防止細胞轉(zhuǎn)化和癌癥轉(zhuǎn)移的組合物和方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝擞糜诒碚魑⑴莼蚱渌そY(jié)構(gòu)的方法。所述方法包括檢測樣品中的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)，并且在某些方面包括確定存在或不存在組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（tTG）和/或交聯(lián)纖連蛋白（FN）?？梢允褂弥亟MtTG或其衍生物，或者tTG或FN結(jié)合配體從樣品中分離所述微泡或其他膜結(jié)構(gòu)。本申請還提供了抑制物質(zhì)從含有tTG的微泡轉(zhuǎn)移至一個或多個細胞的方法。所述方法包括給予個體tTG抑制劑，如具有細胞不透性的tTG抑制劑。本申請還提供了組合物，所述組合物含有微泡或其他膜結(jié)構(gòu)群，其中所述群附著于tTG或其衍生物，或者附著于tTG或FN的結(jié)合配體之上。本申請還提供了用于實施所述方法的試劑盒，所述試劑盒包括試劑和其他組分。
【專利說明】防止細胞轉(zhuǎn)化和癌癥轉(zhuǎn)移的組合物和方法
相關(guān)申請的交叉引用
[0001]本申請要求2011年2月17日提交的申請?zhí)枮?1/443，978的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其公開的內(nèi)容通過引用并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明一般地涉及癌癥的診斷和治療，更具體地涉及基于從癌細胞上脫落的微泡的新型癌癥標記物和療法。
發(fā)明背景
[0003]腫瘤進展涉及癌細胞在其微環(huán)境中彼此間以及與鄰近的正常細胞之間相互溝通的能力。來源于人體癌細胞的微泡(MV)已受到關(guān)注，因為其明顯能夠參與信號蛋白在癌細胞之間的水平轉(zhuǎn)移，并且促進癌細胞的侵襲活性。不同類型的高級或侵襲形式的人癌細胞釋放MV至其周圍環(huán)境，這已越來越多的被認為是一種腫瘤生物學的特征。然而，對這些結(jié)構(gòu)是如何產(chǎn)生的及其在癌癥進展中的重要性目前仍知之甚少。因此，探索MV在癌癥中迄今為止尚未被確認的作用，并利用這些作用開發(fā)涉及診斷方法和治療干涉的組合物和方法具有持續(xù)和尚未滿足的需求。本發(fā)明滿足了這些需求。
發(fā)明簡述
[0004]本發(fā)明部分地基于我們的發(fā)現(xiàn)，即在微泡(MV)介導(dǎo)的正常細胞轉(zhuǎn)化中，從癌細胞脫落的(MV)必需包含組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tTG)。在這方面，我們發(fā)現(xiàn)從多種類型的人癌細胞上脫落的MV都能夠賦予正常細胞(以成纖維細胞和上皮細胞為代表的非癌細胞)轉(zhuǎn)化的表型，通過類似存活能力的增強和錨定非依賴性生長，能夠證明這種轉(zhuǎn)化表型。我們還發(fā)現(xiàn)tTG本身不足以轉(zhuǎn)化正常細胞。相反，tTG必需和一種與其相結(jié)合和交聯(lián)的蛋白(纖連蛋白(FN)) —起參與到正常細胞的轉(zhuǎn)化過程中。因而，本發(fā)明的一個方面是鑒定具有誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化能力的MV，所述轉(zhuǎn)化依賴于tTG的存在。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)與微泡相結(jié)合的tTG的作用來抑制誘導(dǎo)正常細胞轉(zhuǎn)化的方法。
[0005]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了 一種表征微泡的方法。所述方法包括獲取含有微泡的樣品和檢測微泡中的tTG。基于對MV的檢測確定MV是否含有tTG和/或交聯(lián)的FN，如果在樣品中存在與微泡相結(jié)合的tTG則將所述MV鑒定為tTG陽性，相反，如果在樣品中不存在與微泡相結(jié)合的tTG則將所述微泡鑒定為tTG陰性。在另一個實施方式中，所述方法包括檢測tTG陽性微泡的存在情況。所述方法包括獲取樣品和對所述樣品進行分析以檢測與tTG結(jié)合的微泡的存在情況。在另一個實施方式中，所述方法包括獲取含有微泡的樣品，并對所述微泡進行檢測以確定其是否包含交聯(lián)的FN。如果樣品中存在與微泡相結(jié)合的交聯(lián)FN則將所述MV鑒定為交聯(lián)FN陽性，相反如果樣品中不存在與微泡相結(jié)合的交聯(lián)FN則將所述微泡鑒定為交聯(lián)FN陰性。
[0006]所述方法適于分析含有MV的任意樣品。在一個實施方式中，所述樣品包括來自診斷為患有癌癥、疑似患有癌癥、或存在癌癥風險的個體的液體生物樣品。在一個實施方式中，所述樣品來自正在接受癌癥治療的個體。[0007]本發(fā)明的一個方面包括將個體診斷為具有循環(huán)微泡的方法，所述循環(huán)微泡為tTG和/或交聯(lián)的FN陽性或者tTG和/或交聯(lián)的FN陰性。所述方法包括檢測來自個體的樣品中的與微泡相結(jié)合的tTG和/或交聯(lián)的FN，如果分別存在tTG和/或交聯(lián)的FN，則將所述個體鑒定為具有與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的循環(huán)微泡，如果均不存在與微泡相結(jié)合的tTG和/或交聯(lián)的FN，則將所述個體鑒定為不具有與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的循環(huán)微泡。
[0008]在不同實施方式中，檢測所述微泡包括采用任意適合的技術(shù)從液體生物樣品中分離微泡。在一個實施方式中，分離所述MV包括使用結(jié)合配體捕獲?？梢允褂媚軌蜻x擇性結(jié)合tTG或FN，或者選擇性結(jié)合包括tTG和FN的復(fù)合物的任意試劑。在某些實施方式中，所述結(jié)合配體選自FN、抗-FN抗體或其抗體結(jié)合片段或衍生物、重組tTG和經(jīng)修飾的tTG、tTG或經(jīng)修飾的tTG的片段、抗-tTG抗體或其抗體結(jié)合片段或衍生物、以及上述試劑的組合?？梢允褂萌我膺m合的技術(shù)和試劑檢測是否存在tTG。在不同實施方式中，可以使用上述結(jié)合配體中的一種或組合進行檢測，其中所述結(jié)合配體已被檢測標記和/或附著于基質(zhì)上。
[0009]在另一個方面，本發(fā)明包括從樣品中分離膜結(jié)構(gòu)的方法。該實施方式包括提供可能含有所述膜結(jié)構(gòu)的樣品并將所述樣品與tTG或其衍生物混合，如果樣品中存在所述膜結(jié)構(gòu)，則允許其形成膜結(jié)構(gòu)與tTG或其衍生物的復(fù)合物。如果存在所述膜結(jié)構(gòu)，將所述tTG和膜結(jié)構(gòu)的復(fù)合物與樣品的其余部分分離。
[0010]本發(fā)明的另一個方面包括抑制物質(zhì)從含有tTG的微泡轉(zhuǎn)移至個體中的一個或多個細胞的方法。所述方法包括給予所述個體tTG抑制劑。所述tTG抑制劑可以是具有細胞不透性的tTG抑制劑，如生物試劑，包括但不限于抗體，或者其可以是藥學試劑，如小分子tTG抑制劑。
[0011]本發(fā)明還提供了一種包括分離的微泡群的組合物，其中所述微泡包含tTG，其中所述分離的微泡群附著于tTG或FN結(jié)合配體。
[0012]本發(fā)明還提供了用于檢測tTG陽性微泡的試劑盒。
附圖的簡要說明
[0013]圖1.利用掃描電子顯微鏡SEM (左圖)和使用與羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽的免疫熒光顯微鏡檢測F-肌動蛋白(右圖)來對MDAMB231細胞進行分析。一些最大的MV如箭頭所
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[0014]圖2.對在血清饑餓或EGF刺激條件下培養(yǎng)的多種細胞系中產(chǎn)生的MV進行定量。通過使用與羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽標記所述樣品對產(chǎn)生MV的細胞進行檢測。數(shù)據(jù)以平均值土 s.d.表示，其來自三次獨立實驗。
[0015]圖3.圖2所示實驗中細胞的圖像。一些MV如箭頭所示。
[0016]圖4.用實時成像的熒光顯微鏡觀察MDAMB231細胞，所述MDAMB231細胞瞬時表達來自Lyn酪氨酸激酶(GFP-PM)的質(zhì)膜靶序列的GFP標記形式。其顯示了以2分鐘間隔拍攝的轉(zhuǎn)染子的一系列延時圖像。箭頭表示形成并從細胞中脫落的W。
[0017]圖5.將模擬轉(zhuǎn)染或使用pEGFP (編碼GFP的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染的去血清的MDAMB231細胞裂解，并將通過轉(zhuǎn)染子脫落至培養(yǎng)基中的MV分離和裂解。然后使用針對GFP、MV-標記物脂筏標記蛋白_2 (flotillin-2)、和細胞質(zhì)特異性標記物ΙκΒα的抗體對全細胞裂解物(WCL)和MV裂解物進行的免疫印跡法分析。[0018]圖6.使用針對MV-標記物肌動蛋白和脂筏標記蛋白-2、細胞質(zhì)特異性標記物I K B α、和活化的(磷酸基)-EGF-受體的抗體對血清饑餓的MDAMB231和U87細胞的全細胞裂解物(WCL)以及這些細胞脫落的MV的裂解物進行免疫印跡法分析。
[0019]圖7.如圖所示將多組去血清的ΝΙΗ3Τ3成纖維細胞與無血清培養(yǎng)基、含2%小牛血清(CS)的培養(yǎng)基、或補充了來源于MDAMB231或U87細胞的完整MV的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。暴露于不同培養(yǎng)條件下指定時長后，將一組細胞裂解，并使用識別活化的和總AKT和ERK的抗體進行免疫印跡法分析。
[0020]圖8.如圖所示將多組去血清的ΝΙΗ3Τ3成纖維細胞與無血清培養(yǎng)基、含2%小牛血清(CS)的培養(yǎng)基、或補充了來源于MDAMB231或U87細胞的完整MV的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。對另外兩組成纖維細胞評估其經(jīng)受去血清引發(fā)的細胞死亡的能力。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0021]圖9.如圖所示將多組去血清的NIH3T3成纖維細胞與無血清培養(yǎng)基、含2%小牛血清(CS)的培養(yǎng)基、或補充了來源于MDAMB231或U87細胞的完整MV的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。對另外兩組成纖維細胞評估其在低血清下(2%CS)的生長能力。對于生長檢測，每日補充一次培養(yǎng)基(包括MV)。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0022]圖10.對不與或與來源于MDAMB231或U87細胞的MV共同培養(yǎng)的NIH3T3成纖維細胞進行錨定非依賴性的生長檢測。每三天重新加入一次軟瓊脂培養(yǎng)基(包括加入新鮮制備的MV)。將表達Cdc42F28L的NIH3T3細胞作為這些實驗的陽性對照。數(shù)據(jù)以平均值土 s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0023]圖11.圖10中形成的集落的圖像。
[0024]圖12.對血清饑餓的MDAMB231和U87細胞的全細胞裂解物(WCL)以及從這些細胞脫落的MV的裂解物，使用若干抗體包括一個針對tTG的抗體，進行免疫印跡法分析。
[0025]圖13.上圖——使用tTG抗體進行免疫染色的MDAMB231細胞?？騼?nèi)的區(qū)域被放大，并使用箭頭表示某些MV。下圖——僅使用二抗共染色的MDAMB231細胞(左圖)和使用標記MV的偶聯(lián)羅丹明的鬼筆環(huán)肽(右圖)共染色的MDAMB231細胞。
[0026]圖14。圖示為對血清饑餓的U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和HeLa宮頸癌細胞不進行處理或使用EGF對其刺激15分鐘，然后再用tTG抗體免疫染色的圖像。如箭頭所示是明顯的MV。
[0027]圖15.對異位表達僅GFP或GFP_tTG的MDAMB231細胞的全細胞裂解物(WCL)和從這些轉(zhuǎn)染子脫落至其培養(yǎng)基中的MV的裂解物，使用針對GFP、MV-標記物脂筏標記蛋白-2、和細胞質(zhì)特異性標記物I K B α的抗體進行的免疫印跡法分析。
