目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，具有：(a)將被檢試樣濃縮以提高前述被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度的工序；(b)調(diào)制包含被濃縮的被檢試樣和用以與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使前述目標(biāo)粒子與前述發(fā)光探針在前述試樣溶液中結(jié)合的工序；和(c)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)前述試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序；在前述發(fā)光探針與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下、與前述發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同。
【專(zhuān)利說(shuō)明】目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)到來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)體統(tǒng)而檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法。
[0002]本申請(qǐng)基于2011年6月27日在日本提交的日本特愿2011-142033號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來(lái)光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)行生物分子等分子間相互作用或者分子間的結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測(cè)的各種裝置或方法。例如，對(duì)于熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn) 1、2、非專(zhuān)利文獻(xiàn)I?3)中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)定來(lái)自在試樣溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光聚光而成的焦點(diǎn)區(qū)域，被稱(chēng)為共焦體積。)內(nèi)出入的熒光分子或進(jìn)行了熒光標(biāo)記的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度。然后基于由測(cè)定的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值決定的、微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值，能夠取得熒光分子等的運(yùn)動(dòng)速度或大小、濃度這類(lèi)信息，或者檢測(cè)到分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集的各種現(xiàn)象。此外，利用熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn) 3)或光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如:專(zhuān)利文獻(xiàn)4)與FCS同樣地，生成檢測(cè)到的出入共焦體積內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，對(duì)于該直方圖的分布擬合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型式，由此算出熒光分子等固有的明亮度的平均值和滯留于共焦體積內(nèi)的分子個(gè)數(shù)的平均值。接著，根據(jù)上述信息，推測(cè)分子結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)5、6中提出了:基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定出的試樣溶液的熒光信號(hào)的時(shí)程來(lái)檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。專(zhuān)利文獻(xiàn)7中提出了一種信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)，其用于:使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量在流式細(xì)胞儀內(nèi)流過(guò)的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘Ｋl(fā)出的微弱光，檢測(cè)液流中或基板上存在的熒光粒子。
[0004]特別的是，通過(guò)應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測(cè)定技術(shù)的方法，測(cè)定所必需的試樣的濃度比以前低得多且可以是微量(每次測(cè)定使用的量最多數(shù)十UL左右。另外，測(cè)定時(shí)間大幅地縮短(每次測(cè)定中可重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的秒數(shù)量級(jí)時(shí)間的測(cè)定))。因此，特別在對(duì)于醫(yī)學(xué)/生物學(xué)的研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價(jià)的試樣進(jìn)行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待用作能夠低廉或迅速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)的強(qiáng)有力的工具。
[0005]另一方面，解析對(duì)象為核酸分子的情況下，已知有在檢測(cè)作為目標(biāo)對(duì)象的核酸分子之前，提高試樣溶液中的核酸濃度的技術(shù)。已知例如，使溶劑由試樣溶液蒸發(fā)濃縮之后，由該試樣溶液測(cè)定目標(biāo)核酸分子的方法(參照例如:專(zhuān)利文獻(xiàn)8。)。另外，已知有使用具有將目標(biāo)的成分分離/濃縮的旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)、和為了測(cè)定該特定的成分的濃度進(jìn)行熒光發(fā)光檢測(cè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)的化學(xué)分析裝置，測(cè)定前述試樣溶液中的核酸濃度的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)
9。)。除了將試樣溶液進(jìn)行濃縮的方法以外，也可以通過(guò)從試樣溶液中分離/精制核酸分子，而提高核酸濃度。作為該方法，已知有例如，通過(guò)向試樣中添加陰離子性洗劑和離液鹽而使核酸分子沉淀，回收核酸分子被濃縮而成的沉淀物的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)10。)。另外，使用將核酸分子固定化的膜、陰離子交換基質(zhì)，捕捉試樣中的核酸分子之后，從該膜或基質(zhì)將核酸分子放出的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)11或12。)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0008]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2005-098876號(hào)公報(bào)
[0009]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-292371號(hào)公報(bào)
[0010]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本專(zhuān)利第4023523號(hào)公報(bào)
[0011]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開(kāi)2008-080417號(hào)公報(bào)
[0012]專(zhuān)利文獻(xiàn)5:日本特開(kāi)2007-20565號(hào)公報(bào)
[0013]專(zhuān)利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2008-116440號(hào)公報(bào)
[0014]專(zhuān)利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)平4-337446號(hào)公報(bào)
[0015]專(zhuān)利文獻(xiàn)8:日本特開(kāi)2008-000045號(hào)公報(bào)
[0016]專(zhuān)利文獻(xiàn)9:日本特開(kāi)2003-344288號(hào)公報(bào)
[0017]專(zhuān)利文獻(xiàn)10:日本特表2006-526591號(hào)公報(bào)
[0018]專(zhuān)利文獻(xiàn)11:日本特表2002-528093號(hào)公報(bào)
[0019]專(zhuān)利文獻(xiàn)12:日本特表2009-518020號(hào)公報(bào)
[0020]非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0021]非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號(hào)、第1431?1438 頁(yè)。
[0022]非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler著、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁(yè)。
[0023]非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號(hào)、第271?277 頁(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0025]上述FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)簡(jiǎn)而言之是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算所測(cè)量的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)的大小，根據(jù)該波動(dòng)的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度適合調(diào)制成:在平衡狀態(tài)下在秒數(shù)量級(jí)長(zhǎng)度的一次測(cè)量時(shí)間中有能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)；優(yōu)選調(diào)制成在微小區(qū)域內(nèi)經(jīng)常地存在有一個(gè)左右的熒光分子等(典型地，共焦體積的體積為IfL左右，所以熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。)。換言之，試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度大幅地低于能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的程度時(shí)(例如，大幅地低于InM時(shí))，產(chǎn)生測(cè)量時(shí)間內(nèi)只有稀少的觀測(cè)對(duì)象物進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)。于是，在熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果中包括:觀測(cè)對(duì)象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間地存在，并且顯著的熒光強(qiáng)度的觀測(cè)量變少。結(jié)果，通過(guò)如上所述的基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)的光分析技術(shù)難以獲得有意義的或精度良好的分析結(jié)果。
[0026]專(zhuān)利文獻(xiàn)5、6中所述的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測(cè)方法中公開(kāi)有:不進(jìn)行如上述的涉及熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)數(shù)秒的測(cè)量時(shí)間內(nèi)有無(wú)顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的產(chǎn)生，判斷試樣中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的有無(wú)，而得到顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專(zhuān)利文獻(xiàn)6中，提出了產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機(jī)流動(dòng)時(shí)，檢測(cè)靈敏度提高。然而，即便是這些方法，也只停留在檢測(cè)通過(guò)擴(kuò)散或隨機(jī)的流動(dòng)概率地進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在。即，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子行為，對(duì)于例如:粒子的計(jì)數(shù)、定量地算出粒子的濃度或數(shù)密度的技術(shù)沒(méi)有公開(kāi)。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)是逐個(gè)檢測(cè)流式細(xì)胞儀的液流中的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘５拇嬖诘募夹g(shù)，而不是用于檢測(cè)試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等的粒子，即不是用于對(duì)于在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。即，對(duì)于定量地算出在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度的技術(shù)并沒(méi)有公開(kāi)。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)7的技術(shù)包含流式細(xì)胞儀中的測(cè)量或者熒光粒子向基板上的固定化處理的過(guò)程。因此可以認(rèn)為，檢測(cè)所需要的試樣量遠(yuǎn)大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技術(shù)的情況，并且對(duì)實(shí)施者要求復(fù)雜的高難度的操作技術(shù)。
[0027]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)方法，不包含F(xiàn)CS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)中進(jìn)行那樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)于觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述的光分析技術(shù)中處理水平的試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的狀態(tài)或特性也能夠檢測(cè)的新型的光分析技術(shù)，在更短的測(cè)定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子。
[0028]用于解決問(wèn)題的方案
[0029]此處，對(duì)于在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子發(fā)現(xiàn):以由與該粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出的光作為指標(biāo)間接地進(jìn)行檢測(cè)的情況下，通過(guò)使用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行與發(fā)光探針結(jié)合的粒子的檢測(cè)，即便試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的粒子的濃度比通過(guò)FCS等現(xiàn)有的光分析技術(shù)檢測(cè)的情況下低時(shí)，也能夠靈敏度良好地檢測(cè)與發(fā)光探針結(jié)合的粒子。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在利用掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定之前預(yù)先提高試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度，能夠在更短的測(cè)定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)粒子。
