下為在一次的秒級(jí)長(zhǎng)度的測(cè)量時(shí)間內(nèi)能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性的處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)的水平，優(yōu)選的是在微小區(qū)域內(nèi)始終存在一個(gè)左右的熒光分子等的水平。實(shí)際上，共焦區(qū)組織的體積為IfL左右，因此，在上述的光分析技術(shù)中使用的樣本溶液中的熒光分子等的濃度典型的是InM左右或其以上，在大幅低于InM時(shí)，產(chǎn)生在共焦區(qū)組織內(nèi)不存在熒光分子等的時(shí)間而無(wú)法得到統(tǒng)計(jì)上有意義的分析結(jié)果。另一方面，在專利文獻(xiàn)6?8所記載的熒光分子等的檢測(cè)方法中，不包括熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，即使樣本溶液中的熒光分子等小于InM也能夠檢測(cè)熒光分子等，但無(wú)法定量地計(jì)算在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的熒光分子等的濃度或數(shù)密度。
[0018]因此，本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技術(shù)，能夠定量地觀測(cè)作為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度低于利用FCS、FIDA等包含統(tǒng)計(jì)性處理的光分析技術(shù)進(jìn)行處理的水平的樣本溶液中的發(fā)光粒子的狀態(tài)或特性。在所述新的光分析技術(shù)中，如果清楚地進(jìn)行描述，則與FCS、FIDA等同樣地，在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的情況下，一邊使作為光的檢測(cè)區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測(cè)區(qū)域”)的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊在光檢測(cè)區(qū)域包含在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)檢測(cè)從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐個(gè)地進(jìn)行個(gè)別檢測(cè)，來(lái)獲取與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。根據(jù)該新的光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計(jì)數(shù)法”)，與FCS、FIDA等光分析技術(shù)同樣地，進(jìn)行測(cè)量所需要的樣本可以是微量的(例如幾十μ L左右)，另外，測(cè)量時(shí)間短，并且與FCS、FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，能夠檢測(cè)更低的濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子的存在，并定量地檢測(cè)其濃度、數(shù)密度或其它特性。
[0019]在上述的掃描分子計(jì)數(shù)法中，在一邊在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置一邊測(cè)量出的光強(qiáng)度值(或者光子計(jì)數(shù)值)的按時(shí)間序列的數(shù)據(jù)中觀測(cè)到相當(dāng)于來(lái)自發(fā)光粒子的光的光強(qiáng)度的增大(典型的是吊鐘狀的輪廓)時(shí)，判斷為一個(gè)發(fā)光粒子包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，由此進(jìn)行一個(gè)發(fā)光粒子存在的檢測(cè)。在該結(jié)構(gòu)中，在實(shí)際的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，除了存在來(lái)自發(fā)光粒子的光以外，還存在噪聲(光檢測(cè)器的熱噪聲、背景光)，因此需要去除噪聲來(lái)檢測(cè)表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)(發(fā)光粒子的信號(hào))的存在。因此，典型的是，參照發(fā)光粒子的信號(hào)的特性、例如強(qiáng)度的大小、信號(hào)的形狀等嘗試抽出發(fā)光粒子的信號(hào)。關(guān)于該點(diǎn)，發(fā)光粒子的信號(hào)的特性、噪聲的大小或形狀根據(jù)測(cè)量條件(裝置和光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)、環(huán)境溫度、發(fā)光粒子的發(fā)光特性、樣本溶液的狀態(tài))的不同而不同，并且從發(fā)光粒子的信號(hào)中去除噪聲的明確的基準(zhǔn)并不是顯而易見(jiàn)的。因而，典型的是，按每個(gè)測(cè)量條件針對(duì)包含作為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子或與其同等的粒子的對(duì)稱溶液(正控制)和不包含作為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子或與其同等的粒子的對(duì)稱溶液(負(fù)控制)獲取時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，將在這些時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中觀測(cè)到的光強(qiáng)度值進(jìn)行比較并且通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行用于去除噪聲的基準(zhǔn)的設(shè)定。然而，用于去除噪聲的基準(zhǔn)的設(shè)定中的反復(fù)試驗(yàn)對(duì)于分析的實(shí)施者來(lái)說(shuō)是繁雜且需要時(shí)間和勞力的作業(yè)。
[0020]這樣，本發(fā)明的一個(gè)課題在于提出一種在如上所述的掃描分子計(jì)數(shù)法中容易地設(shè)定用于去除噪聲且檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的基準(zhǔn)或指標(biāo)的新方法。
[0021]關(guān)于該點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了如下情況:根據(jù)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法在某測(cè)量條件下使用任意的樣本溶液得到的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光強(qiáng)度的發(fā)生頻率的分布(更詳細(xì)地說(shuō)，以在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量，具有該變量以上的強(qiáng)度的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值分布)，能夠去除噪聲信號(hào)而容易地決定用于檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的基準(zhǔn)。
[0022]如后面更詳細(xì)地記述的那樣，從“掃描分子計(jì)數(shù)法”利用的共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)區(qū)域、即“光檢測(cè)區(qū)域”中的單個(gè)發(fā)光粒子釋放并到達(dá)檢測(cè)器的光的強(qiáng)度根據(jù)發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的不同而不同，典型的是，在發(fā)光粒子的位置處于光檢測(cè)區(qū)域的大致中心區(qū)域時(shí)光強(qiáng)度最大(以下將光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的光強(qiáng)度最大的位置稱為“最大強(qiáng)度點(diǎn)”。)，發(fā)光粒子的位置越靠近光檢測(cè)區(qū)域的周邊，光強(qiáng)度越是逐漸下降。即，在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)從發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光強(qiáng)度的分布為具有強(qiáng)度從最大強(qiáng)度點(diǎn)朝向周邊下降的大致吊鐘狀的輪廓的分布。而且，認(rèn)為發(fā)光粒子在包含光檢測(cè)區(qū)域的樣本溶液中大致均勻地分散，因此發(fā)光粒子的信號(hào)的光強(qiáng)度的發(fā)生頻率的分布由從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布、即從光檢測(cè)區(qū)域到達(dá)光檢測(cè)器的光的強(qiáng)度分布決定。另一方面，噪聲隨機(jī)地產(chǎn)生，噪聲的強(qiáng)度分布對(duì)于從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布沒(méi)有依賴性。因而，能夠認(rèn)為在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光強(qiáng)度的發(fā)生頻率的分布中，提供與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布對(duì)應(yīng)的成分的信號(hào)是“發(fā)光粒子的信號(hào)”，提供除此以外的成分的信號(hào)是“噪聲”。這樣，能夠以在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上檢測(cè)出的信號(hào)是否為與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布對(duì)應(yīng)的成分為基準(zhǔn)，在去除噪聲信號(hào)的狀態(tài)下檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)。
[0023]在本發(fā)明中，利用上述的知識(shí)，提出了在掃描分子計(jì)數(shù)法中在去除了噪聲信號(hào)的狀態(tài)下容易地決定用于檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的基準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)。