[0028]圖16.使用針對tTG和細胞內(nèi)蛋白Rheb、以及標記核的DAPI的抗體染色的MDAMB231細胞的透性化和非透性化樣品的熒光圖像。
[0029]圖17.根據(jù)BPA摻入酪蛋白的讀數(shù)，檢測血清饑餓MDAMB231細胞的全細胞裂解物(WCL)和這些細胞產(chǎn)生的完整MV的轉(zhuǎn)酰胺基作用活性，這些細胞不使用或使用tTG抑制劑TlOl (細胞不透性)或MDC (細胞透性)處理。然后使用針對tTG、脂筏標記蛋白-2、和I K B α的抗體對樣品進行免疫印跡法分析。
[0030]圖18.來源于MDAMB231細胞的MV具有誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化的能力，此能力依賴于將tTG從MV轉(zhuǎn)移至受體細胞。使用tTG和肌動蛋白抗體對血清饑餓NIH3T3成纖維細胞的提取物進行免疫印跡法分析，所述血清饑餓NIH3T3成纖維細胞與無血清培養(yǎng)基或添加了來源于MDAMB231細胞的MV的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述來源于MDAMB231細胞的MV不使用或使用tTG抑制劑TlOl預(yù)處理30分鐘培養(yǎng)。
[0031]圖19.來源于MDAMB231細胞的MV具有誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化的能力，此能力依賴于將tTG從MV轉(zhuǎn)移至受體細胞。根據(jù)BPA摻入裂解蛋白的讀數(shù)，檢測血清饑餓NIH3T3成纖維細胞的提取物的轉(zhuǎn)酰胺基作用活性，所述血清饑餓NIH3T3成纖維細胞與無血清培養(yǎng)基或添加了來源于MDAMB231細胞的MV的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述來源于MDAMB231細胞的MV不使用或使用tTG抑制劑TlOl預(yù)處理30分鐘。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0032]圖20.對在無血清培養(yǎng)基、2%CS_培養(yǎng)基、或含來源于MDAMB231細胞的MV的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的成纖維細胞進行的細胞死亡檢測。如圖所示，對各培養(yǎng)基進一步添加或不添加tTG抑制劑TlOl (細胞不透性)或MDC (細胞透性)。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0033]圖21.成纖維細胞的錨定非依賴性生長檢測，所述成纖維細胞培養(yǎng)在來源于MDAMB231細胞的MV中，所述MV經(jīng)過(或不經(jīng)過)T101，或RGD肽(或?qū)φ誖GE-肽)處理。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0034]圖22.穩(wěn)定表達Myc-tTG或空載體的NIH3T3裂解物的免疫印跡法分析，該分析使用Myc和肌動蛋白抗體。并且根據(jù)BPA摻入裂解蛋白的讀數(shù)，檢測轉(zhuǎn)酰胺基作用的活性。
[0035]圖23.對保存在無血清培養(yǎng)基中的NIH3T3穩(wěn)定細胞系進行細胞死亡檢測，所述無血清培養(yǎng)基經(jīng)過(或未經(jīng)過)T101、MDC、或2%CS-培養(yǎng)基處理。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0036]圖24.NIH3T3穩(wěn)定細胞系的錨定非依賴性生長檢測。作為陽性對照，將載體對照成纖維細胞與來源于MDAMB231細胞的MV培養(yǎng)。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0037]圖25.將 5X105 個表達對照 siRNA (siCont)或 tTG siRNA (表示為 siTG-Ι 或siTG-2)的有絲分裂阻滯的(使用絲裂霉素-C) MDAMB231細胞(表示為Mito_C_MDAMB231)單獨或與5X105個NIH3T3成纖維細胞聯(lián)合通過皮下注射至裸鼠體內(nèi)來進行腫瘤形成試驗。將未經(jīng)處理的MDAMB231和NIH3T3細胞注射至裸鼠體內(nèi)作為對照。不同條件下形成的腫瘤計數(shù)，其結(jié)果列于表中。
[0038]圖26.MDAMB231的全細胞裂解物(WCL)和從這些細胞脫落的MV的裂解物的免疫沉淀(使用tTG抗體)。免疫沉淀后樣品(輸入道為未經(jīng)免疫沉淀處理)使用FN、tTG、和肌動蛋白抗體進行免疫印跡法分析。值得注意的是，在MV道檢測到了交聯(lián)的FN (FN 二聚體)。
[0039]圖27.從MDAMB231或U87細胞收集的完整的MV，在裂解前使用(或不使用)TlOl進行處理。然后使用FN和tTG抗體對MV提取物進行免疫印跡分析。值得注意的是，經(jīng)TlOl處理顯著降低在MV樣品中檢測到的交聯(lián)形式的FN (FN 二聚體)。
[0040]圖28.使用針對FAK或ERK的抗體或者特異性識別這些蛋白激酶活化形式的抗體對成纖維細胞裂解物進行免疫印跡法分析，所述成纖維細胞與或者不與來源于MDAMB231和U87細胞的MV共同培養(yǎng)，所述來源于MDAMB231和U87細胞的MV使用或不使用TlOl預(yù)處理。[0041]圖29。MV是如何轉(zhuǎn)化受體細胞的圖示。人癌細胞產(chǎn)生含有tTG和纖連蛋白的MV并從細胞表面釋放。釋放后的MV可以通過被鄰近的正常細胞攝取或直接改變鄰近正常細胞的微環(huán)境，通過tTG和FN的共轉(zhuǎn)移協(xié)同作用誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生促進細胞存活和異常細胞生長的信號活動。
[0042]圖30.MDAMB231乳腺癌細胞組成性的釋放MV至培養(yǎng)基。將使用編碼GFP的質(zhì)粒(pEGFP)轉(zhuǎn)染的或模擬轉(zhuǎn)染的MDAMB231細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。收集來自轉(zhuǎn)染子的條件培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)基中存在的完整MV，并用熒光活化細胞分類計(FACS)進行分析(細胞柵設(shè)定為GFP陽性，并且細胞直徑為I 一 3微米)。該結(jié)果為對從模擬轉(zhuǎn)染MDAMB231細胞中分離得到的MV進行分析得到的結(jié)果。
[0043]圖31.MDAMB231乳腺癌細胞組成性的釋放MV至培養(yǎng)基。將使用編碼GFP的質(zhì)粒(pEGFP)轉(zhuǎn)染的或模擬轉(zhuǎn)染的MDAMB231細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。收集來自轉(zhuǎn)染子的條件培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)基中存在的完整MV，并用熒光活化細胞分類計(FACS)進行分析(細胞柵設(shè)定為GFP陽性，并且細胞直徑為I 一 3微米)。該結(jié)果為對從瞬時表達GFP的MDAMB231細胞中分離得到的MV進行分析得到的結(jié)果。
[0044]圖32.來源于MDAMB231細胞的MV轉(zhuǎn)化MCFlOA乳房上皮細胞。對在無血清培養(yǎng)基、含2%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基、或添加了來源于5.0XlO6個MDAMB231細胞的完整MV的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天的MCFlOA細胞進行細胞死亡檢測。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自三次獨立實驗。
[0045]圖33.來源于MDAMB231細胞的MV轉(zhuǎn)化MCFlOA乳房上皮細胞。對與MV培養(yǎng)的MCFlOA細胞進行錨定非依賴性生長檢測，所述MV來源于5.0XlO6個MDAMB231細胞，且不使用或使用tTG抑制劑TlOl處理。連續(xù)12天每三天補充一次用于軟瓊脂檢測的培養(yǎng)基(包括MV、T101、和AG1478)，并同時計數(shù)所形成的集落。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自三次獨立實驗。
[0046]圖34.來源于MDAMB231細胞的MV轉(zhuǎn)化MCFlOA乳房上皮細胞。對與來源于U87細胞的MV培養(yǎng)的NIH3T3成纖維細胞進行錨定非依賴性生長檢測，所述來源于U87細胞的MV不使用或使用FGE受體抑制劑AG1478處理。連續(xù)12天每三天補充一次用于軟瓊脂檢測的培養(yǎng)基(包括MV、T101、和AG1478)，并同時計數(shù)所形成的集落。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自三次獨立實驗。
[0047]圖35.將來源于MDAMB231細胞的完整MV分離、固定、使用tTG抗體免疫染色，然后進行SEM檢測。所顯示的是MV的典型的SEM圖像。值得注意的是，在MV的表面上檢測到了 tTG。
[0048]圖36.將固定濃度的純化重組tTG (I μ Μ)與濃度漸增的tTG抑制劑TlOl共同培養(yǎng)后對其轉(zhuǎn)酰胺基作用活性進行檢測。測得TlOl的IC50 (虛線)為?1.5 μ M。該實驗又另外重復(fù)了兩次，均得到了類似結(jié)果。
[0049]圖37.根據(jù)BPA摻入裂解蛋白的讀數(shù)，對MDAMB231細胞的細胞提取物進行轉(zhuǎn)酰胺基活性作用的檢測，所述MDAMB231細胞在未添加或添加200 μ M TlOl (此濃度比在B中該抑制劑計算得到的IC50高133倍)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)?10小時，隨后充分洗滌并裂解(細胞培養(yǎng)物)。在進行轉(zhuǎn)酰胺基活性作用檢測前，制備等量的未經(jīng)處理的或使用IOyM TlOl培養(yǎng)15分鐘的MDAMB231細胞提取物(細胞提取物)。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自三次獨立實驗。
[0050]圖38.使用tTG抗體對使用或不使用T101、MDC、BFA、或Exol處理的血清饑餓的MDAMB231細胞進行免疫染色。所顯示的是接觸不同抑制劑的細胞的典型圖像。形成MV的細胞如箭頭所示。
[0051]圖39.使用或不使用tTG抑制劑TlOl和MDC處理的(左圖)、使用對照siRNA(siCont)或兩種不同的tTG siRNA (siTG_l和siTG_2)轉(zhuǎn)染的(中圖)、或者不使用或使用經(jīng)典分泌抑制劑BFA和Exol處理(右圖)的血清饑餓的MDAMB231的細胞裂解物(WCL)，同時收集和裂解由細胞釋放至所述培養(yǎng)基中的MV。使用針對tTG、MV-標記物脂筏標記蛋白-2、和細胞質(zhì)特異性標記物I K B α的抗體對提取物進行的免疫印跡法分析。
[0052]圖40.使用針對Myc-標簽、脂筏標記蛋白_2、和I κ B α的抗體對僅僅異位表達載體的MDAMB231細胞的全細胞裂解物或具有Myc標簽的野生型tTG (TG WT)、轉(zhuǎn)酰胺基作用缺陷型tTG (TG C277V)、GTP結(jié)合缺陷型tTG (TG R580L)的全細胞裂解物(WCL)以及從這些轉(zhuǎn)染子脫落的MV的裂解物進行的免疫印跡法分析。
[0053]圖41.使用tTG和肌動蛋白抗體對成纖維細胞與來源于U87細胞的MV培養(yǎng)30分鐘后的裂解物進行免疫印跡法分析，所述來源于U87細胞的MV不使用或使用細胞不透性tTG抑制劑TlOl預(yù)處理。
[0054]圖42.使用tTG抗體和與羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽對NIH3T3細胞進行免疫染色以檢測肌動蛋白，所述NIH3T3細胞使用未添加或添加了由MDAMB231或U87細胞產(chǎn)生的完整MV的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30分鐘。所顯示的是成纖維細胞的典型熒光圖像。值得注意的是，僅在與來源于癌細胞的MV培養(yǎng)的成纖維細胞中檢測到了 tTG。
[0055]圖43.根據(jù)BPA摻入裂解蛋白的讀數(shù)，對與來源于U87細胞的MV培養(yǎng)30分鐘的成纖維細胞的裂解物的轉(zhuǎn)酰胺基作用活性進行檢測，所述來源于U87細胞的MV不使用或使用TlOl預(yù)處理。