[0030]此處，掃描分子計(jì)數(shù)法是日本特愿2010-044714中提出的新型光分析技術(shù)。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的第一方式，目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法為檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有:
[0032](a)將被檢試樣濃縮以提高前述被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度的工序；
[0033](b)調(diào)制包含前述工序(a)中被濃縮的被檢試樣和用以與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使前述目標(biāo)粒子與前述發(fā)光探針在前述試樣溶液中結(jié)合的工序；和
[0034](C)計(jì)數(shù)前述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序；
[0035]在前述發(fā)光探針與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下、與前述發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同，
[0036]前述工序(C)中的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)通過(guò)如下工序進(jìn)行:
[0037]使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng),在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序；
[0038]一邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由前述光檢測(cè)區(qū)域中的與前述目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的前述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的工序；和
[0039]將前述逐個(gè)檢測(cè)的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的第二方式，在本發(fā)明的第一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述工序(C)的試樣溶液中的目標(biāo)粒子的數(shù)密度是相對(duì)于前述光檢測(cè)區(qū)域的體積(Vd)為I分子以下。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的第三方式，在本發(fā)明的第一方式或第二方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述目標(biāo)粒子為核酸分子，前述工序(a)為從前述被檢試樣中精制核酸分子并濃縮的工序。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的第四方式，在本發(fā)明的第一方式或第二方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述工序(a)為從前述被檢試樣中特異地回收目標(biāo)粒子并進(jìn)行濃縮的工序。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的第五方式，在本發(fā)明的第一方式至第四方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，在前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，以規(guī)定的速度移動(dòng)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的第六方式，在本發(fā)明的第一方式至第五方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，在前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，以快于前述與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的第七方式，在本發(fā)明的第一方式至第六方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，在由前述檢測(cè)到的光檢測(cè)來(lái)自每個(gè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的光信號(hào)而逐個(gè)檢測(cè)與前述發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的工序中，根據(jù)檢測(cè)到的按照時(shí)間順序的光信號(hào)的形狀，檢測(cè)到一個(gè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子進(jìn)入了前述光檢測(cè)區(qū)域。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的第八方式，在本發(fā)明的第一方式至第七方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述發(fā)光探針具有相互接近時(shí)產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位，并且，在前述發(fā)光探針與前述粒子結(jié)合的狀態(tài)以及前述發(fā)光探針不與前述粒子結(jié)合的狀態(tài)之間，前述能量供體部位與前述能量受體部位的距離不同；在前述發(fā)光探針與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下、與前述發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下，由前述發(fā)光探針發(fā)出的光的發(fā)光特性不同。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的第九方式，在本發(fā)明的第一方式至第八方式的任一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，前述目標(biāo)粒子為核酸分子，前述發(fā)光探針與前述目標(biāo)粒子特異地雜交，并且前述目標(biāo)粒子為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子上結(jié)合有熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的成為能量供體的熒光物質(zhì)以及成為能量受體的物質(zhì)的至少一者。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的第十方式，目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法為檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有:
[0049](a’ )調(diào)制包含被檢試樣、和用以與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液的工序；
[0050](b’)使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述工序(a’)中調(diào)制的試樣溶液中結(jié)合的工序；和
[0051](c’ )計(jì)數(shù)所述工序(b’ )中調(diào)制的試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序；
[0052]前述發(fā)光探針在與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同；
[0053]前述工序(c’ )中的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)通過(guò)如下工序進(jìn)行:
[0054]使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序；
[0055]一邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由前述光檢測(cè)區(qū)域中的與前述目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的前述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的工序；和
[0056]將前述逐個(gè)檢測(cè)的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序；
[0057]在前述工序(a’ )之后或前述工序(b’ )之后進(jìn)行濃縮處理以提高前述試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
[0058]發(fā)明的效果
[0059]上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中應(yīng)用的掃描分子計(jì)數(shù)法不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，通過(guò)上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，即便試樣中僅微量存在通過(guò)FCS等現(xiàn)有的光分析技術(shù)不能檢測(cè)程度的作為解析對(duì)象的目標(biāo)粒子時(shí)，也能夠檢測(cè)試樣中的前述目標(biāo)粒子。進(jìn)而，上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，在利用掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定之前，通過(guò)濃縮處理使試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度提高，所以相比于不進(jìn)行濃縮處理的情況，能夠在更短的測(cè)定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)粒子。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0060]圖1A是用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0061]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0062]圖1C是改變鏡子7的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0063]圖2A是說(shuō)明用于掃描分子計(jì)數(shù)法的基于光分析技術(shù)的光檢測(cè)原理的示意圖。
[0064]圖2B是通過(guò)用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)測(cè)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0065]圖3A是觀測(cè)對(duì)象粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0066]圖3B是表示觀測(cè)對(duì)象粒子邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0067]圖4A是以快于觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置、從而觀測(cè)對(duì)象粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0068]圖4B是以快于觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置、從而觀測(cè)對(duì)象粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0069]圖5是以流程圖的形式顯示根據(jù)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理次序的圖。
[0070]圖6A是說(shuō)明在根據(jù)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理工序的例子的圖。
[0071]圖6B是說(shuō)明在根據(jù)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理工序的例子的圖。
[0072]圖7表示通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例(柱狀圖)、和將數(shù)據(jù)平滑化后獲得的曲線(虛線)、和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)(圖中，標(biāo)記了“噪音”的信號(hào)作為由噪音或異物產(chǎn)生的信號(hào)而被無(wú)視)。
[0073]圖8A為表示實(shí)施例1的各試樣溶液中被計(jì)數(shù)的光子數(shù)的圖。
[0074]圖8B為表示實(shí)施例1的各試樣溶液中被計(jì)數(shù)的峰數(shù)的圖。
[0075]圖9為表示實(shí)施例2的各試樣溶液中被計(jì)數(shù)的峰數(shù)的圖。
[0076]圖10為表示實(shí)施例3的各試樣溶液中所計(jì)數(shù)的峰數(shù)對(duì)應(yīng)于每個(gè)熒光標(biāo)記核酸分子的濃度的圖。
[0077]圖11為表示實(shí)施例4的各試樣溶液中被計(jì)數(shù)的峰數(shù)的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0078]首先，對(duì)于掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說(shuō)明。掃描分子計(jì)數(shù)法為如下技術(shù):一邊通過(guò)微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)出光的粒子(以下，稱(chēng)為“發(fā)光粒子”。)橫穿微小區(qū)域內(nèi)時(shí)，檢測(cè)由微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光，一個(gè)一個(gè)逐個(gè)檢測(cè)試樣溶液中的發(fā)光粒子，獲得與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的相關(guān)信息。掃描分子計(jì)數(shù)法與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，檢測(cè)所需的試樣可以是微量(例如，數(shù)十4 1左右)。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定時(shí)間短，并且與FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，對(duì)于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，可以定量檢測(cè)其濃度或數(shù)密度等特性。
[0079]需要說(shuō)明的是，發(fā)光粒子是指通過(guò)熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。本發(fā)明的目標(biāo)粒子的定量方法中，目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而成的粒子為發(fā)光粒子。
[0080]本發(fā)明和本說(shuō)明書(shū)中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域。當(dāng)由物鏡照射照明光時(shí)，該照明光聚光的區(qū)域相當(dāng)于微小區(qū)域。需要說(shuō)明的是，在共聚焦顯微鏡中，該微小區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔(pinhole)之間的位置關(guān)系確定。