[0024]用于解決問(wèn)題的方案
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方式，通過(guò)下述裝置來(lái)達(dá)成上述課題，該裝置是使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光的光分析裝置，該光分析裝置的特征在于，包括:光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過(guò)變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；光檢測(cè)部，其檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光；以及信號(hào)處理部，其生成一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由光檢測(cè)部檢測(cè)出的來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，其中，信號(hào)處理部從在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)，由此檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。在所述結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發(fā)出光的粒子，如果是不固定在基板等上而自由地在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的粒子。所述發(fā)光粒子典型的是熒光性粒子，但也可以是通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等來(lái)發(fā)出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域，從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會(huì)聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地由物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來(lái)確定。在發(fā)光粒子是沒(méi)有照明光而發(fā)光的情況下，例如是通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光來(lái)發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。)。此外，在本說(shuō)明書(shū)中，在稱為“發(fā)光粒子的信號(hào)”的情況下，只要沒(méi)有特別限定，是指表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
[0026]如從上述理解的那樣，在作為本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)的掃描分子計(jì)數(shù)法中，首先，一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊逐次進(jìn)行光的檢測(cè)。這樣，可以期待在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)檢測(cè)到來(lái)自發(fā)光粒子的光，由此檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子的存在。因而，在逐次檢測(cè)出的光中個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)，由此逐個(gè)地個(gè)別且逐次檢測(cè)粒子的存在，能夠獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。此時(shí)，在本發(fā)明中，根據(jù)上面記述的知識(shí)、即通過(guò)參照時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光強(qiáng)度的發(fā)生頻率的分布容易檢測(cè)去除了噪聲信號(hào)后的發(fā)光粒子的信號(hào)的知識(shí)，根據(jù)“信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布”、即以在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量、具有該變量以上的強(qiáng)度的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值分布，設(shè)定應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍。然后，從在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中去除噪聲并抽出具有上述光強(qiáng)度范圍內(nèi)的光強(qiáng)度的信號(hào)，由此檢測(cè)出來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)。
[0027]此外，如從后面的【具體實(shí)施方式】一欄的說(shuō)明中理解的那樣，認(rèn)為能夠根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布來(lái)估計(jì)針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度的分布，發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度按照從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度的分布。因而，應(yīng)該作為上述的發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍可以優(yōu)選為根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的信號(hào)的強(qiáng)度的分布與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布實(shí)質(zhì)一致的光強(qiáng)度范圍。(在此，“實(shí)質(zhì)一致”的意思是允許在被容許的誤差范圍內(nèi)的偏差。)
[0028]另外，如已經(jīng)記述的那樣，典型的是，認(rèn)為從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布是發(fā)光粒子的位置從最大強(qiáng)度點(diǎn)起越向光檢測(cè)區(qū)域的周邊靠近光強(qiáng)度越下降的具有吊鐘狀的輪廓的分布，發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度的分布也具有相同的吊鐘狀的輪廓。(特別地，發(fā)光粒子是通過(guò)被照射激勵(lì)光而釋放光的粒子，在通過(guò)激勵(lì)光的聚光區(qū)域劃定光檢測(cè)區(qū)域的情況下，從光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布與光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的激勵(lì)光的強(qiáng)度分布一致。)。而且，能夠?qū)嶋H觀測(cè)到的發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度大于噪聲的強(qiáng)度(在發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度分布的吊鐘狀的輪廓被埋沒(méi)于噪聲強(qiáng)度的情況下，原本就無(wú)法觀測(cè)到發(fā)光粒子的信號(hào)。)。這樣，在上述的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中，也可以形成為信號(hào)處理部將根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍的邊界設(shè)定為閾值，抽出強(qiáng)度超過(guò)該閾值的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)。所述的閾值可以優(yōu)選被設(shè)定為按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的噪聲強(qiáng)度的上限值。
[0029]在上述的本發(fā)明的裝置中的應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍的設(shè)定中，更詳細(xì)地說(shuō)，例如可以在決定了根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布之后，使高斯函數(shù)、洛倫茲函數(shù)等吊鐘型函數(shù)與針對(duì)所述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布擬合。在此，“光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值”例如可以是光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的從最大強(qiáng)度點(diǎn)起的半徑或其函數(shù)值(如后述的【具體實(shí)施方式】一欄中說(shuō)明的那樣，以按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的發(fā)光粒子的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值能夠表示為光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置、例如從最大強(qiáng)度點(diǎn)起的半徑的函數(shù)。)。如已經(jīng)提及的那樣，從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布具有吊鐘狀的輪廓，能夠利用吊鐘型函數(shù)良好地進(jìn)行擬合。因而，在信號(hào)的強(qiáng)度分布中，利用吊鐘型函數(shù)進(jìn)行的擬合中擬合誤差大的部位或區(qū)域被認(rèn)為噪聲的影響大，這樣，應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍能夠參照上述的擬合誤差并根據(jù)所述的誤差進(jìn)行設(shè)定。