[0056]圖44.對在無血清培養(yǎng)基、2%CS_培養(yǎng)基、或含有來自5.0XlO6個U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的MV的無血清培養(yǎng)基中保存的成纖維細胞進行細胞死亡檢測。對各培養(yǎng)基進一步添加細胞不透性tTG抑制劑TlOl或未對其進行處理。數(shù)據(jù)以平均值土 s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0057]圖45.收集從5.0XlO6個血清饑餓的MDAMB231細胞中脫落的MV并將其重新懸浮于無血清DMEM中，所述血清饑餓的MDAMB231使用對照siRNA (siCont)或兩種不同tTGsiRNA (siTG-Ι和siTG-2)轉(zhuǎn)染。將NIH3T3細胞接種于6孔板中，然后加入無血清培養(yǎng)基或含有不同MV制備物的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)?35小時，同時測定不同細胞培養(yǎng)物的細胞死亡率。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0058]圖46.收集從5.0XlO6個血清饑餓的MDAMB231細胞中脫落的MV并將其重新懸浮于無血清DMEM中，所述MV使用對照siRNA (siCont)或兩種不同tTG siRNA (siTG-Ι和siTG-2)轉(zhuǎn)染。對使用上述不同的MV制備物培養(yǎng)的NIH3T3成纖維細胞進行錨定非依賴性生長檢測。連續(xù)12天每三天補充一次軟瓊脂培養(yǎng)基(包括加入新制的MV)，并同時計數(shù)所形成的集落。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0059]圖47.對對照NIH3T3成纖維細胞或與來源于5.0XlO6個U87神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤的MV培養(yǎng)的成纖維細胞進行錨定非依賴性生長檢測，所述來源于5.0XlO6個U87神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤的MV使用T101、RGD-肽、RGE對照肽處理、或未經(jīng)處理。數(shù)據(jù)以平均值土s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0060]圖48.對穩(wěn)定表達激活型Cdc42 (Cdc42F28L)或空載體的NIH3T3細胞進行錨定非依賴性生長檢測，所述NIH3T3細胞使用200 μ M TlOl處理或未經(jīng)處理。值得注意的是，Cdc42F28L誘導(dǎo)集落形成的能力對TlOl不敏感。數(shù)據(jù)以平均值土 s.d.表示，其來自至少三次獨立實驗。
[0061]圖49.TlOl不干擾tTG與FN在來源于MDAMB231細胞或U87細胞的MV中結(jié)合的能力。在裂解前，不使用或使用TlOl對從MDAB231或U87細胞中收集的完整MV進行處理。然后使用tTG抗體將MV提取物免疫沉淀(IP: tTG)。使用FN和tTG抗體對所得到的免疫復(fù)合物進行免疫印跡法分析。
[0062]圖50.用針對tTG和纖連蛋白的抗體，或者重組tTG可以從癌細胞的條件培養(yǎng)基中分離微泡。制備血清饑餓的MDAMB231乳腺癌細胞(231)和U87腦腫瘤細胞(U87)的細胞裂解物(WCL)，并收集這些細胞的條件培養(yǎng)基。如圖所示，使用與蛋白-G小珠結(jié)合的tTG或纖連蛋白(FN)抗體對培養(yǎng)基進行免疫沉淀(IP)。并將與鎳珠結(jié)合的純化、重組tTG(PPT: Rec.tTG)與所述條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。使用所述抗體對使用抗體或tTG重組形式沉淀得到的復(fù)合物，以及來自癌細胞的全細胞裂解物(WCL)樣品進行免疫印跡分析。在免疫沉淀(IP)和沉淀(PPT)樣品道中存在微泡標記物脂筏標記蛋白表明針對tTG和纖連蛋白的抗體以及tTG的重組形式能夠捕獲從癌細胞脫落至培養(yǎng)基中的微泡。
[0063]圖51.重組tTG能夠與無任何蛋白成分的液體囊泡結(jié)合。采用擠出法制備合成脂質(zhì)體，然后將該制備物與5yg重組tTG (tTG WT)或5yg牛血清白蛋白(BSA)等量組合。培養(yǎng)15分鐘后，離心沉淀脂質(zhì)體，利用SDS-PAGE分離所得到的上清(Sup)和脂質(zhì)體(團塊)組分。然后使用Quick Blue對凝膠染色以檢測蛋白。設(shè)置含有重組tTG (Rec.tTG WT)的泳道作為標準。
發(fā)明詳述
[0064]本發(fā)明充分利用了我們的發(fā)現(xiàn)，即MV介導(dǎo)的正常細胞的轉(zhuǎn)化，部分依賴于含有tTG的W。特別地，我們證明了從不同類型人癌細胞脫落的MV能夠?qū)┘毎霓D(zhuǎn)化性質(zhì)賦予正常的成纖維細胞和上皮細胞，如錨定非依賴性生長的能力和增強的存活能力。這一轉(zhuǎn)化性質(zhì)需要將蛋白交聯(lián)酶tTG轉(zhuǎn)移至所述細胞。我們進一步證明了 tTG不足以轉(zhuǎn)化正常細胞，還需要另一種蛋白介導(dǎo)所述來源于癌細胞的MV的轉(zhuǎn)化作用。我們發(fā)現(xiàn)tTG交聯(lián)基質(zhì)纖連蛋白(FN)也參與了非癌細胞的轉(zhuǎn)化。特別地，并且不限于任何特定理論，我們發(fā)現(xiàn)在來自癌細胞的MV中發(fā)生了 tTG與FN的交聯(lián)，交聯(lián)的FN和tTG隨后在MV介導(dǎo)下向受體成纖維細胞轉(zhuǎn)移，協(xié)同活化有絲分裂信號并且誘導(dǎo)受體細胞轉(zhuǎn)化。關(guān)于FN與tTG交聯(lián)，我們證明了在從癌細胞脫落的微泡中存在交聯(lián)的FN，但是我們未在相同細胞的全細胞裂解物(WCL)中檢測到交聯(lián)的FN (參見例如圖26)。因此，我們認為FN與tTG的交聯(lián)發(fā)生在MV中。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了 MV在誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化中的新作用。因而，本發(fā)明旨在鑒定具有誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化能力的MV和提供抑制這種誘導(dǎo)作用的方法。
[0065]與本發(fā)現(xiàn)相關(guān)，越來越多的證據(jù)表明在體內(nèi)癌細胞能夠產(chǎn)生MV。已有發(fā)現(xiàn)表明當將若干不同人原發(fā)腫瘤細胞或已建立的癌細胞系培養(yǎng)物脫落的MV隨后加入至相同癌細胞后，這些細胞的生長和存活顯著增強。當在腫瘤背景下考慮這些發(fā)現(xiàn)時，可以將癌細胞間共有的MV所產(chǎn)生的增加的增殖能力設(shè)想為促進腫瘤生長的機制。然而，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)MV以出乎預(yù)料的方式影響癌癥進展，特別是通過將轉(zhuǎn)化的癌細胞特性賦予作為腫瘤微環(huán)境的主要成分的正常細胞系(即，成纖維細胞和上皮細胞)。這一發(fā)現(xiàn)與腫瘤的擴大并不一定僅依賴于癌細胞增殖的觀點一致，腫瘤的擴大還依賴于包括暴露于癌細胞脫落的MV中的腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞(包括成纖維細胞)和正常上皮所表現(xiàn)出的異常生長。
[0066]為了使從癌細胞脫落的MV (即，我們作為模型細胞使用的MDAMB231乳腺癌細胞和U87腦瘤細胞)在低血清下促進正常細胞(即，NIH3T3成纖維細胞和MCFlOA乳房上皮細胞)的生長和誘導(dǎo)其產(chǎn)生在軟瓊脂上形成集落的能力，在生長檢測中通常需要使用新制的MV重復(fù)處理受體細胞。這表明在加入正常受體細胞后MV中所含的、與促進其轉(zhuǎn)化活性有關(guān)的蛋白和RNA轉(zhuǎn)錄物，具有有限的存在時間并且需要持續(xù)補充。當在腫瘤背景下考慮這一問題時，癌細胞可以向其微環(huán)境中長期脫落MV，以此向與之鄰近的受體基底和正常上皮持續(xù)提供所需的MV以誘導(dǎo)并維持轉(zhuǎn)化的表型。因而，本發(fā)明提供了檢測MV的方法，所述MV涉及賦予非癌細胞的轉(zhuǎn)化表型的轉(zhuǎn)化和維持，還提供了抑制這些過程的方法。
[0067]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了 一種表征微泡的方法。所述方法通常包括獲取樣品和檢測所述樣品中是否存在與MV結(jié)合的tTG。如果樣品中存在與微泡相結(jié)合的tTG，則將所述微泡鑒定為tTG陽性。如果在樣品中未鑒定得到tTG，但存在微泡，則將所述微泡
鑒定為tTG陰性?！芭c......相結(jié)合”指在微泡中存在所述蛋白(即，tTG或FN)，其完全或
部分地包含在所述微泡中，或者完全或部分地在囊泡膜內(nèi)。然而，在通常情況下，我們認為本申請所述的與MV相結(jié)合的tTG至少有一部分是跨MV膜的tTG蛋白，或者有至少一部分是與MV膜的外層相結(jié)合或處于MV外側(cè)。
[0068]在其他實施方式中，所述方法包括檢測微泡中交聯(lián)的FN?；谶@種檢測，如果檢測到與所述微泡相結(jié)合的交聯(lián)的FN，則可以將所述MV鑒定為交聯(lián)的FN陽性。同樣地，如果不存在與所述微泡相結(jié)合的交聯(lián)的FN，則將所述微泡鑒定為交聯(lián)的FN陰性。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認識到如何基于如分子量、遷移率分析等因素來區(qū)分交聯(lián)的FN與未交聯(lián)的(單體)FN。
[0069]在本發(fā)明的某些實施方式中，確定MV是tTG陽性能夠指示所述MV也是交聯(lián)的FN陽性。同樣地，在某些實施方式中，確定MV是tTG陰性能夠指示所述MV也是交聯(lián)的FN陰性。因此，在某些實施方式中，確定MV是交聯(lián)的FN陽性能夠指示所述MV是tTG陽性，確定MV是交聯(lián)的FN陰性能夠指示所述MV也是tTG陰性。
[0070]本發(fā)明的一個相關(guān)方面提供了一種方法，所述方法包括檢測tTG陽性和/或交聯(lián)FN陽性的微泡的存在。所述方法包括獲取樣品和對樣品進行分析以檢測與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的微泡的存在。
[0071]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種將個體診斷為具有tTG陽性和/或交聯(lián)FN陽性的循環(huán)微泡的方法。該實施方式包括檢測獲取自個體的樣品中的與tTG結(jié)合和/或與交聯(lián)的FN結(jié)合的微泡，如果在樣品中存在tTG則將所述個體鑒定為具有與tTG相結(jié)合的循環(huán)微泡，如果在樣品中存在交聯(lián)的FN則將所述個體鑒定為具有交聯(lián)FN陽性的W。如果樣品中不存在tTG則所述個體可以被鑒定為不具有與tTG相結(jié)合的循環(huán)微泡，同樣地如果樣品中不存在交聯(lián)的FN則所述個體可以被鑒定為不具有與交聯(lián)FN相結(jié)合的循環(huán)微泡。
[0072]如本申請所使用的，術(shù)語“微泡”或“MV”指從細胞脫落的囊泡，其中所述囊泡具有的直徑范圍為0.1至5.0微米，包括其間的所有整數(shù)和精確到小數(shù)點后一位的數(shù)字。能夠賦予正常細胞轉(zhuǎn)化表型的微泡在本申請中也稱為微泡或“致癌組”。檢測從腫瘤中脫落的微泡的一些方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如(Skog J等，(2008)Nat Cell BiollO: 1470 - 1476)，其中公開了可以從罹患成膠質(zhì)細胞瘤人類患者的血液樣品中檢測來源于腦腫瘤的微泡。如有需要還可以通過微泡表面標記物⑶63、或脂後標記蛋白(參見例如Rak2008Nature CellBiology)、或這些和/或其他MV標記物的組合對本發(fā)明中的微泡進行鑒定。
[0073]在另一個方面，本發(fā)明包括一種從樣品中分離膜結(jié)構(gòu)的方法，所述膜結(jié)構(gòu)可以包括MV。所述方法通常包括提供可能包含所述膜結(jié)構(gòu)的樣品，將所述樣品與tTG或其衍生物混合，如果樣品中存在所述膜結(jié)構(gòu)，允許其形成膜結(jié)構(gòu)與tTG或其衍生物的復(fù)合物，以及從樣品中分離所述tTG或tTG的衍生物與所述膜結(jié)構(gòu)的所述復(fù)合物。