[0081]邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置、即通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測(cè)。于是，當(dāng)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了與隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時(shí)，檢測(cè)到來(lái)自發(fā)光探針的光。結(jié)果，檢測(cè)到一個(gè)粒子的存在(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，也包含如下情況:發(fā)光探針與希望檢測(cè)的粒子(目標(biāo)粒子)暫時(shí)結(jié)合后，在進(jìn)行光的檢測(cè)時(shí)與希望檢測(cè)的粒子解離。)。接著，在逐次檢測(cè)到的光中逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自發(fā)光探針的光信號(hào)，由此，一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)逐次地檢測(cè)到粒子(與發(fā)光探針結(jié)合的粒子)的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在上述構(gòu)成中，可以計(jì)數(shù)逐個(gè)檢測(cè)到的粒子，從而計(jì)數(shù)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)中檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)上述構(gòu)成，通過(guò)組合粒子的個(gè)數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是通過(guò)任意手法如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，并不是直接確定絕對(duì)數(shù)密度值或濃度值，可以計(jì)算相對(duì)于多個(gè)試樣溶液、或者相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的構(gòu)成。因此，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)是迅速的，并且在試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用。結(jié)果，作為檢測(cè)對(duì)象的粒子能夠不受力學(xué)的作用的影響而以穩(wěn)定的狀態(tài)進(jìn)行光的測(cè)量。需要說(shuō)明的是，在試樣溶液中有振動(dòng)或流動(dòng)作用時(shí)，有粒子的物理性質(zhì)變化的可能性。并且，由于流通試樣溶液的構(gòu)成不是必需的，因此能夠用與FCS、FIDA等情況下同樣微量(I?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進(jìn)行測(cè)量和分析。
[0082]在逐個(gè)地檢測(cè)上述的粒子的工序中，由逐次檢測(cè)到的光信號(hào)判定與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針是否進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，可以根據(jù)按照時(shí)間順序檢測(cè)到的光信號(hào)的形狀而進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，在逐個(gè)檢測(cè)上述的粒子的工序中，也包括:一個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；多個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)方式的、與一個(gè)粒子結(jié)合之后從粒子解離的發(fā)光探針的情況。本實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測(cè)到具有比規(guī)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，可以檢測(cè)到與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。
[0083]此外，在上述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變?cè)嚇尤芤簝?nèi)部的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。由與粒子結(jié)合的發(fā)光探針?biāo)鶛z測(cè)到的光的形態(tài)，可能會(huì)根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度過(guò)快時(shí)，由與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針得到的光量降低。因此，為了精度良好或靈敏度良好地測(cè)量來(lái)自與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的光，優(yōu)選適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0084]進(jìn)一步，在上述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，適當(dāng)?shù)氖菍⒃嚇尤芤簝?nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與作為檢測(cè)對(duì)象的粒子結(jié)合的發(fā)光探針(即，本發(fā)明的目標(biāo)粒子的定量方法中，與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針)的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)造成的粒子的平均移動(dòng)速度)。如上述說(shuō)明，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)存在有與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的位置時(shí)，檢測(cè)由該發(fā)光探針發(fā)出的光，逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)移動(dòng)，在光檢測(cè)區(qū)域中出入多次時(shí)，由于多次檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)發(fā)光探針的(表示希望檢測(cè)的粒子存在的光信號(hào))光信號(hào)。因此，難以將檢測(cè)到的光信號(hào)與一個(gè)希望檢測(cè)的粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度。具體而言，設(shè)定為以快于與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度進(jìn)行移動(dòng)。由此，能夠使與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針對(duì)應(yīng)于一個(gè)光信號(hào)(表示粒子的存在的光信號(hào))。需要說(shuō)明的是，擴(kuò)散移動(dòng)速度隨著與粒子結(jié)合的發(fā)光探針而改變，所以如上述，優(yōu)選根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))，適當(dāng)改變光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0085]可以以任意方式，進(jìn)行用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0086]例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡改變光路，使光檢測(cè)區(qū)域的位置發(fā)生變化。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡也可以任意地設(shè)定。例如，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可選自圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0087]掃描分子計(jì)數(shù)法中，其光檢測(cè)機(jī)理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對(duì)來(lái)自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的構(gòu)成。因此，試樣溶液的量與FIDA等光分析技術(shù)情況下同樣地為微量即可。然而，掃描分子計(jì)數(shù)法中，不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)可以適用于粒子的數(shù)密度或濃度比FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平大幅地低的試樣溶液。
[0088]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，在溶液中分散或溶解的每個(gè)粒子被逐個(gè)檢測(cè)出。因此，使用該信息，可以定量地進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，使通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)一一對(duì)應(yīng)，粒子被一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)出，所以能夠進(jìn)行溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的計(jì)數(shù)。所以，相比于以往，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。實(shí)際上，根據(jù)逐個(gè)檢測(cè)與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針等并計(jì)數(shù)其數(shù)目、確定粒子濃度的方法、即上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，即使試樣溶液中的與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的濃度是比通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠檢測(cè)目標(biāo)粒子。
[0089]進(jìn)一步，改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、利用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液的方式，不對(duì)試樣溶液產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)作用，使試樣溶液在均一的狀態(tài)或試樣溶液機(jī)械上穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行觀察。因此，例如，與試樣中發(fā)生流動(dòng)的情況相比較，定量檢測(cè)結(jié)果的可靠性提高。另外，對(duì)于試樣溶液中的成為檢測(cè)對(duì)象的粒子，能夠在不施加力學(xué)作用的影響下或不賦予人為影響的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。需要說(shuō)明的是，對(duì)于試樣引起流動(dòng)時(shí)通常難以引起均勻的流速，并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜化。另外，必要的試樣量大幅地增大，并且由流動(dòng)導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用，溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)存在變質(zhì)或變性的可能性。
[0090]<用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0091]如圖1A中示意性的示例，可以通過(guò)由能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器組合而構(gòu)成的光分析裝置實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法。如圖1A所示，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以為與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣的構(gòu)成。自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光。激光通過(guò)準(zhǔn)直儀4成為平行光，該平行光在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的粒子、與這樣的粒子結(jié)合的發(fā)光探針、典型地帶有熒光色素等發(fā)光標(biāo)記的分子。與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，與粒子暫時(shí)結(jié)合后與粒子解離的發(fā)光探針)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針就在其中被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)通過(guò)物鏡8、分色鏡5，在鏡子11處反射，在聚光鏡12處聚光，通過(guò)小孔13，透過(guò)二次濾片14。此時(shí)，只選擇特定的波長(zhǎng)范圍的光成分。進(jìn)而，發(fā)出的光被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測(cè)器16，轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號(hào)之后，輸入至計(jì)算機(jī)18。接著，按照后面說(shuō)明的方式實(shí)施用于光分析的處理。需要說(shuō)明的是，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上。因此，僅自圖1B中示意地所示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)小孔13，而來(lái)自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有I?IOfL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域，被稱(chēng)為共焦體積(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛倫茲型分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為l/e2的面為界面的略橢球體的體積。)另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來(lái)自發(fā)光探針的光，例如，來(lái)自一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光色素分子的微弱光。因此，光檢測(cè)器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測(cè)器。此外，為了改變欲進(jìn)行觀察的孔10，在沒(méi)有圖示的顯微鏡的平臺(tái)上可以設(shè)有用于移動(dòng)微孔板9的水平方向位置的平臺(tái)位置變化裝置17a。可以通過(guò)計(jì)算機(jī)18控制平臺(tái)位置變化裝置17a的動(dòng)作。通過(guò)上述的構(gòu)成，即使被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測(cè)量。
[0092]進(jìn)一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)的機(jī)構(gòu)，即，用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)的位置的機(jī)構(gòu)。這樣的用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。這樣的鏡轉(zhuǎn)向器17也可以為與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置相同的構(gòu)成。另外，為了實(shí)現(xiàn)預(yù)期的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)模式，鏡轉(zhuǎn)向器17是在計(jì)算機(jī)18的控制下，與通過(guò)光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)而被驅(qū)動(dòng)的。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合?；蛘?，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡也可以從計(jì)算機(jī)18的程序中的各種移動(dòng)模式中選擇。需要說(shuō)明的是，圖中沒(méi)有顯示但也可以通過(guò)上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測(cè)區(qū)域的位置沿上下方向移動(dòng)。如上所述，上述的光分析裝置不具備移動(dòng)試樣溶液的構(gòu)成，而具備改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的構(gòu)成。因此，試樣溶液內(nèi)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)的作用，能夠排除對(duì)于觀測(cè)對(duì)象物的力學(xué)作用的影響，能夠進(jìn)行穩(wěn)定的測(cè)量。