[0030]另外，如從后面的【具體實(shí)施方式】一欄的說(shuō)明中理解的那樣，當(dāng)參照根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或者信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布自身的形狀時(shí)，也能夠判斷這些分布的形狀中的、與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布的吊鐘狀的輪廓存在偏差的區(qū)域。因而，應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍也可以根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或者根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布自身的形狀進(jìn)行設(shè)定。并且，根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的斜率，也能夠判斷基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的、與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布的吊鐘狀的輪廓存在偏差的區(qū)域。因而，應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍也可以根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的斜率來(lái)設(shè)定。
[0031]并且，在上述的本發(fā)明的裝置中，為使裝置的使用者能夠容易地掌握信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布和/或根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布，信號(hào)處理部可以具有顯示部，該顯示部能夠顯示根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布和/或信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布。而且，可以由裝置的使用者在顯示部中顯示的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布或信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布上，設(shè)定應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，裝置的使用者能夠在視覺(jué)上確認(rèn)并設(shè)定強(qiáng)度范圍。該強(qiáng)度范圍是應(yīng)該設(shè)定為要作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍，因此光強(qiáng)度范圍設(shè)定的操作變得容易，是有利的。
[0032]在上述的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可以對(duì)信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)包含在光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。在這種情況下，通過(guò)將檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)和光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量組合，能夠得到與樣本溶液中的同定的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息。具體地說(shuō)，例如可以計(jì)算多個(gè)樣本溶液的數(shù)密度或濃度之比、或者相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比，或者使用相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比來(lái)決定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值?；蛘?，如果通過(guò)任意的方法例如以規(guī)定的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的總體積，則能夠具體地估算發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
[0033]關(guān)于上述的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)變更樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，從發(fā)光粒子檢測(cè)出的光的形態(tài)能夠根據(jù)其特性或樣本溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，從一個(gè)發(fā)光粒子獲得的光量減少，因此優(yōu)選的是適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度以能夠高精度或高靈敏度地測(cè)量來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光。
[0034]并且，關(guān)于上述的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，優(yōu)選的是將樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)所引起的粒子的平均移動(dòng)速度)高。如上述說(shuō)明的那樣，在本發(fā)明中，光檢測(cè)區(qū)域?qū)囊粋€(gè)發(fā)光粒子發(fā)出的光進(jìn)行檢測(cè)來(lái)個(gè)別檢測(cè)發(fā)光粒子。然而，發(fā)光粒子由于在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)地移動(dòng)，在多次出入光檢測(cè)區(qū)域的情況下，有可能從一個(gè)發(fā)光粒子多次檢測(cè)到(表示該發(fā)光粒子的存在的)信號(hào)，難以使檢測(cè)出的信號(hào)與一個(gè)發(fā)光粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上述那樣，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高，由此能夠使一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)一個(gè)信號(hào)。此外，擴(kuò)散移動(dòng)速度因發(fā)光粒子的不同而變化，因此如上所述，優(yōu)選的是根據(jù)發(fā)光粒子的特性(特別是擴(kuò)散系數(shù))適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0035]可以通過(guò)任意的方式進(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)的光路的變更以移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置。例如可以使用在激光掃描型光學(xué)顯微鏡中所采用的檢電鏡(Galvano-miiror)變更光路，來(lái)變更光檢測(cè)區(qū)域的位置。可以任意地設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)路徑，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。此外，在本發(fā)明中，構(gòu)成為變更光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)，由此光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)迅速，并且在樣本溶液中實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)、流體動(dòng)力的作用，因此樣本溶液中的發(fā)光粒子不會(huì)受到力學(xué)作用的影響而能夠在(沒(méi)有偽像(artifact)的狀態(tài)且)穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測(cè)量(例如在使樣本發(fā)生流動(dòng)的情況下，難以始終賦予一樣的流速，并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，另外所需要的樣本量大幅增力口，并且由于流動(dòng)所造成的流體動(dòng)力的作用而溶液中的發(fā)光粒子或其它物質(zhì)有可能發(fā)生改質(zhì)或改性。)。而且，不需要使樣本溶液流通的結(jié)構(gòu)，因此能夠與FCS、FIDA等情況同樣地以微量(I?幾十μ L左右)的樣本溶液進(jìn)行測(cè)量和分析。
[0036]在上述的本發(fā)明的裝置中一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊進(jìn)行光檢測(cè)并個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)這種特征性的光分析技術(shù)的處理通過(guò)通用的計(jì)算機(jī)也能夠?qū)崿F(xiàn)。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方式，提供一種光分析用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析用計(jì)算機(jī)程序的特征在于使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:通過(guò)變更光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；在光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，從在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)，由此檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。