[0074]在不同實施方式中，所述膜結(jié)構(gòu)通常是球形含脂質(zhì)體。球形膜結(jié)構(gòu)可以包括脂質(zhì)雙層。所述方法特別適于捕獲從細胞脫落或分泌的那些膜結(jié)構(gòu)。因而，所述膜結(jié)構(gòu)可以來自任意含膜的生物材料，其包括但不限于細胞內(nèi)膜、囊泡如分泌囊泡、細胞器、包膜結(jié)構(gòu)、質(zhì)膜等。在某些實施方式中，所述膜結(jié)構(gòu)選自囊泡、外來體、微泡、微粒子、腔內(nèi)囊泡、來源于內(nèi)體的囊泡、多泡體、及其組合。
[0075]本發(fā)明適于分析任意生物樣品中MV的存在，特別適于與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的囊泡。在一個實施方式中，所述樣品是液體生物樣品。所述液體生物樣品可以包括或由可能含有MV的血液、血清、腦脊液、尿液或任意其他生物液體組成。所述生物樣品可以來自個體，如哺乳動物。在一個實施方式中，所述哺乳動物是人。所述人可以是已被診斷為患有癌癥、存在發(fā)展成癌癥的風險或患有癌癥的個體。所述生物樣品可以直接用于確定是否存在tTG和/或交聯(lián)的FN陽性的微泡。在另一個實施方式中，在對所述樣品進行檢測前對樣品進行處理步驟。在一些實施方式中，可以進行所述處理步驟以純化微泡和/或富集樣品中的微泡含量。
[0076]本發(fā)明的一個方面包括從樣品中分離微泡，這樣如果樣品中存在tTG陽性MV和/或交聯(lián)的FN陽性MV就可以對其進行鑒別。在不同實施方式中，可以采用任意適宜的技術(shù)或技術(shù)的組合分離微泡或其他膜結(jié)構(gòu)，其包括但不一定限于基于尺寸、密度和/或電荷分離物質(zhì)中的組分的方法，所述方法包括但不限于離心和/或體積排阻色譜法。在不同實施方式中，可以使用一種或多種結(jié)合配體從樣品中檢測和/或分離微泡或其他膜結(jié)構(gòu)。因而，所述的結(jié)合配體是可以用于從樣品中檢測、捕獲和/或分離微泡或其他膜結(jié)構(gòu)的試劑?？梢詫Ψ蛛x的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)進行檢測以確定其是否含有tTG和/或交聯(lián)的FN，或其他組分如任意肽、蛋白、多核苷酸或任意其他指示微泡或其他膜結(jié)構(gòu)來源和/或在評估任意疾病或其他狀況中具有意義的標記物。在本發(fā)明的不同方面，可以通過確定樣品中是否存在與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)以評估獲取樣品的個體的涉及一個或多個癌癥相關(guān)參數(shù)的狀態(tài)，如個體是否患有癌癥如實體瘤，和個體是否具有或存在轉(zhuǎn)移風險，和/或所提供的某一特定治療方案對提供包含微泡樣品的個體是否有益。
[0077]在一個實施方式中，用于從樣品中分離微泡的所述結(jié)合配體是一種能夠與tTG或FN特異性結(jié)合的試劑。此類試劑包括但不一定限于能夠與tTG或交聯(lián)的FN特異性結(jié)合的tTG或FN的抗體，適體和小分子結(jié)合劑。在某些實施方式中，所述結(jié)合劑能夠特異性與tTG或交聯(lián)的FN結(jié)合，所述tTG或交聯(lián)的FN與從癌細胞中脫落的微泡相結(jié)合。所述結(jié)合劑可以對與微泡相結(jié)合的交聯(lián)的FN具有特異性。在另一個實施方式中，所述結(jié)合劑對tTG和FN的復(fù)合物具有特異性。這種復(fù)合物可以與微泡相結(jié)合，所述結(jié)合劑可以對與微泡結(jié)合的復(fù)合物形式具有特異性。
[0078]在本發(fā)明的某些方面，在對tTG陽性和/或FN陽性的微泡進行的、基于免疫吸附的檢測、分離和/或測定中可以使用一個或多個結(jié)合配體。因而，所述結(jié)合配體可以包括或由能夠與FN或tTG結(jié)合的抗-tTG抗體或抗-FN抗體或抗體片段組成。所述抗體不需要是任意特定類型，其可以是多克隆或單克隆抗體?？乖Y(jié)合片段包括但不一定限于Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、單鏈(ScFv)、雙體、多價抗體、包括一個或多個抗體部分的融合蛋白、和任意其他經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，其包括對tTG、FN、或其組合物具有所需特異性的抗原識別位點。
[0079]對于基于免疫吸附對MV進行的檢測而言，本領(lǐng)域公知的目前可用的分離方法一般為三步離心法，其需要大量的初始原料(即，來自癌細胞或血液樣品的條件培養(yǎng)基)，該方法耗時并且各次制備之間所得的MV產(chǎn)率可能存在較大差異。因而，根據(jù)本發(fā)明的對MV和其他膜結(jié)構(gòu)進行更有效分離的新方法具有重要的實用價值。如下文中更詳細的描述，我們的發(fā)現(xiàn)tTG和交聯(lián)的纖連蛋白是來源于癌細胞的MV的組分，這一組分對于MV的轉(zhuǎn)化能力具有重要作用?；谶@一發(fā)現(xiàn)，我們開發(fā)了一種試驗以確定我們能夠使用MV結(jié)合配體從癌細胞的條件培養(yǎng)基中捕獲MV。特別地，我們使用tTG抗體或纖連蛋白抗體從條件培養(yǎng)基中實施免疫沉淀，所述tTG抗體或纖連蛋白抗體與蛋白G-瓊脂糖小珠(購自Invitrogen)預(yù)先結(jié)合，所述條件培養(yǎng)基可以從血清饑餓的MDAMB231乳腺癌細胞和U87腦腫瘤細胞中收集。如圖50所示，在免疫沉淀樣品道中存在MV標記物脂筏標記蛋白(從上數(shù)第三行)，由此我們證明了 MV能夠與這些抗體中的任意一種免疫沉淀。我們還檢測了 RhoA的存在情況，這是一種已知不是MV組分的蛋白，在這些免疫沉淀中未檢測到這種蛋白，表明所述培養(yǎng)基未受到完整細胞的污染(最下面一行)。因而，我們證明了能夠使用兩種不同的MV結(jié)合配體捕獲從癌細胞脫落的MV。
[0080]我們還檢測了 tTG 本身是否能夠用于捕獲從癌細胞脫落的W。為了做到這一點，我們使用細菌中常規(guī)的重組蛋白合成方法制備了具有His標簽的重組tTG。我們將這種具有His標簽的重組tTG與鎳珠結(jié)合并檢測重組tTG是否還能夠用于從收集自癌細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中分離MV。就這一點而言，圖50中的后兩行表明事實的確如此，如圖所示，在這些樣品道中檢測到了脂筏標記蛋白(從上數(shù)第三行)。因而，圖50中的數(shù)據(jù)確定了 tTG的純化重組形式能夠用作捕獲從癌細胞脫落的MV的試劑。圖50中的數(shù)據(jù)還證明了針對tTG或纖連蛋白的抗體能夠用作分離從癌細胞脫落的MV的特異性結(jié)合配體。
[0081]對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，至少從圖50中顯而易見的是，本發(fā)明的某些方面提供了重組tTG或其衍生物從樣品中捕獲MV或其他膜結(jié)構(gòu)的用途。人tTG的氨基酸序列為:
I maeelvlerc dleletngrd hhtadlcrek lvvrrgqpfw ltlhfegrny easvdsltfs
61 vvtgpapsqe agtkarfplr daveegdwta tvvdqqdctl slqlttpana piglyrlsle
121 astgyqgssf vlghfillfn awcpadavyl dseeerqeyv ltqqgfiyqg sakfiknipw
181 nfgqfedgil diclilldvn pkflknagrd csrrsspvyv grvvsgmvnc nddqgvllgr
241 wdnnygdgvs pmswigsvdi lrrwknhgcq rvkygqcwvf aavactvlrc lgiptrvvtn
301 ynsahdqnsn llieyfrnef geiqgdksem iwnfhcwves wmtrpdlqpg yegwqaldpt
361 pqeksegtyc cgpvpvraik egdlstkyda pfvfaevnad vvdwiqqddg svhksinrsl421 ivglkistks vgrderedit htykypegss eereaftran hlnklaekee tgmamrirvg
481 qsmnmgsdfd vfahitnnta eeyvcrlllc artvsyngil gpecgtkyll nlnlepfsek
541 svplcilyek yrdcltesnl ikvrallvep vinsyllaer dlylenpeik irilgepkqk
601 rklvaevslq nplpvalegc tftvegaglt eeqktveipd pveageevkv rmdllplhmg
661 lhklvvnfes dklkavkgfr nviigpa (SEQ ID NO:1).本發(fā)明包括使用全長的重組生產(chǎn)的tTG作為結(jié)合劑。本發(fā)明還包括使用tTG衍生物。適用于本發(fā)明的tTG衍生物包括但不一定限于對序列SEQ ID NO:1的缺失、插入、和保守性氨基酸取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到在不影響其捕獲MV和其他膜結(jié)構(gòu)效用的前提下可以對所述序列作出多種修飾。例如，可以對tTG序列進行修飾以包括便于蛋白純化的基于氨基酸的標簽如His-標簽。還包括具有改善的酶活性的tTG的突變形式。例如，在一個實施方式中，在本發(fā)明中使用的突變的tTG是轉(zhuǎn)酰胺基作用(交聯(lián))缺陷的tTG。轉(zhuǎn)酰胺基作用缺陷tTG蛋白的氨基酸序列是本領(lǐng)域公知的。在一個實施方式中，所述的轉(zhuǎn)酰胺基作用缺陷tTG包括選自以下的突變:半胱氨酸277變?yōu)槔i氨酸(C277V)、半胱氨酸277變?yōu)榻z氨酸(C277S)、天冬氨酸306和天冬酰胺310變?yōu)楸彼岬碾p突變(D306A/N310A，也將其稱為雙位點突變體)、以及這些突變的組合。在另一個實施方式中，所述tTG衍生物是tTG的纖連蛋白結(jié)合缺陷形式。此類tTG衍生物包括SEQ ID NO:1的序列，但缺乏SEQ ID NO:1的前7個氨基酸。在其他實施方式中，本發(fā)明中使用的tTG衍生物包括或由tTG的氨基酸殘基1-139 (所謂的N-末端β-夾心結(jié)構(gòu)域)或氨基酸1-200組成。就這一點而言，我們已經(jīng)證明了當在細胞中表達時，這些tTG的截短形式具有較強的與質(zhì)膜結(jié)合的能力(即，見圖51和下面的描述)。因而，根據(jù)本發(fā)明預(yù)計這些tTG衍生物將能夠從樣品中捕獲MV和其他膜結(jié)構(gòu)。
[0082]任意適宜的tTG或FN結(jié)合配體或tTG或其衍生物，或其組合物都可以被用來確定樣品中是否包括與tTG相結(jié)合的微泡。在本發(fā)明的某些方面，僅使用一種類型的結(jié)合配體。除了 tTG和/或FN的特異性結(jié)合配體，與tTG或FN以外的微泡標記物結(jié)合的結(jié)合配體也可以被用來確定樣品中是否包括與tTG相結(jié)合的微泡。例如，無論被捕獲的微泡是否與tTG相結(jié)合，可以使用能夠特異性識別tTG或FN以外的微泡標記物的抗體或其抗原結(jié)合片段以捕獲微泡。這種識別tTG或FN以外的微泡標記物的結(jié)合配體可稱為是一般性微泡結(jié)合配體。在不同實施方式中，一般性MV結(jié)合配體可以是⑶63或脂筏標記蛋白。一般性微泡結(jié)合配體可以被用來獲得第 一微泡群。第一微泡群可以是未與tTG結(jié)合的均質(zhì)微泡，或與tTG結(jié)合的均質(zhì)微泡，或者可以是混合的微泡群，其中的一些微泡與tTG結(jié)合，一些微泡未與tTG結(jié)合。第一微泡群可以使用任意適宜的技術(shù)來檢測其中是否存在tTG。存在tTG表明第一微泡群中包括與tTG結(jié)合的微泡。同樣地，缺乏tTG表明第一群中不包含與tTG結(jié)合的微泡。如有需要，可以測定第一微泡群中與tTG結(jié)合的微泡的量。例如，可以檢測第一微泡群中tTG的量(如果存在)并以此測定第一微泡群中與tTG結(jié)合的微泡的量。在另一個實施方式中，可以使用tTG和/或FN特異性結(jié)合配體對第一微泡群進行進一步分離以獲得第二微泡群。在此，通過從第一微泡群獲得與tTG結(jié)合的第二微泡群，可以相應(yīng)的富集含有tTG和/或FN的微泡?；蛘撸梢允褂胻TG和/或FN結(jié)合配體處理一個以上樣品，以獲得富集了與tTG結(jié)合的微泡的組合物。