[0093]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)吸收多光子而發(fā)光時(shí)，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)中發(fā)出光，因此可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴(lài)激發(fā)光發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在光分析裝置I中，如圖所示，可以為如下構(gòu)成:設(shè)置有多個(gè)激發(fā)光源2，根據(jù)用于將粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針激發(fā)的光的波長(zhǎng)，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長(zhǎng)。同樣地，設(shè)置有多個(gè)光檢測(cè)器16，當(dāng)試樣中包含波長(zhǎng)不同的多種粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針時(shí)，可以根據(jù)波長(zhǎng)分別檢測(cè)來(lái)自它們的光。
[0094]<掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0095]FIDA等分光分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)分析技術(shù)相比,其優(yōu)點(diǎn)是必需的試樣量非常少，并且可以快速實(shí)施檢查。然而，在FIDA等分光分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強(qiáng)度波動(dòng)計(jì)算觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或特性。因此，為了獲得精度良好的檢測(cè)結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強(qiáng)度測(cè)量中，在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子，在測(cè)量時(shí)間內(nèi)總是檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述時(shí)，例如，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子只是偶爾進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，僅在一部分測(cè)量時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))，因而難以以良好的精度計(jì)算光強(qiáng)度的波動(dòng)。此外，在觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度大幅地低于測(cè)量中通常在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的運(yùn)算易受背景的影響，為了獲得對(duì)運(yùn)算而言為充分量的顯著的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，測(cè)量時(shí)間延長(zhǎng)。與此相對(duì)，即使當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度低于FIDA等分光分析技術(shù)要求的水平時(shí)，用掃描分子計(jì)數(shù)法也能夠檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0096]掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)中，直接了當(dāng)?shù)卣f(shuō)，驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路，如圖2A和圖2B中不意地描述,一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV的位置即利用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實(shí)施光檢測(cè)。
[0097]如此一來(lái)，例如，如圖2A和圖2B所示，在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)期間(圖2B中，時(shí)間t0?t2)，當(dāng)通過(guò)存在有I個(gè)粒子(圖2A中，發(fā)光探針結(jié)合有熒光色素)的區(qū)域時(shí)(tl)，檢測(cè)到如圖2B所述的顯著的光強(qiáng)度(Em)。如此，實(shí)施上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，通過(guò)一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)在此期間出現(xiàn)的圖2B所例示的顯著的光強(qiáng)度，逐個(gè)檢測(cè)出結(jié)合有發(fā)光探針的粒子。接著，通過(guò)將其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠得到與存在于所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個(gè)數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。這樣的掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，粒子一個(gè)一個(gè)地被檢測(cè)出且不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算這類(lèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算處理。因此，即便是欲觀測(cè)粒子濃度低至無(wú)法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液中，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0098]另外，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法這類(lèi)對(duì)試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)的方法，與由通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)相比，能夠以更低的濃度進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)，通常假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度充分地降低時(shí)，噪音信號(hào)的量相對(duì)于由被熒光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號(hào)量變大(S/N比惡化)。結(jié)果，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號(hào)量之間的比例關(guān)系瓦解，確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由被檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，從檢測(cè)結(jié)果中排除了噪音信號(hào)，只將對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)算出濃度。因此，與假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度時(shí)相比較，能夠檢測(cè)至更低的濃度。
[0099]進(jìn)而，當(dāng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針時(shí)，與傳統(tǒng)的假定熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而確定濃度的方法相比，掃描分子計(jì)數(shù)法這類(lèi)對(duì)試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)的方法的情況下，粒子濃度高一側(cè)的粒子濃度的測(cè)量精度提高。在一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針的條件下，向試樣溶液添加某一量的發(fā)光探針時(shí)，觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度升高時(shí)，相對(duì)而言與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的個(gè)數(shù)降低。在此情況下，由于每一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的熒光強(qiáng)度降低，因此，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解，所確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由檢測(cè)到的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，每個(gè)粒子的熒光強(qiáng)度降低的影響變少，由粒子數(shù)計(jì)算濃度，所以，與假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度時(shí)相比較，能夠檢測(cè)至更高的濃度。
[0100]<通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定>
[0101]就掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測(cè)定而言，除了在檢測(cè)中驅(qū)動(dòng)鏡轉(zhuǎn)向器17，在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度檢測(cè)工序相同的方式實(shí)施光強(qiáng)度檢測(cè)。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺(tái)上之后，使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)定開(kāi)始的指示。于是，計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲(chǔ)裝置(沒(méi)有圖示)存儲(chǔ)的程序(將用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光路進(jìn)行改變的次序、和在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的次序)，開(kāi)始試樣溶液內(nèi)光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測(cè)量。進(jìn)行這樣的測(cè)量期間，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動(dòng)鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。同時(shí)，光檢測(cè)器16將逐次檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，傳送給計(jì)算機(jī)18。計(jì)算機(jī)18以任意方式由送達(dá)的光信號(hào)生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。需要說(shuō)明的是，典型地光檢測(cè)器16為能夠檢測(cè)到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測(cè)器。因此，光的檢測(cè)可以是以如下方式進(jìn)行的光子計(jì)數(shù):在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時(shí)間(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10 μ秒逐次地測(cè)量到達(dá)光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)。另外，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)也可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0102]光強(qiáng)度測(cè)量中的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度可以是任意速度，可以設(shè)定為適合例如實(shí)驗(yàn)或分析目的的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的大小或體積是必需的。因此，以移動(dòng)距離受掌握的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)。需要說(shuō)明的是，測(cè)量中的經(jīng)過(guò)時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測(cè)定結(jié)果，所以，移動(dòng)速度基本上優(yōu)選為恒定速度。然而，移動(dòng)速度不限定于此。
[0103]此外，對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的速度，為了由測(cè)量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子，或以良好的精度定量實(shí)施觀測(cè)對(duì)象粒子數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將上述的移動(dòng)速度設(shè)定為比觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密地，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針、本實(shí)施方式中，為與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)即布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)速度更快的值。掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測(cè)對(duì)象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置隨時(shí)間而移動(dòng)。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)慢時(shí)，如圖3Α示意地描述，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)。因此，光強(qiáng)度如圖3Β所示隨機(jī)地變化(如已知，光檢測(cè)區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。)。結(jié)果，難以確定對(duì)應(yīng)于各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的顯著的光強(qiáng)度的變化。此處，優(yōu)選將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的平均的移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)。于是，如圖4Α所示，粒子略直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域。因此，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4Β例示，對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的光強(qiáng)度變化的分布圖大致一致(粒子略直線地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的曲線與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同。)。結(jié)果，能夠容易地確定各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子與光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)。
[0104]具體而言，由于布朗運(yùn)動(dòng)， 具有擴(kuò)散系數(shù)D的觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密的是，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體，或與粒子結(jié)合后再分解、游離的發(fā)光探針)通過(guò)半徑Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共焦體積)時(shí)所需的時(shí)間At是由均方位移的關(guān)系式