[0037]在所述的計(jì)算機(jī)程序中也可以包括以下步驟:對(duì)個(gè)別地檢測(cè)出的來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，來(lái)對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；和/或根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)決定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。另外，在移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的步驟中，可以以規(guī)定的速度或比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置，可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或者樣本溶液中的數(shù)密度或濃度設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。而且，在上述的計(jì)算機(jī)程序中也可以使根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍是根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的信號(hào)的強(qiáng)度的分布與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布實(shí)質(zhì)一致的光強(qiáng)度范圍，優(yōu)選的是，在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，強(qiáng)度超過(guò)根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的閾值的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)被抽出，或者在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布決定按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的噪聲強(qiáng)度的上限。
[0038]另外，在上述的計(jì)算機(jī)程序中，應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍可以根據(jù)使吊鐘型函數(shù)與基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布擬合時(shí)的擬合誤差、根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布的形狀、或者根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的斜率來(lái)進(jìn)行設(shè)定。并且，上述的計(jì)算機(jī)程序可以包括如下步驟:將根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布和/或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布顯示在顯示裝置上，可以在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，能夠在顯示裝置上所顯示的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布或信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布上設(shè)定應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍。
[0039]并且，根據(jù)上述的本發(fā)明的裝置或計(jì)算機(jī)程序，是一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊檢測(cè)各個(gè)發(fā)光粒子的光的光分析方法，該光分析方法是通過(guò)參照信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布來(lái)實(shí)現(xiàn)執(zhí)行發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)的新方法。因而，根據(jù)本發(fā)明，提供一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析方法的特征在于，包括以下過(guò)程:通過(guò)變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊測(cè)量來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的強(qiáng)度，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上個(gè)別地檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)，其中，在個(gè)別地檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，從在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)，由此檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。
[0040]在上述的方法中也可以包括以下步驟:對(duì)來(lái)自個(gè)別地檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的過(guò)程中檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；和/或根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)，決定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。另外，可以在變更光學(xué)系統(tǒng)的光路以使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，以規(guī)定的速度或比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置，可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣本溶液中的數(shù)密度或濃度來(lái)設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡即可。而且，在上述的方法中，根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布設(shè)定的光強(qiáng)度范圍也可以是根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的信號(hào)的強(qiáng)度的分布與從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度分布實(shí)質(zhì)一致的光強(qiáng)度范圍，優(yōu)選的是，也可以在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，抽出強(qiáng)度超過(guò)根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布決定的閾值的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)，或者在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布決定上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的噪聲強(qiáng)度的上限。
[0041]另外，在上述的方法中也是，應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍可以根據(jù)使吊鐘型函數(shù)與基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布擬合時(shí)的擬合誤差、根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布的形狀、或者根據(jù)基于信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的斜率來(lái)進(jìn)行設(shè)定。并且，在根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布和/或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布顯示在任意的顯示裝置上的情況下，在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，可以能夠在顯示裝置上所顯示的針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的信號(hào)的強(qiáng)度的分布或信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布上設(shè)定應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍。
[0042]上述的本發(fā)明的光分析技術(shù)典型地用于分析或解析蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)對(duì)象物在溶液中的狀態(tài)的用途，但是也可以用于分析或解析非生物學(xué)粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、金屬膠體等)在溶液中的狀態(tài)，應(yīng)該理解這種情況也屬于本發(fā)明的范圍。
[0043]發(fā)明的效果
[0044]總的來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明的光分析技術(shù)中，在掃描分子計(jì)數(shù)法中利用通過(guò)參照時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的發(fā)生頻率的分布(信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布)能夠容易地決定噪聲的強(qiáng)度范圍的知識(shí)，大幅地降低了從時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中抽出發(fā)光粒子的信號(hào)所需要的勞力和時(shí)間。特別地，對(duì)于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的應(yīng)該作為發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍，在理論上，針對(duì)亮度相同的發(fā)光粒子(在某同一發(fā)光條件下發(fā)光強(qiáng)度實(shí)質(zhì)相等的發(fā)光粒子)是不變的，因此在通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法對(duì)亮度相同的發(fā)光粒子的各種樣本溶液進(jìn)行的測(cè)量中，只要裝置的設(shè)定條件等測(cè)量條件不變，則針對(duì)某一個(gè)樣本溶液決定的上述光強(qiáng)度范圍在針對(duì)其它的樣本溶液的測(cè)量中也能夠利用，這樣，能夠減少用于決定用于檢測(cè)去除了噪聲信號(hào)的發(fā)光粒子的信號(hào)的基準(zhǔn)的反復(fù)試驗(yàn)。而且，由于迅速地去除噪聲，因此擴(kuò)大了掃描分子計(jì)數(shù)法可利用的樣本溶液的范圍，從而能夠期待擴(kuò)大分子間相互作用的觀測(cè)以及分析等掃描分子計(jì)數(shù)法的應(yīng)用范圍。