[0083]本發(fā)明的一個實施方式提供了一種使用tTG或tTG的衍生物捕獲從細胞脫落的任意膜結(jié)構(gòu)的方法。這一方法部分的基于我們的論證，即如上文所述的tTG能夠用于捕獲從癌細胞脫落的MV。針對本發(fā)明的這個方面，我們檢測了 tTG直接與質(zhì)膜結(jié)合的能力，以及其完成這一過程是否需要其他蛋白。這項分析的結(jié)果見圖51。為獲得這些結(jié)果，我們將純化的重組野生型tTG (tTG WT)，或作為對照的牛血清白蛋白(BSA)，與合成得到的脂質(zhì)體組合在一起，所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)組分與哺乳動物細胞質(zhì)膜的內(nèi)層類似。經(jīng)過短暫的培養(yǎng)后，離心使所述囊泡成團，然后將所得的上清和團塊用SDS-PAGE分離并用Quick Blue染色以檢測蛋白。圖51顯示tTG對脂質(zhì)具有相對較高的親和性，幾乎所有的重組tTG (tTG WT)均與合成囊泡成團。另一方面，牛血清白蛋白(BSA)僅與脂質(zhì)體較弱成團，大部分對照蛋白仍保留在上清中。因而，我們證明了 tTG不僅能夠用于分離從癌細胞脫落的MV，還能夠用于分離沒有任何細胞組分的合成膜結(jié)構(gòu)。因而，在本發(fā)明的一個實施方式中，重組tTG構(gòu)成了一般的膜結(jié)構(gòu)結(jié)合配體。
[0084]在不同實施方式中，可以采用檢測蛋白的多種方法中的任意一種來測定樣品中是否存在tTG和/或交聯(lián)的FN，如免疫檢測法，包括但不限于免疫印跡、用于蛋白檢測的多孔檢測板、用于蛋白檢測的小珠、用于蛋白檢測的橫流裝置或檢測條、ELISA檢測、或任意其他改進的免疫檢測或適于檢測蛋白的其他檢測類型。考慮到本申請的優(yōu)點，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到這些或其他檢測方法可以包括使用一種或多種本申請所述的tTG或FN結(jié)合配體。在不同實施方式中，所述的一種或多種結(jié)合配體可以與基質(zhì)可逆地或不可逆地結(jié)合，如使用通過酰胺或酯鍵共價鍵合、離子吸引、或吸附的方法將所述結(jié)合配體共價地、離子地、或物理地結(jié)合于固相免疫吸附劑。所述基質(zhì)可以是結(jié)合配體能夠附著于其上的任意適宜的基質(zhì)。例子包括通常用于免疫檢測測定、橫流裝置、基于小珠的檢測等的基質(zhì)。所述固體基質(zhì)可以是允許液體流過所述基質(zhì)的多孔固體基質(zhì)。所述液體能夠通過任意適宜的方法流過所述多孔基質(zhì)，如通過毛細管作用、微流體等。所述基質(zhì)還可以是非多孔性固體基質(zhì)，如由玻璃或其他非多孔性材料形成的小珠。
[0085]本發(fā)明包括一種檢測組分的用途，根據(jù)本發(fā)明其能夠被用于多種分析手段，所述分析手段適于檢測是否存在與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的微泡。例如，所述檢測組分可以是用于檢測在與特異性結(jié)合配體結(jié)合狀態(tài)下的tTG和/或交聯(lián)的FN的任意試劑。在一些實施方式中，所述檢測組分包括放射性標記、熒光標記、或化學發(fā)光標記或基質(zhì)。在一些實施方式中，所述檢測組分可以是與本發(fā)明的結(jié)合配體連接的基質(zhì)的一部分。例如，可以使用包括可檢測標記的一個或多個小珠，所述可檢測標記例如熒光標記、條碼、或者能夠確定小珠和是否存在tTG和/或交聯(lián)的FN的其他方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到此類試劑配置允許進行多道檢測。
[0086]通過本發(fā)明的方法可以將tTG和/或交聯(lián)的FN的量，和/或tTG陽性MV和/或交聯(lián)的FN的MV的量與參照物進行比較。參照物的檢測可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任意方法。在不同實施方式中，可以與參照物進行比較以確定tTG交聯(lián)FN陽性微泡的存在和/或其量的預(yù)后意義。例如，所述參照物可以是tTG交聯(lián)的FN的參考水平或tTG陽性交聯(lián)的FN陽性的囊泡的參考水平。所述參考水平可以是已知的值或值的范圍，或者可以是測定值或值的范圍，該值可以從例如一個或多個已知未患有癌癥、或者無tTG陽性微泡和/或交聯(lián)的FN陽性微泡的主體，或者從一個或多個患有不同類型和/或處于不同癌癥分期的主體測得。在一些實施方式中，所述參考水平是從一組患有癌癥的主體中測定的平均水平，所述癌癥如特定類型的癌癥和/或特定分期的癌癥。所述參照可以構(gòu)成對照，如無tTG和/或交聯(lián)的FN或者無tTG交聯(lián)的FN陽性的微泡的對照樣品，或加入已知量的tTG和/或交聯(lián)的FN或者tTG和/或交聯(lián)的FN陽性的微泡的對照樣品。
[0087]本發(fā)明預(yù)計能夠用于多種腫瘤疾病。例如，tTG和交聯(lián)的FN陽性的微泡預(yù)計與多種實體腫瘤相關(guān)。而且，在分離得到微泡的個體中，tTG和交聯(lián)的FN陽性的微泡預(yù)計能夠提示轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移的風險。
[0088]在某些實施方式中，本發(fā)明提供了一種將個體診斷為具有tTG陽性、或交聯(lián)的FN陽性、或tTG陰性、或交聯(lián)的FN陰性的循環(huán)微泡的方法。該方法包括檢測獲取自個體的樣品中的與微泡結(jié)合的tTG和/或交聯(lián)的FN，如果存在tTG和/或交聯(lián)的FN則將所述個體鑒定為具有與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的循環(huán)微泡，如果樣品中不存在tTG和/或交聯(lián)的FN則將所述個體鑒定為不具有與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的循環(huán)微泡。循環(huán)微泡被認為可以穿行通過個體的血液或其他體液。在一個實施方式中，使用所述方法分析的所述個體的樣品來自已診斷為患有癌癥且正在進行癌癥治療的個體。
[0089]本發(fā)明對癌癥的類型沒有特殊限制，只要所述癌癥涉及tTG和/或交聯(lián)的FN陽性的微泡的形成。本發(fā)明預(yù)計可用于診斷、預(yù)測和研發(fā)受推薦的治療干預(yù)。在這一點上，本發(fā)明預(yù)計對以下癌癥有價值，所述癌癥的例子包括但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假性粘液瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、頭頸部癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胸腺瘤、和華氏巨球蛋白血癥。
[0090]本發(fā)明的另一個方面提供了一種在個體中抑制物質(zhì)從含有tTG的微泡轉(zhuǎn)移至所述個體中的一個或多個細胞的方法。抑制物質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法包括但不一定限于抑制tTG陽性微泡與細胞對接?；蛘弋斔黾毎c微泡完全或部分對接時，抑制微泡的一些或全部內(nèi)容物進入細胞。該方法包括給予個體包含tTG抑制劑的組合物。在一個實施方式中，所述tTG抑制劑是具有細胞不透性的抑制劑。在一個實施方式中，將所述組合物給予已診斷為患有、疑似患有、或存在癌癥風險的個體。在一個實施方式中，給予所述組合物以抑制個體中癌細胞的轉(zhuǎn)移和/或抑制轉(zhuǎn)移灶的形成。
[0091]給予包含具有細胞不透性的tTG抑制劑的組合物時，所述個體可以是需要抑制tTG的個體，和/或已診斷為患有、疑似患有、或存在發(fā)展成與tTG陽性微泡相關(guān)的病癥或其他疾病風險的個體，包括但不一定限于本申請所述的所有癌癥。在一個實施方式中，給予所述組合物的個體不存在自身免疫性疾病和/或此前未接受過針對自身免疫性疾病的治療。在某些例子中，所述個體未接受，和/或過去和目前均未接受過針對腹腔疾病的治療。在某些例子中，所述個體是此前未給予過能夠特異性抑制tTG試劑的個體。
[0092]所述具有細胞不透性的tTG抑制劑可以是能夠特異性抑制tTG的交聯(lián)活性的抑制劑或在空間上發(fā)揮作用如通過阻斷tTG與例如細胞表面受體發(fā)生相互作用以干擾tTG陽性微泡與細胞對接的試劑。在一個實施方式中，所述具有細胞不透性的tTG抑制劑是生物試齊U，如抗tTG抗體，或其tTG結(jié)合片段。抗體的tTG結(jié)合片段如上文所述，預(yù)計其適于治療目的。所述抗體或其抗原結(jié)合片段本質(zhì)上可以是單克隆的，或重組產(chǎn)生的抗體或抗原結(jié)合片段。這些試劑相對于其氨基酸部分可以是嵌合的、部分人源化的或完全人源化的。在不同實施方式中，所述抑制劑是能夠特異性識別與tTG相結(jié)合的微泡的抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個實施方式中，所述抑制劑是能夠識別tTG和交聯(lián)的FN的復(fù)合物的抗體或其抗原結(jié)合片段，在特定的例子中其可以是與微泡相結(jié)合的。
[0093]在另一個方面，所述tTG抑制劑是能夠特異性抑制tTG的交聯(lián)活性的小分子。在一個實施方式中，所述tTG抑制劑是本領(lǐng)域公知的T101。TlOl可以從Zedira購得(Darmstadt，德國)。其他tTG抑制劑包括但不一定限于Zedira的化合物B0C_D0N(B003)，或化合物KCC009，在Yuan等發(fā)表的Oncogene (2007) 26，2563 - 2573中對其進行了描述。
[0094]在組合物如藥物制劑中可以提供所述的tTG抑制劑?？梢酝ㄟ^將所述抑制劑與任意適宜的藥學上可接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑混合制備用于治療目的的組合物。適于與所述藥物混合的組分的一些例子可以參見Remington:The Science and Practice ofPharmacy (2005)第 21 版，Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到本發(fā)明的方法中使用的任意tTG抑制劑特定給藥方案的形式和特征將由給藥途徑和其他已知變量決定，需要考慮這些因素如所治療個體的體型、性別、健康狀況和年齡、和所述個體可能疑似患有或可能被診斷為患有的疾病的類型和分期。根據(jù)這一標準，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定給予所述個體的組合物的有效量。
[0095]所述包含tTG抑制劑的組合物可以使用任意可用的方法和途徑給予個體，包括口月艮、胃腸外、皮下、腹腔、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和顱內(nèi)注射。胃腸外輸液包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、和皮下給藥。本發(fā)明的方法可以在常規(guī)的抗癌療法之前、同時、或之后實施，所述常規(guī)的抗癌療法包括但不限于化療、外科手術(shù)、和放療。
[0096]在不同實施方式中，本發(fā)明包括將樣品中是否含有與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的微泡的檢測結(jié)果固定在有形介質(zhì)中。所述有形介質(zhì)可以是任意類型的有形介質(zhì)如任意類型的數(shù)字介質(zhì)，包括但不限于DVD、CD-ROM、便攜式閃存設(shè)備等。本發(fā)明包括向醫(yī)療服務(wù)人員提供有形介質(zhì)以便其對提供tTG陽性微泡樣品的個體提供推薦的治療方案。
[0097]在不同實施方式中，本發(fā)明提供了用于測定包含與tTG和/或交聯(lián)的FN相結(jié)合的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)的組合物的試劑盒。所述試劑盒可以包括用于捕獲包含tTG和/或交聯(lián)的FN的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)的試劑，如一個或多個tTG和/或交聯(lián)的FN的特異性結(jié)合配體。所述試劑盒還可以包括重組的tTG或其衍生物。用于檢測微泡的特異性結(jié)合配體和試劑可以盛放在一個或多個密封的、無菌小瓶中。所述試劑盒可以包括用于檢測微泡和/或包含微泡的樣品中是否存在tTG和/或交聯(lián)的FN的說明書。因而，所述試劑盒可以包括對tTG和/或交聯(lián)的FN陽性的微泡進行免疫檢測的工具，如與本文所述的一種或多種結(jié)合配體復(fù)合的小珠或橫流裝置。