[0105](2ffo)2 = 6D/ Δ t (I)
[0106]推斷出
[0107]At= (2ffo) 2/6D (2)
[0108]因此，觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大約是
[0109]Vdif = 2ffo/ Δ t = 3D/ffo (3)
[0110]此處，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參考前述Vdif而設(shè)定為比之更快的值。例如，假定觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0X10-V/S左右的情況下，只要Wo為0.62 μ m左右，則Vdif為1.0X 10_3m/s。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其略10倍的15mm/s即可。此外，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，為了找到使在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度的各種設(shè)定下的光強(qiáng)度變化曲線成為預(yù)期曲線(典型的是與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0111]<通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的光強(qiáng)度的分析>
[0112]經(jīng)上述處理獲得試樣溶液的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可以在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序進(jìn)行處理(由檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的次序)，實(shí)施如下所述的光強(qiáng)度的分析。
[0113](i) 一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)
[0114]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4A所示幾乎直線狀時(shí)，與該粒子相對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度變化如圖6A示意性地所述具有反映光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布的曲線。需要說(shuō)明的是，該光檢測(cè)區(qū)域由光學(xué)系統(tǒng)確定。反映光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布的分布圖通常表現(xiàn)為略鐘形。因此，觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的手法之一中，對(duì)于光強(qiáng)度設(shè)定閾值1，超過(guò)該閾值的光強(qiáng)度持續(xù)時(shí)間寬度△ τ在規(guī)定的范圍時(shí)，判定為該光強(qiáng)度的分布圖與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)，檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子。對(duì)應(yīng)于光強(qiáng)度的閾值1以及對(duì)應(yīng)時(shí)間寬度△ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后再分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強(qiáng)度而預(yù)想的曲線決定的；所述觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域以規(guī)定的速度相對(duì)地移動(dòng)。需要說(shuō)明的是，具體的值可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)任意地設(shè)定，也可以根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇決定。
[0115]此外，作為觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的其他方法，光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布:
[0116]I = A/exp (_2t2/a2) (4)
[0117]此時(shí)，對(duì)顯著的光強(qiáng)度曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)，根據(jù)式⑷擬合計(jì)算的強(qiáng)度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，該光強(qiáng)度曲線可判斷為對(duì)應(yīng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)了光檢測(cè)區(qū)域，可以視為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子。當(dāng)強(qiáng)度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外時(shí)，可以在分析中作為噪音或異物而無(wú)視。
[0118](ii)觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)
[0119]觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)，可以是通過(guò)任意方法計(jì)數(shù)通過(guò)上述觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)方法檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)。然而，當(dāng)粒子的個(gè)數(shù)較大時(shí)，也可以通過(guò)例如圖5和圖6B所示例的處理來(lái)進(jìn)行。[0120]參照?qǐng)D5和圖6B，在根據(jù)按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)粒子數(shù)的方法的一個(gè)例子中，在通過(guò)上述說(shuō)明的光強(qiáng)度測(cè)定、即用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)，對(duì)該按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(圖6B最上部分“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)，進(jìn)行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，所以在微小的時(shí)間內(nèi)存在數(shù)據(jù)值產(chǎn)生欠缺。因此，通過(guò)這樣的平滑化處理，可以無(wú)視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過(guò)移動(dòng)平均法而進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)獲得光信號(hào)數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)、BIN--ΜΕ，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)，例如，在移動(dòng)平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)或移動(dòng)平均的次數(shù)等。
[0121]然后，為了檢測(cè)在平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中存在顯著信號(hào)的時(shí)間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，對(duì)平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行一階微分值運(yùn)算(步驟120)。按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值，如圖6B中下部分的“時(shí)間微分”所示信號(hào)值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大，因此通過(guò)參考這樣的時(shí)間微分值可以有利地確定顯著的信號(hào)(峰信號(hào))的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0122]之后，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中，逐次檢測(cè)顯著的信號(hào)(峰信號(hào))，判斷檢測(cè)到的峰信號(hào)是否是與觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。
[0123]具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索一個(gè)峰信號(hào)的始點(diǎn)和終點(diǎn)進(jìn)行確定，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。一旦決定了一個(gè)峰存在區(qū)域，就對(duì)該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行鐘形函數(shù)擬合(圖6B下部分的“鐘形函數(shù)擬合”)，計(jì)算鐘形函數(shù)的峰強(qiáng)度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum)) W、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。需要說(shuō)明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。由此，判斷計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)光檢測(cè) 區(qū)域時(shí)檢測(cè)到的光信號(hào)所描述的鐘形曲線參數(shù)的規(guī)定范圍內(nèi)，即，峰強(qiáng)度、峰寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣，如圖7左側(cè)所示，計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個(gè)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對(duì)應(yīng)的光信號(hào)規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，則該信號(hào)判定為與一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。結(jié)果，判斷為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，計(jì)數(shù)為一個(gè)粒子(粒子數(shù)的計(jì)數(shù)增加。工序160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)在預(yù)定范圍內(nèi)不存在的峰信號(hào)作為噪音而無(wú)視。
[0124]上述的步驟130~160的處理中的峰信號(hào)的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進(jìn)行。于是，每檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，則作為粒子而計(jì)數(shù)。因此，在結(jié)束對(duì)按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)全部區(qū)域的峰信號(hào)搜索后(步驟170)，將所獲得的粒子計(jì)數(shù)值作為在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)。
[0125](iii)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0126]進(jìn)行了觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)后，使用在獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的過(guò)程中光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，確定觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測(cè)區(qū)域的實(shí)際體積依賴(lài)于激發(fā)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、透鏡的開(kāi)口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變。因此，通常難以由設(shè)計(jì)值算出觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度。因此，計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積也不簡(jiǎn)單。在本文中，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測(cè)定相同的條件下，對(duì)已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進(jìn)行上文說(shuō)明的光強(qiáng)度測(cè)定、粒子的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，根據(jù)檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，即確定觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)數(shù)和濃度之間的關(guān)系。
[0127]作為參照溶液的粒子，可以?xún)?yōu)選為與觀測(cè)對(duì)象粒子所形成的粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合后再游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對(duì)于粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測(cè)數(shù)為N時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)
[0128]Vt = N/C (5)
[0129]而得到。另外，準(zhǔn)備多個(gè)不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對(duì)其實(shí)施測(cè)定，將計(jì)算的Vt的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積Vt而采用。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度C就根據(jù)
[0130]c = n/Vt (6)
[0131]而獲得。需要說(shuō)明的是，可以不通過(guò)上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA得到光檢測(cè)區(qū)域的體積、光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積。此外，本實(shí)施方式的光分析裝置也可以如下構(gòu)成，對(duì)于規(guī)定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子數(shù)N之間的關(guān)系(式(5))的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，裝置的使用者在實(shí)施光分析時(shí)可以適當(dāng)利用存儲(chǔ)的關(guān)系信息。
[0132]<目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法>