[0045]本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)以下的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明變得清楚?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1的(A)是執(zhí)行本發(fā)明的光分析技術(shù)的光分析裝置的內(nèi)部構(gòu)造的示意圖。圖1的(B)是共焦區(qū)組織(共焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0047]圖2的(A)、(B)分別是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的光分析技術(shù)的掃描分子計(jì)數(shù)法中的光檢測(cè)的原理的示意圖和所測(cè)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。圖2的(C)是從顯微鏡的光的行進(jìn)方向觀察到的光檢測(cè)區(qū)域的截面的示意圖，圖2的(D)是在(C)的情況下測(cè)量到的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的例子的示意圖。圖2的(E)是表示針對(duì)光檢測(cè)區(qū)域的從最大強(qiáng)度點(diǎn)Imax起的放射方向位置r的發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度分布(粗實(shí)線)的圖。疊加地示意性地示出了噪聲信號(hào)(虛線)存在時(shí)的實(shí)際的信號(hào)的強(qiáng)度分布(細(xì)實(shí)線)。
[0048]圖3的(A)、(B)是以流程圖的形式表示按照本發(fā)明的方法執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法的處理步驟的圖。
[0049]圖4的(A)、(B)分別是表示在發(fā)光粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)以及在由于以比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度使樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)而發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式的模型圖。圖4的(C)是說(shuō)明按照掃描分子計(jì)數(shù)法用于根據(jù)所測(cè)量的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)的時(shí)間變化)檢測(cè)發(fā)光粒子的存在的處理步驟中的檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理過(guò)程例的圖。
[0050]圖5示出了所測(cè)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例子(直方圖表)、對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈沖存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。在圖中，附加為“噪聲”的信號(hào)作為由噪聲或異物造成的信號(hào)而被忽略。
[0051]圖6的(A)是針 對(duì)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的具有光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))I以上的強(qiáng)度的信號(hào)數(shù)Pd)的平方根p1/2繪制光強(qiáng)度I得到的圖。圖中還描繪了針對(duì)繪制點(diǎn)的擬合曲線。圖6的⑶是針對(duì)信號(hào)數(shù)P(I)的平方根P1/2繪制光強(qiáng)度I的繪制點(diǎn)的擬合曲線的誤差R2的圖，該光強(qiáng)度I是針對(duì)圖6的(A)中的具有光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))1以上的強(qiáng)度的信號(hào)數(shù)Pd)的平方根P的光強(qiáng)度I。
[0052]圖7的(A)是針對(duì)包含各種濃度的發(fā)光粒子的樣本溶液的、作為通過(guò)按照本發(fā)明的光分析技術(shù)執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法(實(shí)施例1)測(cè)量出的發(fā)光粒子的信號(hào)而被檢測(cè)出的脈沖數(shù)的圖表。用于抽出發(fā)光粒子的信號(hào)的閾值根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定為2。圖中的實(shí)線表示通過(guò)最小平方法對(duì)針對(duì)發(fā)光粒子濃度的脈沖數(shù)進(jìn)行近似的近似直線。圖7的(B)是將閾值設(shè)定為I-3時(shí)針對(duì)所設(shè)定的閾值繪制針對(duì)發(fā)光粒子濃度的脈沖數(shù)的近似直線的斜率(?)和相關(guān)系數(shù)(口)的圖。
[0053]圖8是在以往的計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的光分析技術(shù)中所得到的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子，㈧是樣本內(nèi)的粒子的濃度為能夠提供足夠的測(cè)量精度的程度的情況，⑶是樣本內(nèi)的粒子的濃度相比于⑷的情況大幅降低的情況。
[0054]附圖標(biāo)記說(shuō)明
[0055]1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ;4:準(zhǔn)直透鏡；5:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光透鏡(condenser lens) ；13:針孔；14:屏蔽濾波器；15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ；16:光檢測(cè)器；17:反射鏡偏轉(zhuǎn)器；17a:臺(tái)位置變更裝置；18:計(jì)算機(jī)。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下面，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
[0057]光分析裝置的結(jié)構(gòu)
[0058]本發(fā)明的光分析技術(shù)能夠通過(guò)如下的光分析裝置來(lái)實(shí)現(xiàn):在基本結(jié)構(gòu)中，如圖1的(A)示意性地例示那樣，組合能夠執(zhí)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器而成。參照?qǐng)D1的(A)，光分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2-17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的動(dòng)作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，在此，使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射，通過(guò)準(zhǔn)直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型的是在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9上排列有注入了 I μ L?幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中聚焦，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激勵(lì)區(qū)域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子、典型的是附加有熒光色素等發(fā)光標(biāo)識(shí)的分子，當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入到激勵(lì)區(qū)域時(shí)，在其間發(fā)光粒子被激勵(lì)而釋放出光。所釋放的光(Em)通過(guò)物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光透鏡12聚光，通過(guò)針孔13。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，針孔13配置在與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域、即激勵(lì)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)針孔13，來(lái)自焦點(diǎn)面以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域，被稱為共焦區(qū)組織。在共焦區(qū)組織中，典型的是光強(qiáng)度為以區(qū)域中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛侖茲型分布，其有效體積是以光強(qiáng)度為Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。這樣，通過(guò)了針孔13的光經(jīng)過(guò)分色鏡14a后透過(guò)屏蔽濾波器14(在此，只選擇特定波長(zhǎng)頻帶的光成分。)，被導(dǎo)入到多模光纖15，到達(dá)對(duì)應(yīng)的光檢測(cè)器16，在被轉(zhuǎn)換成按時(shí)間序列的電信號(hào)之后輸入到計(jì)算機(jī)18，以后面說(shuō)明的方式進(jìn)行用于光分析的處理。作為光檢測(cè)器16，優(yōu)選的是使用能夠在光子計(jì)數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測(cè)器，由此，能夠檢測(cè)來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光、例如來(lái)自一個(gè)或多個(gè)熒光色素分子的微弱光。