[0098]本發(fā)明的另一個方面涉及一種包括分離的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)群的組合物，其中所述微泡或其他膜結(jié)構(gòu)包含tTG和/或交聯(lián)的FN，并且其中所述分離的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)群與tTG或其衍生物，或者tTG和/或交聯(lián)的FN結(jié)合配體相連接。作為替代方案，除了與tTG或其衍生物，和/或tTG或交聯(lián)的FN結(jié)合配體相連接的微泡或其他膜結(jié)構(gòu)以外，本發(fā)明的組合物還包括分離的微泡群，其中所述微泡包含tTG和交聯(lián)的FN，并且其中所述分離的微泡群與FN結(jié)合配體相連接。如上文更為詳細的描述，在此類組合物的不同實施方式中tTG結(jié)合配體和/或FN結(jié)合配體可以與固體基質(zhì)連接。
[0099]下文中的實施例是用于解釋本發(fā)明。其并非旨在以任何方式進行限定。
實施例1
[0100]本實施例中的結(jié)果由采用實施例3中所述的材料和方法進行的實驗獲得。
[0101]我們通過掃描電子顯微鏡(SEM)(圖1，左圖)或?qū)-肌動蛋白染色的細胞使用熒光顯微鏡(圖1，右圖)對高侵襲性人乳腺癌細胞系MDAMB231的血清饑餓的培養(yǎng)物進行分析，結(jié)果顯示?35%的細胞表面存在直徑尺寸范圍為?0.2-2.0微米的MV (圖2)。在?25%的去血清的U87人膠質(zhì)瘤細胞上也檢測到了 MV，這些MV的形成需要通過由HeLa宮頸癌細胞分泌的表皮生長因子(EGF)刺激來誘導(dǎo)(圖2和3)。與之相反，在血清饑餓或EGF刺激條件下培養(yǎng)的正常NIH3T3成纖維細胞的表面未檢測到MV，這表明某些細胞類型可能不產(chǎn)生MV。而且，實驗表明MV從這些癌細胞上活躍地脫落，延時拍攝的圖像顯示(圖4)，GFP標記的MV從轉(zhuǎn)染了編碼Lyn酪氨酸激酶的質(zhì)膜靶序列的pEGFP質(zhì)粒(GFP-PM)的MDAMB231細胞的質(zhì)膜釋放，免疫印跡分析(圖5)和熒光激活細胞分選(FACS)分析(圖30和31)也表明，在從僅表達PEGFP的空載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細胞中收集到的培養(yǎng)基中也檢測到了含GFP的MV。
[0102]根據(jù)此前關(guān)于MV在癌細胞之間分享其轉(zhuǎn)運物質(zhì)的報道，我們檢測了 MV是否能夠把供體癌細胞的某些轉(zhuǎn)化特性賦予正常的(非轉(zhuǎn)化的)受體細胞。因而，我們從MDAMB231乳腺癌細胞和U87腦腫瘤細胞的無血清培養(yǎng)基中分離出組成性脫落的MV (圖6)并將其加入未轉(zhuǎn)化的NIH3T3成纖維細胞的培養(yǎng)物中。由這兩種癌細胞系產(chǎn)生的MV都能夠促進受體成纖維細胞中信號蛋白激酶AKT和ERK活性(圖7)，這與此前將來源于癌細胞的MV與其他癌細胞或內(nèi)皮細胞培養(yǎng)時觀察到的結(jié)果類似。而且，當NIH3T3成纖維細胞在添加有來源于MDAMB231細胞或U87細胞的MV的培養(yǎng)物中培養(yǎng)時，其表現(xiàn)出兩種癌細胞的表型特性，即增強的存活能力(圖8)和在低血清條件下生長的能力(圖9)。通過測定錨定非依賴性生長(即，在軟瓊脂上的集落形成)，我們進一步檢測了來源于癌細胞的MV是否能夠誘導(dǎo)正常細胞的轉(zhuǎn)化。圖10和11表明使用從MDAMB231細胞或U87細胞中收集的MV持續(xù)處理成纖維細胞后能夠賦予其在錨定非依賴性的條件下生長的能力，作為對照，正常條件下NIH3T3成纖維細胞不能在軟瓊脂上形成集落。來源于MDAMB231細胞的MV同樣能促進正常人乳房上皮細胞系MCFlOA的存活(圖32)和異常生長(圖33)。因而，MV介導(dǎo)的由癌細胞向正常細胞持續(xù)性的轉(zhuǎn)運物質(zhì)轉(zhuǎn)移確實賦予了正常細胞由致癌性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的特性。
[0103]然后，我們分析了哪種與MV相結(jié)合的蛋白負責介導(dǎo)轉(zhuǎn)化能力的轉(zhuǎn)移。因為已有發(fā)現(xiàn)表明通過MV能夠在腦癌細胞之間共享EGF-受體的活化形式，我們最初認為EGF-受體是可能的候選蛋白。然而，因為在從U87細胞脫落的MV中無法檢測到活化的EGF-受體(圖6)，EGF-受體可能不是導(dǎo)致來源于MDAMB231乳腺癌細胞和U87成膠質(zhì)瘤細胞的MV具有相似轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)(圖8-11)。進一步支持上述觀點的發(fā)現(xiàn)是，EGF-受體酪氨酸激酶抑制劑AG1478不能抑制由來源于U87細胞的MV給予的NIH3T3細胞的錨定非依賴性生長優(yōu)勢(圖34)。
[0104]為鑒定可能參與了這些MV的轉(zhuǎn)化作用的蛋白，我們進行了蛋白質(zhì)組篩選。在實施例3中列出了來源于MDAMB231細胞和U87細胞的MV所共有的蛋白。值得注意的是，在與MV相結(jié)合的蛋白中包括了 tTG。tTG是一種與某些癌細胞所表現(xiàn)出的化學抗性和異常細胞生長相關(guān)的蛋白交聯(lián)酶，其以一種未知的機制從細胞中分泌。我們已通過免疫印跡分析確定tTG是來源于MDAMB231和U87細胞的MV的一種組分(圖12)，并且證明當使用tTG抗體進行免疫染色時可以檢測到MDAMB231細胞表面的MV (圖13，上圖)，作為對照僅使用二抗染色時無法檢測到MV (圖13，左下圖)。同樣地，U87細胞和經(jīng)EGF刺激的HeLa宮頸癌細胞產(chǎn)生的MV也含有tTG (圖14)。與GFP對照相比，GFP標記的tTG能夠更加有效地摻入MDAMB231脫落的MV中(圖15)。綜合上述發(fā)現(xiàn)，我們證明了 tTG特異性的存在于多種類型癌細胞產(chǎn)生的MV并且其對特定的細胞培養(yǎng)條件產(chǎn)生應(yīng)答。
[0105]如圖13所示，在細胞活化形式的MV中使用tTG抗體檢測到的環(huán)形染色表明tTG通常富集在MV的膜中。相同的tTG抗體還對從非透性化的MDAMB231細胞的質(zhì)膜上突出的MV進行了標記(圖16)。通過免疫電子掃描顯微鏡(SEM)，相同抗體還在從MDAMB231細胞分離的單個MV的表面檢測到了 tTG (圖35)。圖17中的頂部顯示，根據(jù)其催化生物素化的戊胺(BPA)摻入酪蛋白的能力，我們判斷在MDAMB231細胞的全細胞裂解物(WCL)中，或在從這些細胞脫落的完整的MV中表達的tTG具有酶活性。使用具有細胞透性的tTG抑制劑單丹酰尸胺(MDC)對完整的來源于MDAMB231細胞的MV進行預(yù)處理極大降低了在所述試驗中檢測到的BPA標記的酪蛋白的水平。有趣的是，細胞不透性的tTG抑制劑TlOl (圖36和37)也有效阻斷了 tTG與來源于MDAMB231細胞的MV結(jié)合的交聯(lián)活性(圖17)，這表明tTG主要在MV的外側(cè)單層膜定位和活化。
[0106]通過對與tTG相結(jié)合的囊泡進行免疫熒光染色來監(jiān)測MV的形成，我們發(fā)現(xiàn)來源于MDAMB231乳腺癌細胞的MV對阻斷Arf GTPase活性的傳統(tǒng)分泌抑制劑BFA或ExoI不敏感(圖38)。這表明tTG交聯(lián)蛋白的能力可能對癌細胞形成和/或脫落MV很重要，我們接下來檢測了這一可能性。使用tTG抗體的免疫熒光分析揭示將MDAMB231細胞暴露于tTG的抑制劑MDC和TlOl對MV的形成沒有影響(圖38)。并且，從MDAMB231細胞脫落MV既不需要tTG的酶活性，也不受ExoI或BFA的影響，這體現(xiàn)在從對照細胞或經(jīng)不同抑制劑處理的細胞的培養(yǎng)基中分離的MV中檢測到了幾乎等量的MV標記物脂筏標記蛋白-2和tTG (圖39，左圖和右圖)。相應(yīng)地，根據(jù)脂筏標記蛋白-標記物的讀數(shù)，如果從MDAMB231細胞中敲除tTG，從而消除tTG在MV中的表達，從這些細胞中脫落的MV的量幾乎沒有改變(圖39，中圖)。而且，當缺乏交聯(lián)底物(tTG C277V)或與GTP結(jié)合(tTG R580L)能力的tTG突變體在MDAMB231細胞中異位表達時，其與異位表達的野生型tTG同樣能有效地靶向至MV(圖40)。因而，這些結(jié)果表明tTG并非癌細胞形成或脫落MV的能力所必須的，tTG靶向至MV也不需要其酶活性。
[0107]接下來我們檢測了 tTG是否是MV的轉(zhuǎn)運物質(zhì)并被轉(zhuǎn)移至受體細胞。我們將NIH3T3成纖維細胞與MV培養(yǎng)30分鐘，然后通過免疫印跡分析(圖18和41)和免疫熒光顯微鏡(圖42)分析tTG的表達，結(jié)果顯示所述MV來源于MDAMB231細胞或U87細胞的血清饑餓的培養(yǎng)物。這些實驗的結(jié)果顯示與在對照成纖維細胞中幾乎檢測不到的tTG水平相比，與來源于癌細胞的MV培養(yǎng)后成纖維細胞中的tTG水平顯著增加。
[0108]然后根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，我們提出的問題是MV介導(dǎo)的活化的tTG轉(zhuǎn)移至受體成纖維細胞是否可能對賦予這些細胞增強的存活能力和轉(zhuǎn)化特性具有重要意義。利用我們的發(fā)現(xiàn)即tTG定位于MV表面，這樣其交聯(lián)活性易于被具有細胞不透性的、不可逆的抑制劑TlOl所抑制(參見圖13、16和17)。在將來源于癌細胞的MV加入成纖維細胞培養(yǎng)物之前，使用TlOl對來源于癌細胞的MV進行預(yù)處理可以選擇性的和不可逆的抑制tTG與MV相結(jié)合的交聯(lián)活性(圖19和43)。使用這種方法，我們比較了在tTG的活性被抑制的條件下，由從癌細胞收集的MV為NIH3T3成纖維細胞帶來的增強的存活能力將受到怎樣的影響。圖20和44顯示，使用TlOl對來源于MDAMB231或U87細胞的MV進行預(yù)處理嚴重削弱了其保護受體成纖維細胞免受由無血清誘導(dǎo)的細胞死亡的能力。重要的是，在添加了正常量胎牛血清(2%CS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)NIH3T3細胞所達到的細胞存活程度并沒有因加入TlOl而發(fā)生改變，這表明這種小分子抑制劑消除來源于癌細胞的MV提供的保護作用的能力并不是由于使成纖維細胞對細胞凋亡敏化的脫靶效應(yīng)。然后我們進行了類似的實驗，其中在存在細胞不透性的tTG抑制劑MDC的條件下將來源于MDAMB231細胞的MV與血清饑餓的NIH3T3細胞培養(yǎng)(圖20)，或者將收集自tTG已被敲除的MDAMB231細胞(參見圖39)中的MV加入血清饑餓的NIH3T3細胞中(圖45)?？偟膩碚f，這些實驗的結(jié)果表明tTG在介導(dǎo)存活優(yōu)勢中起到了關(guān)鍵性作用，所述存活優(yōu)勢通過來源于癌細胞的MV賦予成纖維細胞。
[0109]然后我們檢測了來源于癌細胞MV的轉(zhuǎn)化能力是否依賴于tTG。如圖10和33，以及圖21、46和47所示，將正常NIH3T3成纖維細胞和MCFlOA上皮細胞與來源于MDAMB231細胞或U87細胞的MV —起培養(yǎng)誘導(dǎo)正常細胞產(chǎn)生了在錨定非依賴性條件下生長的能力(即，形成集落)。然而，當將受體成纖維細胞或上皮細胞與經(jīng)過TlOl預(yù)處理的MV制備物(圖21、33、和47)，或者其中tTG已被敲除的MV制備物(圖46)—起培養(yǎng)，則在各種情況下形成的集落數(shù)均減少。為進一步驗證這一結(jié)果，我們的實驗顯示TlOl不會抑制一般性的細胞轉(zhuǎn)化。一般性的細胞轉(zhuǎn)化由表達小GTPase Cdc42 (Cdc42F28L)的活化形式的NIH3T3細胞在錨定非依賴性條件下的生長能力表示。我們的實驗顯示即使使用了過量5倍的T101，該抑制劑也不會影響表達Cdc42F28L的NIH3T3細胞在錨定非依賴性的條件下生長的能力(圖48)。
[0110]這些發(fā)現(xiàn)促使我們隨后去考慮是否來源于癌細胞的MV可能在體內(nèi)也起到類似的作用并且通過使在腫瘤微環(huán)境中的正常細胞獲得形成腫瘤的能力以促進腫瘤生長。為研究這個問題，可以利用以下事實:在將MDAMB231細胞注射到裸鼠體內(nèi)前，將MDAMB231細胞暴露于有絲分裂阻滯劑絲裂霉素C，從而抑制其在一定條件下形成腫瘤的能力，在所述條件下其對照物(未經(jīng)處理的MDAMB231細胞)能非常有效地誘導(dǎo)腫瘤形成(圖25)。然而，當將經(jīng)絲裂霉素C處理的MDAMB231細胞與相等數(shù)量的正常(未經(jīng)轉(zhuǎn)化的)NIH3T3成纖維細胞共同注射至小鼠體內(nèi)時，6只小鼠中有4只形成了腫瘤，這表明從有絲分裂阻滯的癌細胞脫落的MV能夠?qū)е锣徑腘IH3T3成纖維細胞轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)腫瘤生長。有趣的是，隨后發(fā)現(xiàn)在有絲分裂阻滯的MDAMB231細胞中敲除tTG的表達阻止了共同注射的NIH3T3成纖維細胞在小鼠中形成腫瘤。因而，這些結(jié)果與以下觀點一致:癌細胞能夠在體內(nèi)產(chǎn)生MV，并且其導(dǎo)致在腫瘤微環(huán)境中的正常細胞促進腫瘤形成的能力依賴于tTG。