[0133]掃描分子計(jì)數(shù)法為能夠在分子離散的狀況下測(cè)定每一粒發(fā)光粒子的測(cè)定方法。因此，對(duì)于PM級(jí)以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進(jìn)行測(cè)定。因此，通過(guò)上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對(duì)象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠高靈敏度地計(jì)數(shù)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0134]另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法通過(guò)在掃描的共焦區(qū)域(即，光檢測(cè)區(qū)域)中捕捉來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)而進(jìn)行檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，在離散地存在有作為檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的溶液中進(jìn)行檢測(cè)。因此，存在直至在光檢測(cè)區(qū)域中捕捉到發(fā)光粒子為止需要很多時(shí)間的情況。特別是，檢測(cè)極度稀薄的發(fā)光粒子的情況下，需要持續(xù)地進(jìn)行測(cè)定直至在前述光檢測(cè)區(qū)域中捕捉到充分的信號(hào)為止。測(cè)定時(shí)間短的情況下，由作為解析對(duì)象的發(fā)光粒子獲得信號(hào)的頻率不足，難以正確地只測(cè)定該發(fā)光粒子。換言之，掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定時(shí)間依賴(lài)于測(cè)定對(duì)象的濃度，測(cè)定發(fā)光粒子極度稀薄的試樣溶液時(shí)，測(cè)定時(shí)間延長(zhǎng)。
[0135]上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法為檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子的方法。上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，使試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而標(biāo)記，進(jìn)一步通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子，檢測(cè)試樣溶液中的目標(biāo)粒子，此時(shí)試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度通過(guò)濃縮處理而被提高。上述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，在利用掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定之前，通過(guò)濃縮處理，試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度被提高，所以能夠在更短的測(cè)定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)粒子。
[0136]用于提高測(cè)定溶液中的目標(biāo)粒子的濃度的濃縮處理，只要在利用掃描分子測(cè)量法的測(cè)定前即可，可以在任意的時(shí)點(diǎn)進(jìn)行。具體而言，既可以對(duì)于與發(fā)光探針混合而調(diào)制試樣溶液前的被檢試樣進(jìn)行濃縮處理，也可以對(duì)于調(diào)制后的試樣溶液進(jìn)行濃縮處理。
[0137]具體而言，本發(fā)明的第一方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法(以下，第一檢測(cè)方法)為檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有下述工序(a)?(C)。
[0138](a)將被檢試樣濃縮以提高前述被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度的工序；(b)調(diào)制包含前述工序(a)中被濃縮的被檢試樣和用以與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使前述目標(biāo)粒子與前述發(fā)光探針在前述試樣溶液中結(jié)合的工序；和
[0139](C)計(jì)數(shù)前述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序；
[0140]另外，在前述發(fā)光探針與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下、和以前述發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同。
[0141]本實(shí)施方式中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子”是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的粒子或不發(fā)光的粒子的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子。
[0142]目標(biāo)粒子為在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，是用于定量試樣溶液中的濃度的粒子。作為目標(biāo)粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類(lèi)似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對(duì)象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)。
[0143]核酸類(lèi)似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類(lèi)天然類(lèi)型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:交聯(lián)核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA, Hexitol Nucleic Acid)、妝核酸(PNA)等。
[0144]本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針為與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)，只要是在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)與單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同的物質(zhì)，就沒(méi)有特別的限定。例如，也可以為使發(fā)光物質(zhì)結(jié)合在與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)上而成的物質(zhì)。作為發(fā)光物質(zhì)，典型地為熒光性物質(zhì)，但也可以為通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的物質(zhì)。作為熒光物質(zhì)，只要是由特定波長(zhǎng)的光照射就發(fā)出熒光的物質(zhì)即可，沒(méi)有特別的限定，可以從用于FCS或FIDA等的熒光色素中適當(dāng)?shù)倪x擇使用。
[0145]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，發(fā)光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、與核酸結(jié)合的色素分子等。作為寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)。可以為包含部分或全部核酸類(lèi)似物質(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類(lèi)似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對(duì)。另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，作為發(fā)光探針，可以使用將目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體用熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記了的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)與發(fā)光物質(zhì)的結(jié)合可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行。
[0146]本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)。從目標(biāo)粒子的檢測(cè)/定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的發(fā)光探針，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類(lèi)似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可，不需要與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，被作為發(fā)光探針使用的發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與目標(biāo)粒子的喊基序列完全地互補(bǔ)的喊基序列，也可以具有與該目標(biāo)粒子的喊基序列錯(cuò)配的堿基序列。
[0147]另外，在發(fā)光探針與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)光探針的發(fā)光特性不同是指:在發(fā)光探針與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下，特定的波長(zhǎng)的光強(qiáng)度不同。使發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及發(fā)光探針與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下特定波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度不同(例如，使熒光強(qiáng)度不同)，由此能夠在掃描分子計(jì)數(shù)法中區(qū)別地檢測(cè)出兩者。
[0148]目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，與蛋白質(zhì)結(jié)合且改變周?chē)h(huán)境時(shí)熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)變化的色素(例如，疏水性探針ANS、MANS、TNS這類(lèi)的熒光色素)可以作為發(fā)光探針使用。另外，發(fā)光探針也可以其自身不發(fā)光。例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，使用與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸作為發(fā)光探針，即便在試樣溶液中與發(fā)光探針一起添加與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，也能夠在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及發(fā)光探針與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下使發(fā)光特性不同。作為與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，可列舉出熒光性嵌入劑或結(jié)合了熒光物質(zhì)的溝結(jié)合劑等。
[0149]其他的，可以使用例如:由至少兩個(gè)構(gòu)成要素形成的的、通過(guò)與目標(biāo)粒子結(jié)合而使前述的至少兩個(gè)構(gòu)成要素的相互位置變化而發(fā)出熒光的物質(zhì)作為發(fā)光探針。作為這樣的物質(zhì)的例子，可列舉出:與某粒子結(jié)合時(shí)結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出強(qiáng)的熒光的熒光性蛋白質(zhì)、或者與某粒子結(jié)合時(shí)聚集而形成熒光性金屬絡(luò)合物的分子(絡(luò)合物的配體)。通過(guò)這樣的構(gòu)成，在所有情況下，單獨(dú)的發(fā)光探針或不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針均幾乎不發(fā)光，或者即便發(fā)光與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體的波長(zhǎng)不同，所以能夠選擇地檢測(cè)由目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體發(fā)出的光。
[0150]另外，通過(guò)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)，能夠使試樣溶液中單獨(dú)存在的發(fā)光探針、和與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的發(fā)光特性不同。例如，作為發(fā)光探針可以使用如下物質(zhì):使在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)(熒光物質(zhì)、猝滅物質(zhì))按照在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)上結(jié)合而形成的物質(zhì)。與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針不再產(chǎn)生FRET，所以由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。另外，從單獨(dú)存在的核酸探針中，檢測(cè)不到由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，或檢測(cè)到的熒光是減弱的。因此，通過(guò)檢測(cè)由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，能夠與單獨(dú)存在的發(fā)光探針區(qū)別地檢測(cè)到與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0151]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，可以?xún)?yōu)選使用分子信標(biāo)探針作為發(fā)光探針；該分子信標(biāo)探針如下形成:使FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)按照單鏈核酸分子的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、與其他單鏈核酸分子雜交形成締合體的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在當(dāng)為單鏈核酸分子的狀態(tài)時(shí)形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體的寡核苷酸上結(jié)合。本實(shí)施方式中優(yōu)選的是:3’末端側(cè)結(jié)合有成為能量供體的熒光物質(zhì)或成為能量受體的物質(zhì)、5’末端側(cè)結(jié)合有剩余的另一者并且3’末端側(cè)區(qū)域和5’末端側(cè)具有彼此互補(bǔ)的堿基序列，這些堿基序列形成堿基對(duì)由此形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(所謂的莖-環(huán)結(jié)構(gòu))的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，分子信標(biāo)探針的形成分子內(nèi)堿基對(duì)的彼此互補(bǔ)的區(qū)域，可以?shī)A著與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域而存在。因此，3’末端側(cè)的區(qū)域和5’末端側(cè)的區(qū)域既可以為分別包含3’末端或5’末端的區(qū)域，也可以為不包含3’末端或5’末端的區(qū)域。此外，就形成堿基對(duì)的區(qū)域的堿基數(shù)或堿基序列而言，為所形成的堿基對(duì)的穩(wěn)定性低于與目標(biāo)粒子的締合體、且在檢測(cè)條件下能夠形成堿基對(duì)的程度即可。
[0152]另外，使用與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，即便熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生FRET，也能夠區(qū)別單獨(dú)存在的發(fā)光探針和與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針。即，熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)中的任一者成為FRET的能量供體，另一者成為FRET的能量受體。由單獨(dú)存在的發(fā)光探針，檢測(cè)到由標(biāo)記所述發(fā)光探針的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。與此相對(duì)，與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，所以由結(jié)合體能夠檢測(cè)到由FRET發(fā)出的熒光。結(jié)果，能夠與單獨(dú)存在的發(fā)光探針區(qū)別而檢測(cè)。