在通過(guò)光子計(jì)數(shù)進(jìn)行光的檢測(cè)的情況下，以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)每個(gè)規(guī)定的單位時(shí)間(BINTIME)逐次測(cè)量來(lái)到光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)的方式執(zhí)行光強(qiáng)度的測(cè)量。因而，在這種情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0059]另外，在上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，還設(shè)置有用于變更光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)、即使焦點(diǎn)區(qū)域(即，光檢測(cè)區(qū)域)的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。作為所述的用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17。所述反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同。另外，為了實(shí)現(xiàn)所期望的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)圖案，在計(jì)算機(jī)18的控制下與光檢測(cè)器16所進(jìn)行的光檢測(cè)協(xié)調(diào)地驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17。可以從圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡(可以設(shè)為在計(jì)算機(jī)18中的程序中能夠選擇各種移動(dòng)圖案。)。此夕卜，雖然沒(méi)有圖示，但也可以通過(guò)使物鏡8上下移動(dòng)來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)。如上所述，根據(jù)不是移動(dòng)樣本溶液而是變更光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的結(jié)構(gòu)，在樣本溶液內(nèi)不會(huì)實(shí)質(zhì)地產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體動(dòng)力的作用，能夠排除力學(xué)作用對(duì)觀測(cè)對(duì)象物的影響，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的測(cè)量。
[0060]此外，作為追加的結(jié)構(gòu)，可以在顯微鏡的臺(tái)(未圖示)設(shè)置用于移動(dòng)微板9的水平方向位置以變更所觀察的皿10的臺(tái)位置變更裝置17a?？梢杂捎?jì)算機(jī)18控制臺(tái)位置變更裝置17a的動(dòng)作。
[0061]在發(fā)光粒子通過(guò)多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵(lì)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)釋放光，因此可以去除針孔13。在發(fā)光粒子通過(guò)磷光或散射而發(fā)光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在發(fā)光粒子不通過(guò)激勵(lì)光而通過(guò)化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光的情況下，可以省略用于生成激勵(lì)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。并且，可以在光分析裝置I中如圖示那樣設(shè)置多個(gè)激勵(lì)光源2，可以設(shè)為能夠根據(jù)激勵(lì)發(fā)光粒子的光的波長(zhǎng)而適當(dāng)?shù)剡x擇激勵(lì)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以具備多個(gè)光檢測(cè)器16，在樣本中包含有波長(zhǎng)不同的多種發(fā)光粒子的情況下，可以設(shè)為能夠根據(jù)波長(zhǎng)分別檢測(cè)來(lái)自它們的光。
[0062]本發(fā)明的方法的原理
[0063]如“
【發(fā)明內(nèi)容】
” 一欄所記載的那樣，在本發(fā)明的光分析技術(shù)中，如果清楚地進(jìn)行描述，則在掃描分子計(jì)數(shù)法中，嘗試參照時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光強(qiáng)度的發(fā)生頻率的分布(信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布)來(lái)去除噪聲，從而容易地決定用于檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的基準(zhǔn)。下面針對(duì)本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法和噪聲去除的原理進(jìn)行說(shuō)明。
[0064]1.掃描分子計(jì)數(shù)法的原理
[0065]FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于所需要的樣本量極少且能夠迅速地執(zhí)行檢查。然而，在FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)中，在原理上，根據(jù)熒光強(qiáng)度的波動(dòng)來(lái)估算發(fā)光粒子的濃度、特性，因此為了得到高精度的測(cè)量結(jié)果，要求如圖8的(A)示意性地描繪的那樣樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度為在測(cè)量熒光強(qiáng)度的過(guò)程中在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)始終存在一個(gè)左右的發(fā)光粒子的水平，如該圖的右側(cè)所示那樣在計(jì)量時(shí)間中始終檢測(cè)到有意義的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度低于此水平，則例如圖8的(B)所描繪的那樣在發(fā)光粒子為只是偶爾進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平的情況下，如該圖的右側(cè)所例示的那樣，只在測(cè)量時(shí)間的一部分出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度的信號(hào)(光子計(jì)數(shù))，難以估算出高精度的光強(qiáng)度的波動(dòng)。另外，與在測(cè)量中在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)始終存在一個(gè)左右的發(fā)光粒子的水平相比發(fā)光粒子的濃度大幅降低的情況下，在光強(qiáng)度的波動(dòng)的運(yùn)算中，容易受到背景的影響，為了得到足夠進(jìn)行運(yùn)算的量的有意義的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)而測(cè)量時(shí)間變長(zhǎng)。
[0066]因此，本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了基于新原理的“掃描分子計(jì)數(shù)法”，即使發(fā)光粒子的濃度低于如上所述的在FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)中要求的水平的情況下，也能夠檢測(cè)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0067]作為在掃描分子計(jì)數(shù)法中執(zhí)行的處理，如果清楚地描述，則驅(qū)動(dòng)用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來(lái)變更光路，如圖2的(A)示意性地描述的那樣，一邊使光檢測(cè)區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi)，一邊執(zhí)行光檢測(cè)。這樣，例如在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的期間(圖中為時(shí)間t0?t2)，在通過(guò)存在一個(gè)發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(tl)，從發(fā)光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度(Em)的脈沖狀的信號(hào)。這樣，執(zhí)行上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，逐個(gè)地檢測(cè)其間出現(xiàn)的如圖2的(B)所例示的脈沖狀的信號(hào)(有意義的光強(qiáng)度)，由此個(gè)別檢測(cè)發(fā)光粒子，通過(guò)對(duì)其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠獲取在所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)存在的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。在所述的掃描分子計(jì)數(shù)法的原理中，不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度的波動(dòng)計(jì)算那樣的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，而是逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，因此即使在要觀測(cè)的粒子的濃度低至通過(guò)FCS、FIDA等無(wú)法以足夠的精度進(jìn)行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0068]2.使用了信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布的用于抽出發(fā)光粒子的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍的決定