[0111]這些發(fā)現(xiàn)表明MV介導(dǎo)的tTG向受體細胞的轉(zhuǎn)移是來源于MDAMB231細胞和U87細胞的MV轉(zhuǎn)化成纖維細胞的能力所必須的。然后我們檢測了是否單獨的tTG就足以賦予受體細胞存活和轉(zhuǎn)化的能力。我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達具有Myc標簽的tTG的NIH3T3成纖維細胞確實對由去血清誘導(dǎo)的凋亡具有抗性(圖22)，使用MDC處理細胞后該抗性作用消失(圖23)，但是其在軟瓊脂上不能形成集落，這與將來源于MDAMB231細胞的MV與表達對照載體的成纖維細胞一起培養(yǎng)后得到的結(jié)果不同(圖24)。這表明盡管在正常細胞中tTG的過度表達/過度活化不足以完全誘導(dǎo)正常細胞轉(zhuǎn)化(即，異位表達tTG的NIH3T3細胞未獲得在錨定非依賴性條件下生長時形成集落的能力)，但是其能將轉(zhuǎn)化狀態(tài)的某些特性賦予正常細胞，使正常細胞能夠在低血清條件下單層生長，以及對由無血清誘導(dǎo)的細胞死亡的敏感性減弱。然而，這些發(fā)現(xiàn)還表明為了能使受體細胞顯示出細胞轉(zhuǎn)化的主要標志之一即錨定非依賴性生長，來源于癌細胞的MV還可能將另一種蛋白與tTG—同轉(zhuǎn)移。細胞骨架組分FN是一個特別有吸引力的候選物，因為其是tTG已知的結(jié)合配體并且其在來源于MDAMB231細胞和U87細胞的MV的蛋白質(zhì)組學篩選中得到了鑒定(參見實施例3)。我們已通過免疫印跡分析確證FN在收集自各種癌細胞系中的MV中表達(圖12)。然后，通過使用RGD-肽作為干擾FN與受體成纖維細胞表面的活化整合素結(jié)合能力的工具，我們對與MV相結(jié)合的FN在賦予成纖維細胞顯示出錨定非依賴性生長的能力中的潛在作用進行了評估。在同時使用來源于MDAMB231或U87細胞的MV和RGD-肽或者對照RGE-肽中的一種來處理的成纖維細胞中進行錨定非依賴性生長檢測，結(jié)果顯示RGD-肽與TlOl—樣阻斷了 MV觸發(fā)的對細胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用，而對照肽則不能(圖21和47)。
[0112]由于tTG和FN對來源于癌細胞的MV轉(zhuǎn)化受體細胞的能力均具有重要作用，因而我們檢測了是否其可能是合作引發(fā)了該細胞變化。為了解決這個問題，我們首先檢測了 tTG是否在MV中與FN存在相互作用。如此前報道的結(jié)果，圖26顯示FN與MDAMB231全細胞裂解物中的tTG以及這些細胞脫落MV的裂解物免疫共沉淀。除了與單體形式的FN結(jié)合以外，tTG還與表觀分子量為?440kDa的更大型的FN結(jié)合，其可能是交聯(lián)的FN 二聚體并且僅能在MV的裂解物中檢測到。在將MV裂解并將提取物進行免疫印跡分析前，使用tTG抑制劑TlOl對從MDAMB231細胞或U87細胞收集的完整的MV進行預(yù)處理，所述預(yù)處理對tTG與來自MV裂解物的單體FN進行免疫共沉淀的能力沒有影響(圖49)。然而，使用tTG抑制劑對MV進行預(yù)處理導(dǎo)致在MV裂解樣品中檢測到的?440kDa FN的量顯著降低(圖27)，這表明在來源于癌細胞的MV中更高分子量形式的FN是通過tTG與FN相互作用并交聯(lián)而產(chǎn)生。
[0113]FN的二聚作用極大增強了其結(jié)合和活化細胞表面的整合素的能力。在癌細胞脫落的MV中tTG交聯(lián)FN的能力提示FN的這種共價修飾形式具有加強整合素活化的能力。事實上，我們發(fā)現(xiàn)從去血清的MDAMB231細胞或U87細胞的培養(yǎng)基中分離的完整MV的制備物具有刺激信號活性的能力，所述信號已知是活化的整合素的下游信號包括FAK和ERK。而且，使用tTG抑制劑TlOl或干擾整合素信號的RGD肽能夠阻斷MV引起的這些激酶的活化，這進一步表明tTG和FN對MV的信號功能具有重要作用。
實施例2
[0114]該實施例對來源于MDAMB231細胞和U87細胞的MV中共同存在的蛋白進行了描述。使用MDAMB231乳腺癌細胞或U87腦腫瘤細胞脫落的MV進行蛋白質(zhì)組學分析。下面的名單是由從MDAMB231和U87細胞的MV中得到鑒定的那些蛋白編譯得到的(基于一般的細胞功能):對MDAMB231細胞和U87細胞脫落的微泡的蛋白質(zhì)組學分析:核酸結(jié)合蛋白；真核翻譯延伸因子I ;真核翻譯延伸因子2 ;組蛋白簇I ;組蛋白簇2 ;RuvB-樣蛋白I ;RuvB-樣蛋白2 ;細胞外基質(zhì)和質(zhì)膜相關(guān)蛋白；膜聯(lián)蛋白A2 ;CD9抗原；膠原蛋白；外_5’_核苷酸酶；包含EGF-樣重復(fù)和盤狀1-樣結(jié)構(gòu)域的蛋白3 ;纖連蛋白；半乳凝素3結(jié)合蛋白；整合素β I ；層粘連蛋白；賴氨酰羥化酶前體；主要組織相容性復(fù)合物；Na+/K+-ATP酶；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2亞型a ;代謝蛋白；醛縮酶A ;烯醇酶；鐵蛋白；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；L-乳酸脫氫酶A ;尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶前體；磷酸甘油酸激酶I ;丙酮酸激酶；UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；細胞骨架蛋白；肌動蛋白；輔肌動蛋白；伴侶蛋白；膜突蛋白；T-復(fù)合物蛋白I ;微管蛋白；波形蛋白；信號、傳輸、和其他功能蛋白；腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白；α -2-巨球蛋白前體；熱休克蛋白70kDa ;熱休克蛋白90kDa ；HtrA絲氨酸肽酶I前體；含有纈酪肽的蛋白。
實施例3
[0115]該實施例提供了對獲得實施例1中所述結(jié)果所使用的材料和方法的描述。
[0116]材料。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、布雷菲德菌素A、絲裂霉素-C、和Exol來自Calbiochem,而TlOl來自Zedira0與羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽、EGF> Lipofectamine、Lipofectamine2000、蛋白G小珠、對照和tTG siRNA、和所有的細胞培養(yǎng)試劑均來自Invitrogen15FN抗體、MDC、和BPA來自 SigmaotTG和肌動蛋白抗體來自 Lab Vision/Thermo。脂後標記蛋白_2抗體來自Santa Cruz,以及HA和Myc抗體來自Covance。SteriflipPVDF-濾膜(0.45 μ m孔徑)來自Millipore0針對I κ Ba、GFP的抗體，以及識別ERK, AKT,FAK和EGF受體的抗體來自Cell Signaling。
[0117]細胞培養(yǎng)。MDAMB231、U87、MCFlOA和HeLa細胞系在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中生長，而NIH3T3細胞系在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長。使用Lipofectamine將表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至細胞，而使用Lipofectamine2000將對照和tTG siRNA引入細胞。如所示的，將細胞與含0.1 μ g/ml EGF、100 μ M MDC、10yM TlOlUO μ M BFA、和10 μ M Exol組合的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。為阻滯MDAMB231細胞有絲分裂，使用10 μ g/ml的絲裂霉素-C處理細胞培養(yǎng)板2小時，隨后洗去該溶液并將細胞在生長培養(yǎng)基(含10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基)中恢復(fù)生長I天。
[0118]從癌細胞中分離微泡。對于使用MV制備物的各次實驗而言，從5.0xlO6個血清饑餓的MDAMB231細胞或U87細胞中(相當于兩個接近融合的150毫米培養(yǎng)皿的量)收集條件培養(yǎng)基并根據(jù)此前的描述從培養(yǎng)基中分離MV。簡言之，將條件培養(yǎng)基連續(xù)進行兩次離心；第一次為300gl0分鐘使完整的細胞成團，第二次為2，000g20分鐘使細胞碎片成團。為制備MV裂解物，在100，OOOg條件下對條件培養(yǎng)基第三次離心2小時，使用PBS洗滌所得團塊，然后在 250 μ I 細胞裂解緩沖液(25mM TrisUOOmM NaCl、l%Triton X-1OOUmM EDTAUmMDTTUmM NaV04、lmMi3-磷酸甘油、和lyg/mL抑肽酶)裂解。為制備用于基于細胞的檢測和所示其他實驗的完整MV，我們使用孔徑為0.45 μ m的Millipore Steriflip PVDF-濾膜對部分純化的條件培養(yǎng)基(已除去細胞和細胞碎片的培養(yǎng)基)進行過濾。然后將截留在PVDF膜上的微泡重懸于無血清培養(yǎng)基中，每次制備均能得到足夠的微泡以處理針對給定實驗的受體細胞的6孔板中的2-3孔。
[0119]免疫印跡分析和免疫沉淀。使用Bio-Rad DC蛋白檢測測定全細胞裂解物(WCL)的蛋白濃度，而通過將MV的裂解物從用于各個檢測的實驗條件的5.0xlO6個血清饑餓的MDAMB231細胞或U87細胞的條件培養(yǎng)基中分離，然后將其在250 μ I細胞裂解緩沖液中裂解，來對MV的裂解物進行歸一化以便進行比較。對于免疫沉淀而言，將等體積的MV裂解物或SOOyg WCL與tTG抗體和蛋白G小珠共同培養(yǎng)。在某些實施例中，將來自細胞的培養(yǎng)基與tTG或纖連蛋白抗體以及蛋白G小珠共同培養(yǎng)。對離心收集的小珠-抗體-蛋白復(fù)合物、以及WCL (40 μ g)和MV提取物(75 μ I)進行SDS-PAGE分離并將所述蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。將濾膜與在TBST (20mM Tris、135mM NaCl、和0.02%吐溫20)中稀釋的所述一抗共同培養(yǎng)。通過使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗隨后暴露于ECL試劑(AmershamBiosciences)對一抗進行檢測。
[0120]免疫熒光。使用3.7%的多聚甲醛對細胞進行固定，然后使用含0.l%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)對一些樣品進行透化處理。將透化和非透化樣品與tTG抗體培養(yǎng)，然后與俄勒R綠488偶聯(lián)的二抗培養(yǎng)。使用與羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽對肌動蛋白染色，使用DAPI進行核染色。使用熒光顯微鏡對細胞進行目測檢測，使用IPLABS獲取和處理圖像。
[0121]實時圖像熒光顯微鏡。使用熒光顯微鏡目測檢查瞬時表達GFP-PM的MDAMB231細胞，其為靶向Lyn中序列的質(zhì)膜的GFP標記形式。在15分鐘內(nèi)每30秒獲取一次轉(zhuǎn)染子的圖像。
[0122]轉(zhuǎn)酰胺基作用檢測。根據(jù)此前的描述通過摻入裂解蛋白的BPA讀取全細胞裂解物的轉(zhuǎn)酰胺基作用活性，使用分光光度檢測測定重組tTG (0.ΙμΜ)的轉(zhuǎn)酰胺基作用活性，所述重組tTG暴露于濃度漸增的TlOl。通過在含有40mM N’N-二甲基酪蛋白、2mM BPA、40mMCaCl2、和40mM 二硫蘇糖醇的緩沖液中將等量的(75 μ I)各MV樣品培養(yǎng)15分鐘讀取MV的轉(zhuǎn)酰胺基作用活性。通過加入Laemmli樣品緩沖液隨后煮沸終止反應(yīng)。然后通過SDS-PAGE分離反應(yīng)物并將所述蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。使用含10%牛血清白蛋白的BBST(100mM硼酸、20mM硼酸鈉、0.0P/oSDS,0.01%吐溫20、和80mM NaCl)封閉濾膜，然后在室溫條件下將其與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素培養(yǎng)I小時，隨后使用BBST充分洗滌，所述辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素使用含5%牛血清白蛋白的BBST稀釋。在將膜暴露于ECL試劑后目測檢查BPA摻入N’ N-二甲基酪蛋白的情況。