[0153]此外，當(dāng)進(jìn)入發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體的堿基對(duì)之間的熒光性嵌入劑的量過(guò)多時(shí)，檢測(cè)自FRET發(fā)出的熒光時(shí)的背景變得過(guò)高，存在影響檢測(cè)精度的可能性。因此，優(yōu)選將發(fā)光探針設(shè)計(jì)成在發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體中形成雙鏈的區(qū)域?yàn)?00bp以下。
[0154]其他的，本實(shí)施方式中，也可以使用兩種發(fā)光探針。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，將兩種發(fā)光探針設(shè)計(jì)成相對(duì)于目標(biāo)粒子相互鄰接而雜交，將一者的發(fā)光探針用FRET中的成為能量供體的熒光物質(zhì)標(biāo)記，將另一者的發(fā)光探針用FRET中的成為能量受體的物質(zhì)標(biāo)記。該情況下，單獨(dú)存在的發(fā)光探針不產(chǎn)生FRET，而通過(guò)與目標(biāo)粒子結(jié)合，兩種發(fā)光探針相互接近而產(chǎn)生FRET。因此，通過(guò)檢測(cè)自FRET發(fā)出的熒光，能夠檢測(cè)出與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0155]另外，提供給本實(shí)施方式的被檢試樣，只要是預(yù)期包含目標(biāo)粒子的試樣，就沒(méi)有特別的限定，既可以為生物試樣，也可以為人工調(diào)制的試樣。目標(biāo)粒子為核酸分子的情況下，作為被檢試樣，可列舉出例如:將細(xì)胞、組織、細(xì)菌可溶化并使核酸成分分散于液體中而成的溶液、包含通過(guò)PCR法擴(kuò)增的核酸成分的溶液等。
[0156]以下，對(duì)于每個(gè)工序進(jìn)行說(shuō)明。
[0157]首先，作為工序(a)，將被檢試樣濃縮以提高被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度。對(duì)于濃縮方法，沒(méi)有特別的限定，可以適宜使用將與目標(biāo)粒子同種的物質(zhì)濃縮、分離或精制時(shí)所應(yīng)用的公知的化學(xué)/分子生物學(xué)的手法等。例如，通過(guò)加溫/加熱或減壓等將溶劑蒸發(fā)或蒸散的方法、通過(guò)超濾去除溶劑的方法等只將被檢試樣中的溶劑去除而提高目標(biāo)粒子的濃度即可。另外，從被檢試樣中只將目標(biāo)粒子、或者將目標(biāo)粒子和與目標(biāo)粒子物理或化學(xué)性質(zhì)近似的物質(zhì)一起分離/精制之后，使之溶解或分散于體積比分離/精制前的被檢試樣的體積少的適當(dāng)?shù)娜軇┲校纱四軌蛘{(diào)制被濃縮的被檢試樣。對(duì)于使被分離/精制的目標(biāo)粒子溶解等的溶劑，沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選不阻礙利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的溶劑。作為該溶劑，可列舉出例如:水、PBS(磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0158]在掃描分子計(jì)數(shù)法中，測(cè)定溶液中包含以具有自身熒光的物質(zhì)為代表的各種各樣的物質(zhì)的情況下，成為非特異信號(hào)的產(chǎn)生或透過(guò)的光路的阻礙等障礙的原因。因此，本實(shí)施方式中，相比于簡(jiǎn)單地去除溶劑而濃縮，更優(yōu)選從被檢試樣中只將目標(biāo)粒子、或者將目標(biāo)粒子和與目標(biāo)粒子物理或化學(xué)性質(zhì)近似的物質(zhì)一起進(jìn)行分離/精制而濃縮。
[0159]目標(biāo)粒子為核酸分子的情況下，從被檢試樣中僅選擇地回收核酸分子、并將回收的核酸分子溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校纱四軌蛘{(diào)制被濃縮的被檢試樣。對(duì)于從被檢試樣中選擇地回收核酸分子的方法，沒(méi)有特別的限定，可以從已知的核酸精制方法中適宜選擇并使用。例如，可以通過(guò)乙醇沉淀法選擇地使核酸分子沉淀，使得到的沉淀物溶解于水等適當(dāng)?shù)娜軇┲?。另外，也可以通過(guò)使被檢試樣與無(wú)機(jī)支撐體接觸，使被檢試樣中的核酸分子吸附于無(wú)機(jī)支撐體之后，使吸附的核酸分子由無(wú)機(jī)支撐體脫附。
[0160]上述的無(wú)機(jī)支撐體可以使用能夠吸附核酸分子的已知的無(wú)機(jī)支撐體。另外，對(duì)于無(wú)機(jī)支撐體的形狀也沒(méi)有特別的限定，既可以為粒子狀，也可以為膜狀。作為無(wú)機(jī)支撐體，可列舉出例如:硅膠、二氧化硅質(zhì)氧化物、玻璃、硅藻土等含二氧化硅顆粒(珠)；尼龍、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、硝基纖維素等多孔膜等。進(jìn)一步，使用在鐵氧體等金屬粒子表面上涂布有聚苯乙烯等聚合物的磁性粒子的情況下，也能夠?qū)嵤┐判粤Ｗ颖砻娴幕瘜W(xué)修飾，而吸附核酸分子。作為使吸附的核酸分子從無(wú)機(jī)支撐體脫附的溶劑，可以適宜使用為了將核酸分子從這些公知的無(wú)機(jī)支撐體脫附而通常使用的溶劑。作為該用于脫附的溶劑，特別優(yōu)選純化水。需要說(shuō)明的是，優(yōu)選將吸附了核酸分子的無(wú)機(jī)支撐體使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液進(jìn)行洗滌之后，使核酸分子從無(wú)機(jī)支撐體脫附。
[0161]也可以從被檢試樣中將蛋白質(zhì)等除了核酸分子以外的分子去除而調(diào)制核酸分子被濃縮的被檢試樣。例如，向被檢試樣中添加一種或兩種以上離液鹽、有機(jī)溶劑、表面活性劑等通常作為蛋白質(zhì)的變性劑而使用的化合物而使被檢試樣中的蛋白質(zhì)變性，之后通過(guò)離心分離處理使變性蛋白質(zhì)沉淀而只回收上清，由此能夠從被檢試樣中去除蛋白質(zhì)。使用前述無(wú)機(jī)支撐體，從得到的上清中回收核酸，由此能夠調(diào)制被濃縮的被檢試樣。回收的上清的體積少于添加蛋白質(zhì)的變性劑之前的被檢試樣的體積情況下，也可以將該上清直接作為被濃縮的被檢試樣使用。
[0162]作為蛋白質(zhì)的變性劑而使用的離液鹽，可列舉出例如:鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉、高氯酸鈉以及三氯乙酸鈉等。作為蛋白質(zhì)的變性劑而使用的表面活性劑，可以為非離子性表面活性劑，可以為陰離子性表面活性劑，也可以為陽(yáng)離子性表面活性劑。作為非離子性表面活性劑，可列舉出例如:1'?的1180、0^?5(3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽)、TritonX-100、Tween20等。作為陰離子性表面活性劑，可列舉出例如:SDS所代表的烷基硫酸鈉、膽酸鈉、N-十二烷基肌氨酸等。作為陽(yáng)離子性表面活性劑，可列舉出例如:CDAB所代表的烷基季銨等。作為蛋白質(zhì)的變性劑而使用的有機(jī)溶劑，優(yōu)選苯酚。苯酚既可以為中性也可以為酸性。使用酸性的苯酚的情況下，相比于DNA，能夠選擇性地將RNA提取至水層。
[0163]其他的，對(duì)于被檢試樣使用蛋白質(zhì)去除劑而使蛋白質(zhì)聚集，之后通過(guò)固液分離處理回收液體成分，由此能夠調(diào)制核酸分子被濃縮的被檢試樣。具體而言，對(duì)被檢試樣添加蛋白質(zhì)去除劑之后攪拌或靜置使蛋白質(zhì)聚集之后，進(jìn)行離心分離處理而回收上清。
[0164]作為蛋白質(zhì)去除劑，例如可以使用尚子交換樹(shù)脂等對(duì)于蛋白質(zhì)未和性聞的物質(zhì)。
[0165]另外，也可以通過(guò)從被檢試樣中特異地回收目標(biāo)粒子，進(jìn)行工序(a)的濃縮。例如，可以通過(guò)使用凝膠過(guò)濾法、超濾法、HPLC法、電泳法等通常的化學(xué)的/分子生物學(xué)的手法，從被檢試樣中特異地回收目標(biāo)粒子。其他的，通過(guò)使被檢試樣接觸負(fù)載有與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的物質(zhì)的載體，使被檢試樣中的目標(biāo)粒子與載體結(jié)合，之后，從載體放出目標(biāo)粒子，由此能夠特異地回收目標(biāo)粒子。通過(guò)將放出后的目標(biāo)粒子溶解或分散于體積少于原來(lái)的被檢試樣的體積的適當(dāng)?shù)娜軇┲校軌蛘{(diào)制被濃縮的被檢試樣。作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的物質(zhì)，在目標(biāo)粒子為核酸分子的情況下可列舉出例如與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸。另外，在目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)分子的情況下，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的物質(zhì)，可列舉出與目標(biāo)粒子有抗原和抗體、或者配體與受體的關(guān)系的分子。
[0166]工序(a)中調(diào)制的被濃縮的被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度，高于濃縮前的被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度即可。通過(guò)預(yù)先將被檢試樣進(jìn)行濃縮，在接下來(lái)的工序(b)中，能夠調(diào)制目標(biāo)粒子的濃度更高的試樣溶液。如前述，掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定所需要的時(shí)間依賴(lài)于供于測(cè)定的試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。即，相比于不預(yù)先將被檢試樣濃縮的情況，第一檢測(cè)方法能夠在更短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。
[0167]接著，作為工序(b)，調(diào)制包含工序(a)中被濃縮的被檢試樣和用以與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，在該試樣溶液中，使前述目標(biāo)粒子與前述發(fā)光探針結(jié)合。具體而言，首先，在被濃縮的被檢試樣中添加發(fā)光探針，調(diào)制試樣溶液。此時(shí)，也可以根據(jù)需要，進(jìn)一步添加適當(dāng)?shù)娜軇Ｔ撊軇?，只要是不阻礙利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)由與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出的光的溶劑，就沒(méi)有特別的限定；可以從該【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的緩沖液中適宜選擇而使用。
[0168]作為該緩沖液，可列舉出例如:PBS(磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0169]對(duì)于工序(C)中的試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度或數(shù)密度，沒(méi)有特別的限定。從縮短掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定時(shí)間的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度高。但是，有濃度過(guò)高時(shí)反而測(cè)定精度降低的可能性。因此，工序(b)中優(yōu)選將試樣溶液調(diào)制成:試樣溶液中的目標(biāo)粒子的數(shù)密度是相對(duì)于前述光檢測(cè)區(qū)域的體積(Vd)為I分子以下。例如，試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度Xt (M)優(yōu)選滿(mǎn)足Xt.Na.Vd≤I (Na為阿伏加德羅常數(shù))。另外，為了充分地縮短測(cè)定時(shí)間，試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度Xt(M)優(yōu)選滿(mǎn)足I X 10_4 ≤Xt.Na.Vd ≤ 10例如，Vd為IfL的情況下，試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度Xt優(yōu)選為PM級(jí)的濃度。
[0170]只是使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針共存于相同的溶液中就能夠使兩者結(jié)合的情況下，調(diào)制試樣溶液之后，只需根據(jù)需要以規(guī)定時(shí)間孵育試樣溶液，就能使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針在試樣溶液中結(jié)合。
[0171]另一方面，目標(biāo)粒子、發(fā)光探針為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子或者核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，優(yōu)選使試樣溶液中的核酸等變性之后使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針締合。需要說(shuō)明的是，“使核酸分子或核酸類(lèi)似物質(zhì)變性”是指使堿基對(duì)解離。例如，使分子信標(biāo)探針中彼此互補(bǔ)的堿基序列所形成的堿基對(duì)解離，解開(kāi)分子內(nèi)結(jié)構(gòu)成為單鏈結(jié)構(gòu)，或使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。此外，當(dāng)發(fā)光探針是包含PNA等核酸類(lèi)似物質(zhì)的寡核苷酸時(shí)，即使目標(biāo)粒子是雙鏈核酸分子，有時(shí)不進(jìn)行特別的變性處理也可以形成包含發(fā)光探針和目標(biāo)粒子的締合體。
[0172]作為變性處理，可列舉出:利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。其中，熱變性對(duì)于熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的影響比較小且操作簡(jiǎn)便，所以?xún)?yōu)選進(jìn)行熱變性。具體而言，熱變性中，通過(guò)對(duì)試樣溶液實(shí)施高溫處理而使試樣溶液中的核酸分子等變性。通常地，DNA在90°C下、RNA在70°C下保溫?cái)?shù)秒至2分鐘左右，能夠使之變性；但根據(jù)目標(biāo)粒子的堿基的長(zhǎng)度等進(jìn)行變性的溫度也不同只要能夠變性就對(duì)其溫度沒(méi)有限定另一方面，通過(guò)低鹽濃度處理進(jìn)行變性可以是例如利用純水等稀釋?zhuān)瑢⒃撛嚇尤芤旱柠}濃度調(diào)整至足夠低，從而進(jìn)行。
[0173]根據(jù)需要進(jìn)行了變性之后，使前述試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針締合。
[0174]當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí)，在高溫處理后，使該試樣溶液的溫度降至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的溫度，由此能夠使該試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針適當(dāng)締合。另外，當(dāng)通過(guò)低鹽濃度處理進(jìn)行變性時(shí)，通過(guò)添加鹽溶液等，使該試樣溶液的鹽濃度升高至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的濃度，能夠使該試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針適當(dāng)
鋪A
?φ π O
[0175]需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)目標(biāo)粒子與發(fā)光探針形成的締合體的熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如可以使僅含有目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測(cè)定溶液的吸光度或熒光強(qiáng)度來(lái)求出熔解曲線。根據(jù)所獲得的熔解曲線，從變性的兩條單鏈核酸分子開(kāi)始形成締合體的溫度，至幾乎全部成為締合體的溫度這一范圍內(nèi)的溫度,都可以作為兩者能夠特異地雜交的溫度。也可以用使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化來(lái)代替溫度，同樣地確定熔解曲線，能夠求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0176]通?？梢杂肨m值(熔解溫度)，代替兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如，利用普遍使用的引物/探針設(shè)計(jì)軟件等，根據(jù)發(fā)光探針的堿基序列信息，能夠計(jì)算與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)。