[0069]如已經(jīng)記述過(guò)的那樣，在通過(guò)上述掃描分子計(jì)數(shù)法由光檢測(cè)器16隨時(shí)間的經(jīng)過(guò)獲取到的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)(時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù))上除了發(fā)光粒子的信號(hào)以外，還存在光檢測(cè)器的熱噪聲、背景光等所引起的噪聲。因而，在檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)時(shí)，需要用于從時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中抽出發(fā)光粒子的信號(hào)的處理。作為發(fā)光粒子的信號(hào)的抽出處理，典型的是進(jìn)行如下處理:參照時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的強(qiáng)度，抽出具有進(jìn)入規(guī)定的強(qiáng)度范圍內(nèi)的強(qiáng)度的信號(hào)、更具體地說(shuō)抽出具有規(guī)定的閾值以上的或超過(guò)該閾值的強(qiáng)度的信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)。然而，以往沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在去除了噪聲的狀態(tài)下抽出發(fā)光粒子的信號(hào)的明確的基準(zhǔn)，因而，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)或裝置的使用者的經(jīng)驗(yàn)等決定上述的規(guī)定的強(qiáng)度范圍或閾值，該情形需要用于檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的勞力、時(shí)間、或者也可能成為發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果的精度變差的主要原因。
[0070]關(guān)于該點(diǎn)，如已經(jīng)提及的那樣，本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)當(dāng)參照時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布時(shí)，能夠分別估計(jì)發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度范圍和噪聲的強(qiáng)度范圍，根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布容易地決定用于抽出發(fā)光粒子的信號(hào)的上述規(guī)定的光強(qiáng)度范圍或閾值。下面，針對(duì)用于使用時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布抽出發(fā)光粒子的信號(hào)的光強(qiáng)度范圍的決定原理進(jìn)行說(shuō)明。
[0071]參照?qǐng)D2的(C)-(E)，在光檢測(cè)區(qū)域CV中，從通過(guò)此處的發(fā)光粒子釋放并到達(dá)光檢測(cè)器的光的強(qiáng)度根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域CV中的發(fā)光粒子的位置的不同而不同，即使是亮度相同的發(fā)光粒子(在同一條件下的觀測(cè)中發(fā)光強(qiáng)度實(shí)質(zhì)上相等的發(fā)光粒子)，根據(jù)發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的通過(guò)位置的不同，所檢測(cè)出的光強(qiáng)度不同。例如，在某發(fā)光粒子是被照射照明光而發(fā)光的粒子的情況下，典型地說(shuō)，照明光在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度在光檢測(cè)區(qū)域(聚光區(qū)域)的大致中心處最大，從所述的最大強(qiáng)度點(diǎn)向大致放射方向降低。因而，來(lái)自發(fā)光粒子的光的強(qiáng)度在發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域的大致中心時(shí)最大，發(fā)光粒子的位置越向光檢測(cè)區(qū)域的周邊靠近，光強(qiáng)度越是逐漸降低。即，在用距最大強(qiáng)度點(diǎn)的放射方向距離(半徑r)表示光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置時(shí)，從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度的分布如圖2的(E)中用粗實(shí)線所例示的那樣相對(duì)于從最大強(qiáng)度點(diǎn)起的半徑r成為吊鐘狀的分布。例如，即使圖2的(C)中的發(fā)光粒子α、β、Y是相同的亮度的粒子，根據(jù)各發(fā)光粒子通過(guò)的路徑的不同，所檢測(cè)出的光強(qiáng)度也互不相同，在圖中，通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的大致中心的發(fā)光粒子β的光強(qiáng)度高于發(fā)光粒子a、y的光強(qiáng)度(參照?qǐng)D2的(D))。
[0072]在從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度的分布具有如圖2的(E)中粗實(shí)線那樣的輪廓時(shí)，發(fā)光粒子大致均勻地分散在樣本溶液中，因而，認(rèn)為距最大強(qiáng)度點(diǎn)的放射方向距離越大，通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)越多，因此針對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)過(guò)程中包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)而被檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)的強(qiáng)度的頻率分布，與如圖2的(E)中粗實(shí)線那樣從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)的光的強(qiáng)度的分布對(duì)應(yīng)，成為光強(qiáng)度(圖2的(E)的縱軸)越大、頻率(橫軸)越小的分布。
[0073]更具體地說(shuō)，首先，在能夠通過(guò)洛倫茲函數(shù)對(duì)如圖2的(E)中粗實(shí)線所例示的那樣從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)到的光的強(qiáng)度分布進(jìn)行近似的情況下，對(duì)于從分布的最大強(qiáng)度點(diǎn)Imax起的半徑r處的光強(qiáng)度I，使用光強(qiáng)度分布的最大值Imax (Imax相當(dāng)于單個(gè)發(fā)光粒子的最大光強(qiáng)度。)、分布的半值半寬W、強(qiáng)度的背景Ibg,通過(guò)下式給出。
[0074][式1]
【權(quán)利要求】
1.一種使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光的光分析裝置，該光分析裝置的特征在于，包括: 光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 光檢測(cè)部，其檢測(cè)來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光；以及 信號(hào)處理部，其生成一邊使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由上述光檢測(cè)部檢測(cè)出的來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)， 其中，上述信號(hào)處理部從在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)，由此檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的上述信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部抽出強(qiáng)度超過(guò)根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的閾值的、上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)。
3..據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍是根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)上述 光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的信號(hào)的強(qiáng)度分布與從上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)到的光的強(qiáng)度分布實(shí)質(zhì)一致的光強(qiáng)度范圍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部能夠根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布來(lái)決定上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的噪聲強(qiáng)度的上限。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部具有顯示部，該顯示部能夠顯示根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布和/或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光分析裝置的使用者能夠在上述顯示部中顯示的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布上，設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 能夠根據(jù)使吊鐘型函數(shù)與基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布擬合時(shí)的擬合誤差，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 能夠根據(jù)基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布的形狀，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 能夠根據(jù)基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)上述位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的斜率，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部根據(jù)檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)決定上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