[0123]掃描電子顯微鏡(SEM)和免疫-SEM。使用在0.05M 二甲胂酸緩沖液(pH=7.4)中稀釋的2%EM-級戊二醛將在Lab-Tek腔室玻片(Nunc)上生長的MDAMB231細胞固定I小時。對于免疫-SEM而言，將過濾分離得到的來源于MDAMB231細胞的MV加入Lab-Tek腔室玻片，待其附著后，然后使用在PBS中的2%EM-級戊二醛固定I小時。在0.0lM甘氨酸中封閉15分鐘后，在含5%BSA、0.1%明膠和5%山羊血清的PBS中再封閉30分鐘后，將MV與在PBS中稀釋的tTG抗體(2 μ g/mL)培養(yǎng)I小時。使用PBS洗滌后，將MV樣品與在PBS中稀釋的6nm金粒子偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG (Electron Microscopy Sciences)培養(yǎng)I小時。使用在PBS中的1%的四氧化鋨將細胞和免疫標記的MV樣品后固定I小時并使用含25%、50%、70%、95%、和100%乙醇的梯度乙醇溶液脫水，隨后將其置于CPD-30臨界點干燥機(BAL-TECSCD050)上。然后使用鉬將細胞濺射鍍膜，使用無定形碳將免疫標記的MV濺射鍍膜，隨后在Leol550場發(fā)射掃描電子顯微鏡上觀察。
[0124]細胞生長檢測。將NIH3T3細胞以10X IO4個細胞/孔的密度接種于6孔板的各孔中并且將其置于含2%CS且添加或未添加來源于5.0XlO6個MDAMB231細胞或U87細胞的MV的DMEM培養(yǎng)基中。連續(xù)三天每日一次收集一組培養(yǎng)基并計數(shù)，并為其余細胞補充培養(yǎng)基(包括添加新分離的MV)。進行三次檢測并將所得結(jié)果取平均值和繪圖。
[0125]錨定非依賴性生長檢測。將與或未與來自5.0XlO6個MDAMB231細胞或U87細胞的MV培養(yǎng)的親代NIH3T3細胞或MCF10A細胞，或者穩(wěn)定過表達對照載體、野生型tTG、或Cdc42F28L的NIH3T3細胞以7 X IO3個細胞/ml的密度接種于培養(yǎng)板中，6孔板中已加入含0.6%瓊脂糖的生長培養(yǎng)基，上述細胞在含0.3%瓊脂糖，加入或不加所示的不同抑制劑的培養(yǎng)基中。連續(xù)12天每3天補充一次軟瓊脂培養(yǎng)基(包括加入新制備的MV和使用所示的不同抑制劑處理)，同時計數(shù)形成的集落數(shù)。各次檢測均至少進行三次并將所得結(jié)果取平均值和繪圖。
[0126]細胞死亡檢測。將NIH3T3細胞或MCFlOA細胞接種于6孔板的各孔中，然后使用含2%CS的培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，如文所示，所述培養(yǎng)基未添加或添加了來源于
5.0X106個MDAMB231細胞或U87細胞的MV以及未加入或加入MDC或TlOl。兩天后將培養(yǎng)基固定并用DAPI染色用于熒光顯微鏡觀察。通過核皺縮或起泡鑒定發(fā)生凋亡的細胞，通過計算各條件下凋亡細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值確定死亡細胞百分率。這些實驗至少進行三次并將各次實驗的結(jié)果平均值和繪圖。
[0127]流式細胞術(shù)。使用過濾法(上文所述)從5.0XlO6個模擬轉(zhuǎn)染的MDAMB231細胞或瞬時表達GFP的MDAMB231細胞的條件培養(yǎng)基中分離完整的MV并將其重懸于含0.1%BSA的PBS中。使用BD LSR II流式細胞儀通過細胞柵分選尺寸在?1-3 μ m之間的細胞并確定其是否表達GFP來對MV樣品進行評估。對各樣品收集至少500個細胞，然后使用BD FACSDiva軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗進行至少三次，從各次實驗中獲得相近的結(jié)果。
[0128]蛋白質(zhì)組學分析。使用SDS-PAGE分離來源于MDAMB231細胞和U87細胞的MV的裂解物(每個樣品?30yg)，然后根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的實驗步驟使用膠體藍染色試劑盒(Invitrogen)染色。從凝膠上切下蛋白，然后使用胰蛋白酶消化。在康奈爾蛋白質(zhì)組學實驗室使用4000Q阱(三重串聯(lián)四極桿線性離子阱)在線LC/MS/MS系統(tǒng)(Applied Biosystems/MDS Sciex)或Synapt HDMS系統(tǒng)(Waters)對所得的蛋白樣品進行分析。通過對NCBI refseq蛋白數(shù)據(jù)庫進行蛋白比對檢索完成蛋白鑒定。
[0129]小鼠研究。將5x10s個穩(wěn)定表達對照或tTG siRNA的有絲分裂阻滯(使用絲裂霉素C)的MDAMB231細胞與5x10s個NIH3T3成纖維細胞和生長因子減少的Matrigel (BDBiosciences)組合以使得最終溶液中含30%的Matrigel。將所述細胞制備物皮下注射至6-8周齡雌性NIH-1II裸鼠的脅腹部。作為對照，將親代MDAMB231細胞和NIH3T3細胞(每個細胞系5xl05個細胞)分別與生長因子減少的Matrigel (終濃度為30%的Matrigel)組合，然后也注射到小鼠體內(nèi)。一個月后，處死動物并將各實驗條件下所形成的腫瘤切下并計數(shù)。該涉及小鼠的實驗方案由康奈爾動物資源和教育中心(CARE)批準進行。
[0130]為獲得圖51所示的結(jié)果，使用下述程序。體外脂質(zhì)體成分檢測，將含有35%磷脂酰乙醇胺、25%磷脂酰絲氨酸、5%磷脂酰肌醇、和35%膽固醇的脂質(zhì)混合物重懸于TBSM緩沖液中(20mM Tris, pH7.5、150mM NaCl、和2mM MgCl2)以制備合成脂質(zhì)體。將所述脂質(zhì)通過8微米濾膜擠出，13，OOOrpm離心15分鐘成團，再重懸于TBSM緩沖液中。然后將等量的脂質(zhì)制備物與重組野生型tTG或BSA培養(yǎng)15分鐘，隨后在室溫條件下13，OOOrpm離心10分鐘。使用截止分子量為IOK的離心濃縮器將上清液濃縮至?30 μ L，將成團的脂質(zhì)體重懸于30 μ L TBSM緩沖液中。在凝膠上分離各樣品，然后使用Quick Blue染色以檢測蛋白。
[0131]盡管已通過特定的實施方式(其中的一些是優(yōu)選的實施方式)來具體地顯示和描述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解在不脫離本申請所公開的本發(fā)明的主旨和范圍的前提下可以在形式和細節(jié)上對本申請進行多種改變。
【權(quán)利要求】
1.一種表征微泡的方法，所述方法包括: i)獲取包括微泡的樣品； ii)檢測所述微泡中的組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tTG)和/或交聯(lián)的纖連蛋白(FN);和 如果在樣品中存在與微泡相結(jié)合的tTG則將所述微泡鑒定為tTG陽性，以及如果在樣品中不存在與微泡相結(jié)合的tTG則將所述微泡鑒定為tTG陰性，和/或如果樣品中存在與微泡相結(jié)合的交聯(lián)FN則將所述微泡鑒定為交聯(lián)FN陽性，以及如果樣品中不存在與微泡相結(jié)合的交聯(lián)FN則將所述微泡鑒定為交聯(lián)FN陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包括來自診斷為患有癌癥、疑似患有癌癥、或存在癌癥風險的個體的液體生物樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述檢測所述微泡包括通過將所述微泡捕獲在結(jié)合配體上來從所述液體生物樣品中分離所述微泡。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述結(jié)合配體附著于固體基質(zhì)上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述結(jié)合配體選自纖連蛋白、抗-纖連蛋白抗體或其纖連蛋白結(jié)合片段、 重組tTG或其衍生物、抗-tTG抗體、及其tTG結(jié)合片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述個體已被診斷為患有癌癥并且正在接受癌癥治療。
7.一種將個體診斷為具有循環(huán)微泡的方法，所述循環(huán)微泡為 A)組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tTG)陽性或tTG陰性，和/或 B)交聯(lián)纖連蛋白(FN)陽性或交聯(lián)FN陰性； 所述方法包括: I)檢測來自個體的樣品中的與微泡相結(jié)合的tTG，如果存在tTG，則將所述個體鑒定為具有與tTG相結(jié)合的循環(huán)微泡，如果不存在與微泡相結(jié)合的tTG，則將所述個體鑒定為不具有與tTG相結(jié)合的循環(huán)微泡；和/或 II)檢測所述樣品中的與微泡相結(jié)合的交聯(lián)FN，如果存在交聯(lián)FN，則將所述個體鑒定為具有與交聯(lián)FN相結(jié)合的循環(huán)微泡，如果不存在與微泡相結(jié)合的交聯(lián)FN，則將所述個體鑒定為不具有與交聯(lián)FN相結(jié)合的循環(huán)微泡。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述樣品包括來自診斷為患有癌癥、疑似患有癌癥、或存在癌癥風險的個體的液體生物樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述檢測所述樣品包括通過將所述微泡捕獲在結(jié)合配體上來從所述液體生物樣品中分離所述微泡。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述結(jié)合配體附著于固體基質(zhì)上。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述結(jié)合配體選自纖連蛋白、抗-纖連蛋白抗體或其纖連蛋白結(jié)合片段、重組tTG或其衍生物、抗-tTG抗體、及其tTG結(jié)合片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述個體已被診斷為患有癌癥并且正在接受癌癥治療。
13.一種在個體中抑制物質(zhì)從包括組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tTG)的微泡轉(zhuǎn)移至所述個體中的一個或多個細胞的方法，包括給予所述個體具有細胞不透性的tTG抑制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述個體已診斷為患有癌癥、疑似患有癌癥、或存在癌癥風險。
15.一種包括分離的微泡群的組合物，其中所述微泡包含組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶 (tTG)，其中所述分離的微泡群附著于tTG結(jié)合配體，或者附著于重組tTG或其衍生物，或者附著于交聯(lián)FN結(jié)合配體之上。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述結(jié)合配體附著于固體基質(zhì)上。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述結(jié)合配體選自纖連蛋白、重組tTG或其衍生物、抗-tTG抗體、及其組合。
18.一種分離細胞膜結(jié)構(gòu)的方法，包括提供可能包含所述膜結(jié)構(gòu)的樣品，將所述樣品與組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tTG)或其衍生物混合，如果樣品中存在所述膜結(jié)構(gòu)，允許其形成膜結(jié)構(gòu)與tTG或其衍生物的復(fù)合物，以及從樣品中分離所述tTG與所述膜結(jié)構(gòu)的所述復(fù)合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述樣品包括來自診斷為患有癌癥、疑似患有癌癥、或存在癌癥風險的個體的液體生物樣品。
20.根據(jù)權(quán)利要 求18所述的方法，其中所述膜結(jié)構(gòu)是從細胞脫落的。
【文檔編號】G01N33/53GK103477225SQ201280018703
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月17日
【發(fā)明者】R·塞立昂, M·安東雅克, W·K·塞立昂, 李波 申請人:康奈爾大學