[0177]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時(shí)，優(yōu)選使試樣溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使試樣溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性后，可以按0.050C /秒以上的降溫速度，降低試樣溶液的液溫。
[0178]此外，為了抑制非特異地雜交，優(yōu)選預(yù)先在試樣溶液中添加表面活性劑、甲酰胺、二甲亞砜或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過(guò)添加這些化合物，在較低溫度環(huán)境下也能夠防止非特異雜交的發(fā)生。
[0179]之后，作為工序(C)，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)調(diào)制的試樣溶液中與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。具體而言，將目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合后的試樣溶液設(shè)置于用于前述掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置。接著，通過(guò)前述的手法，檢測(cè)并解析由與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針發(fā)出的光，由此計(jì)數(shù)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。計(jì)數(shù)的目標(biāo)粒子數(shù)為測(cè)定試樣中所含的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。
[0180]另外，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，即便在調(diào)制包含被檢試樣和發(fā)光探針的試樣溶液之后對(duì)試樣溶液進(jìn)行濃縮處理來(lái)提高試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度，也能夠得到與第一檢測(cè)方法同樣的效果。
[0181]具體而言，本發(fā)明的第二方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法(以下，第二檢測(cè)方法)為檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有下述工序(a’)?(C’)。進(jìn)一步，本發(fā)明的第二方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，在工序(a’ )之后或工序(b’ )之后，進(jìn)行濃縮處理以提高試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
[0182](a’ )調(diào)制包含被檢試樣、和用以與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液的工序；
[0183](b’)使前述目標(biāo)粒子與前述發(fā)光探針在前述工序(a’)中調(diào)制的試樣溶液中結(jié)合的工序；
[0184](c’ )計(jì)數(shù)前述工序(b’ )中調(diào)制的試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
[0185]工序(a’ )和(b’ )可以與前述工序(b)同樣地進(jìn)行。另外，工序(c’ )可以與前述工序(C)同樣地進(jìn)行。
[0186]在工序(a’ )之后進(jìn)行的濃縮處理只要是不阻礙接下來(lái)的工序(b’ )中進(jìn)行的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合的處理，就沒(méi)有特別的限定，可以從將與目標(biāo)粒子同種的物質(zhì)進(jìn)行濃縮、分離或精制時(shí)使用的公知的化學(xué)/分子生物學(xué)的手法等中適宜選擇并使用。在工序(b’)后進(jìn)行的濃縮處理，只要是能夠濃縮且不使工序(b’)中形成的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體損失或減少的處理，就沒(méi)有特別的限制，可以從將與目標(biāo)粒子同種的物質(zhì)進(jìn)行濃縮、分離或精制時(shí)使用的公知的化學(xué)/分子生物學(xué)的手法等中適宜選擇并使用。
[0187]具體而言，例如，通過(guò)加溫/加熱或減壓等將溶劑蒸發(fā)或蒸散的方法、通過(guò)超濾去除溶劑的方法等只將被檢試樣中的溶劑去除而提高目標(biāo)粒子的濃度即可。另外，從被檢試樣中將目標(biāo)粒子和發(fā)光探針單獨(dú)地分離/精制之后，或者和與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針物理或化學(xué)的性質(zhì)近似的物質(zhì)一起分離/精制之后，使之溶解或分散于體積比分離/精制前的試樣溶液的體積少的適當(dāng)?shù)娜軇┲?，由此能夠調(diào)制被濃縮的被檢試樣。
[0188]目標(biāo)粒子和發(fā)光探針均為核酸分子的情況下，在工序(a’)之后或工序(b’ )之后進(jìn)行的濃縮處理可以與前述工序(a)中目標(biāo)粒子為核酸分子的情況下所例示的濃縮處理同樣地進(jìn)行。
[0189]對(duì)于工序(c’)中的試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度或數(shù)密度，沒(méi)有特別的限定。與第一檢測(cè)方法中的工序(C)同樣地，從縮短掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定時(shí)間的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度高。但是，有濃度過(guò)高時(shí)反而測(cè)定精度降低的可能性。因此，優(yōu)選將試樣溶液濃縮成為:試樣溶液中的目標(biāo)粒子的數(shù)密度是相對(duì)于前述光檢測(cè)區(qū)域的體積(Vd)為I分子以下。例如，試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度Xt(M)優(yōu)選滿(mǎn)足XT/NA/Vd< 1(Na為阿伏伽德羅常數(shù))。
[0190]實(shí)施例
[0191]接著，以下示出實(shí)施例等，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于下列實(shí)施例。
[0192][實(shí)施例1]
[0193]對(duì)于直接通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)被檢試樣中的目標(biāo)粒子的情況、和將被檢試樣中的目標(biāo)粒子濃縮之后通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)的情況，比較所計(jì)數(shù)的目標(biāo)粒子。
[0194]以單鏈核酸分子作為目標(biāo)粒子，將具有與單鏈核酸分子互補(bǔ)的堿基序列并且5’末端結(jié)合有ATTO (注冊(cè)商標(biāo))647N(ATT0-TEC公司制)的單鏈核酸分子作為發(fā)光探針，使用目標(biāo)粒子與發(fā)光探針雜交而成的熒光標(biāo)記雙鏈核酸分子(SOObp)作為與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0195]首先，調(diào)制熒光標(biāo)記雙鏈核酸分子的InM溶液作為被檢試樣。將熒光標(biāo)記雙鏈核酸分子溶液分注至2根1.5mL離心管中各200 μ L。向各離心管中加入3Μ的醋酸鈉溶液20 μ L進(jìn)行攪拌之后，加入500 μ L的99.5%乙醇攪拌之后，在室溫下靜置10分鐘。之后，將各離心管在20，000 X g下進(jìn)行10分鐘離心分離處理而去除上清。向得到的沉淀中加入70%乙醇500 μ L進(jìn)行攪拌之后，20，OOOXg下進(jìn)行10分鐘離心分離處理，去除上清。向一離心管中得到的沉淀中加入200 μ L的TE緩沖液，向另一離心管中得到的沉淀中加入20 μ L的TE緩沖液，分別攪拌使沉淀溶解。將由200 μ L的TE緩沖液調(diào)制的物質(zhì)作為通常被檢體、將由20 μ L的TE緩沖液調(diào)制的物質(zhì)作為濃縮被檢體。
[0196]將各被檢體作為試樣溶液，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記雙鏈核酸分子的分子數(shù)。另外，作為對(duì)照，只將TE緩沖液作為試樣溶液進(jìn)行計(jì)數(shù)。具體而言，在測(cè)量中，光分析裝置使用具備共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光檢測(cè)裝置MF20 (Olympus Corporation)。接著,對(duì)于上述的各試樣溶液,取得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此時(shí)，激發(fā)光使用633nm的激光，在旋轉(zhuǎn)速度6，000rpm、300yW下進(jìn)行照射，檢測(cè)光波長(zhǎng)使用帶通濾波器設(shè)為660~710nm。從雪崩光電二極管獲得的信號(hào)的BIN TIME設(shè)為10 μ秒，測(cè)定時(shí)間為2秒或20秒。
[0197]用Savinzky-Golay算法將由測(cè)定獲得的按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑化以后，通過(guò)微分進(jìn)行峰檢測(cè)。從被視為峰的區(qū)域中，提取可以擬合為高斯函數(shù)的區(qū)域作為信號(hào)。
[0198]將計(jì)數(shù)結(jié)果示于圖8Α、圖8Β和表1中。圖8Α表示光子數(shù)的測(cè)定結(jié)果。圖8Β表示峰數(shù)的測(cè)定結(jié)果。圖8Α、圖SB和表1中，“緩沖液”表示只將作為對(duì)照的TE緩沖液作為試樣溶液而計(jì)數(shù)的結(jié)果。結(jié)果，濃縮被檢體的2秒測(cè)定的光子數(shù)/峰數(shù)相當(dāng)于無(wú)濃縮的通常被檢體的20秒測(cè)定。即可知，即便是相同的被檢試樣，通過(guò)在利用掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定之前預(yù)先濃縮，能夠縮短測(cè)定時(shí)間。
[0199][表 I]
[0200]
【權(quán)利要求】
1.一種目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法， 其為檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有: (a)將被檢試樣濃縮以提高所述被檢試樣中的目標(biāo)粒子的濃度的工序；(b)調(diào)制包含所述工序(a)中被濃縮的被檢試樣和用以與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述試樣溶液中結(jié)合的工序；和 (C)計(jì)數(shù)所述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序； 在所述發(fā)光探針與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下、與所述發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同， 所述工序(C)中的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)通過(guò)如下工序進(jìn)行: 使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由所述光檢測(cè)區(qū)域中的與所述目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的所述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的工序；和 將所述逐個(gè)檢測(cè)的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述工序(c)中的試樣溶液中的目標(biāo)粒子的數(shù)密度是相對(duì)于所述光檢測(cè)區(qū)域的體積Vd為I分子以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述目標(biāo)粒子為核酸，所述工序(a)為從所述被檢試樣中精制核酸、進(jìn)行濃縮的工序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述工序(a)為從所述被檢試樣中特異地回收目標(biāo)粒子、進(jìn)行濃縮的工序。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以規(guī)定的速度移動(dòng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，以比所述與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在由所述檢測(cè)到的光檢測(cè)來(lái)自每個(gè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的光信號(hào)而逐個(gè)檢測(cè)所述與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的工序中，根據(jù)檢測(cè)到的按照時(shí)間順序的光信號(hào)的形狀，檢測(cè)到一個(gè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子進(jìn)入了所述光檢測(cè)區(qū)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中， 所述發(fā)光探針具有相互接近時(shí)產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位，并且，在所述發(fā)光探針與所述粒子結(jié)合的狀態(tài)以及所述發(fā)光探針不與所述粒子結(jié)合的狀態(tài)之間，所述能量供體部位與所述能量受體部位的距離不同； 在所述發(fā)光探針與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下、與所述發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下，由所述發(fā)光探針發(fā)出的光的發(fā)光特性不同。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述目標(biāo)粒子為核酸， 所述發(fā)光探針與所述目標(biāo)粒子特異地雜交，并且所述發(fā)光探針為單鏈核酸，該單鏈核酸上結(jié)合有熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的成為能量供體的熒光物質(zhì)以及成為能量受體的物質(zhì)的至少一者。
10.一種目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法， 其為檢測(cè)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有: (a’ )調(diào)制包含被檢試樣、和用以與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液的工序； (b’)使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述工序(a’)中調(diào)制的試樣溶液中結(jié)合的工序；和 (c’ )計(jì)數(shù)所述工序(b’ )中調(diào)制的試樣溶液中存在的、與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序； 所述發(fā)光探針在與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同； 所述工序(C’ )中的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)通過(guò)如下工序進(jìn)行:使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由所述光檢測(cè)區(qū)域中的與所述目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的所述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的工序；和 將所述逐個(gè)檢測(cè)的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序； 在所述工序(a’ )之后或所述工序(b’ )之后進(jìn)行濃縮處理以提高所述試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103620388SQ201280029647
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月27日
【發(fā)明者】西川和孝 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社