12.一種使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光的光分析方法，該光分析方法的特征在于，包括以下過(guò)程: 通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 一邊使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊測(cè)量來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光的強(qiáng)度，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上個(gè)別地檢測(cè)表示發(fā)光粒子的光的信號(hào)， 其中，在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，從在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)，由此檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的上述信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，抽出強(qiáng)度超過(guò)根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的閾值的、上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍是根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的信號(hào)的強(qiáng)度分布與從上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)到的光的強(qiáng)度分布實(shí)質(zhì)一致的光強(qiáng)度范圍。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布來(lái)決定上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的噪聲強(qiáng)度的上限。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，在顯示裝置上顯示的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布上，設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，根據(jù)使吊鐘型函數(shù)與基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布擬合時(shí)的擬合誤差，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，根據(jù)基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布的形狀，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)表示上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，根據(jù)基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)上述位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的斜率，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
20.根據(jù)權(quán)利要求12-19中的任一項(xiàng)所述的光分析方法,其特征在于， 使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求12-20中的任一項(xiàng)所述的光分析方法,其特征在于， 還包括以下過(guò)程:根據(jù)檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)決定該發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
22.一種用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光的光分析用計(jì)算機(jī)程序，該光分析用計(jì)算機(jī)程序的特征在于使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟: 通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 在上述光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的過(guò)程中檢測(cè)來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，其中，從在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的群中抽出光強(qiáng)度處于根據(jù)信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)，由此檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)，該信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布是以在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的信號(hào)的強(qiáng)度為變量而強(qiáng)度為該變量以上的上述信號(hào)的發(fā)生頻率的累加值的分布。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，抽出強(qiáng)度超過(guò)根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的閾值的、上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于，根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而設(shè)定的光強(qiáng)度范圍是根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的信號(hào)的強(qiáng)度分布與從上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放并被檢測(cè)到的光的強(qiáng)度分布實(shí)質(zhì)一致的光強(qiáng)度范圍。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布來(lái)決定上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的噪聲強(qiáng)度的上限。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 還使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:在顯示裝置上顯示根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布和/或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在個(gè)別地檢測(cè)來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的信號(hào)的步驟中，在上述顯示裝置上顯示的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布或上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布上，設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 根據(jù)使吊鐘型函數(shù)與基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布擬合時(shí)的擬合誤差，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 根據(jù)基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布的形狀或根據(jù)上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布的形狀，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
30.根據(jù)權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 根據(jù)基于上述信號(hào)發(fā)生頻率累加值分布而決定的、針對(duì)上述光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的分布中的針對(duì)上述位置的函數(shù)值的上述信號(hào)的強(qiáng)度的斜率，來(lái)設(shè)定應(yīng)該作為上述發(fā)光粒子的信號(hào)抽出的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的上述光強(qiáng)度范圍。
31.根據(jù)權(quán)利要求22-30中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
32.根據(jù)權(quán)利要求22-31中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 還包括以下步驟:根據(jù)上述檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)決定上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103460026SQ201280016619
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月29日
【發(fā)明者】葉梨拓哉, 山口光城, 田邊哲也 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社