用于測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)的方法、用于從一群分析物中選擇分析物的方法 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)例如KD、kd和ka的方法，所述分析物與配體例如藥物和蛋白質(zhì)、藥物和受體以及抗體和抗原，其中最大結(jié)合應答Rmax或RL和至少一個結(jié)合參數(shù)在傳感器載體上存在的至少兩個不同配體表面密度下進行測定，并且將結(jié)合參數(shù)的值外推至特征在于Rmax=0或RL=0的配體密度=0，涉及選擇分析物和/或配體的方法，以及所選擇的配體、分析物和傳感器。
【專利說明】用于測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)的方法、用于從一群分析物中選擇分析物的方法、所選擇的配體或分析物及傳感器
[0001]本發(fā)明涉及用于測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)的方法、用于從一群分析物中選擇分析物的方法、所選擇的分析物或配體及用于這些方法的傳感器。
[0002]在藥物開發(fā)及其用于治療和預防的用途中，了解分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)是重要的。在這方面，分析物和配體可以包含藥物和蛋白質(zhì)、藥物和受體以及抗體和抗原。顯而易見的是，依賴于預期用途，配體和分析物可以是可互換的，例如作為配體的抗體與作為分析物的抗原的結(jié)合。類似地，配體可以與傳感器載體結(jié)合，并且配體存在于待與固定的分析物接觸的溶液中。但通過定義，固定至載體(所述載體在這種情況下是傳感器載體)的分子被稱為配體，并且溶液中的分子被稱為分析物并待與配體接觸，以便結(jié)合且從而測定結(jié)合參數(shù)，例如親和和解離常數(shù)、平衡解離常數(shù)(KD)、平衡結(jié)合常數(shù)(KA=1/KD)、解離速率常數(shù)(kd)和結(jié)合速率常數(shù)(ka)。[0003]結(jié)合參數(shù)例如此類相互作用對的親和常數(shù)可以通過多種常規(guī)技術(shù)例如等溫量熱法、熒光各向異性等進行測定。目前優(yōu)選的是無需標記配體或分析物而使用的測定技術(shù)。隨后例如通過表面等離振子共振，在傳感器載體的傳感器表面上測量在配體和分析物兩者之間的生物學相互作用。
[0004]分析物與配體的結(jié)合導致在生物傳感器的響應中的可測量變化，其根據(jù)時間進行記錄。這個記錄導致所謂的傳感圖。
[0005]分析物轉(zhuǎn)運至傳感器表面用于與固定的配體結(jié)合包括與配體結(jié)合和從配體釋放分析物的動力學。這個動力學結(jié)合和釋放依賴于分析物在傳感器表面上的流速，并且特別依賴于配體表面密度。此外,必須記住生物分子例如免疫球蛋白(Ig)包含分析物的兩個或更多個結(jié)合側(cè)面，從而使得在一方面配體和另一方面分析物兩者之間不存在1:1相互作用。
[0006]結(jié)合參數(shù)例如關于特定配體的親和常數(shù)通過給定表面密度可接受地測定，配體隨后以所述給定表面密度暴露于兩個或更多個分析物濃度。對所得到的傳感圖實施擬合程序，導致結(jié)合參數(shù)以及Rmax的測定，所述Rmax代表分析物與傳感器表面上的所有可用配體的結(jié)合。
[0007]這種測定結(jié)合參數(shù)的方法具有若干缺點。一個缺點是再結(jié)合。當分析物與配體結(jié)合時，發(fā)現(xiàn)特定Rmax。分析物隨后可以釋放且其后可以與另一個配體分子再結(jié)合。然而，在這個結(jié)合、釋放和再結(jié)合過程中，分析物不離開用于由生物傳感器測量的消逝場(evanescentfield)或窗口。相應地，無法測量分析物的釋放。這意味著解離速率將測量為太低，這可以導致與實際固有解離平衡常數(shù)(和解離速率)的差異。
[0008]另一個缺點是1:1相互作用(如上所示)不一定存在。如果分析物或配體包含兩個結(jié)合側(cè)面(具有相等或不同的結(jié)合強度)，則結(jié)果是所謂的雙相表現(xiàn)。進一步地，將發(fā)生經(jīng)由兩個結(jié)合側(cè)面的結(jié)合，并且隨后當更多分析物分子被結(jié)合或捕獲時，結(jié)合側(cè)面之一(結(jié)合強度更小的側(cè)面)將被釋放，并且結(jié)合進一步的分析物分子。這個問題對于抗體和抗原是特別相關的。
[0009]另外，當分析物分子在所謂的停滯層中擴散時，發(fā)生稱為大量轉(zhuǎn)運限制的物理速率測定過程，這影響分析物與傳感器表面上固定的配體的結(jié)合的結(jié)合速率常數(shù)。在層流條件下注入分析物的過程中，分析物在這個非攪拌的停滯層中擴散并且將由表面捕獲。當分析物濃度相對低且傳感器的容量很高時，動力學過程是有限的擴散或有限的大量轉(zhuǎn)運。這導致起始線性結(jié)合過程(δ折射單位(RU)/秒)，其依賴于分析物的濃度、溫度和決定停滯層厚度的流動條件。當配體密度更低時，大量轉(zhuǎn)運(mass transport)限制效應更小。
[0010]相應地，在計算生物分子相互作用的速率和親和常數(shù)中可能存在問題。眾所周知如果在傳感器載體的傳感器芯片表面上發(fā)生固定/捕獲分子的再結(jié)合效應、雙相行為、大量轉(zhuǎn)運限制和/或立體阻礙，則表觀速率和親和常數(shù)kd、ka和Kd將顯著改變。
[0011]本發(fā)明的目的是避免這些問題，并且從而使得測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)可行。這意味著測定的結(jié)合參數(shù)不再依賴于目前使用的測定方法的缺陷，并且特別是不依賴于在其下執(zhí)行測定的條件(例如配體密度、分析物濃度以及在配體和分析物兩者之間的相互作用類型)。
[0012]本發(fā)明的方法應用多個配體表面密度的陣列，并且使分析物暴露于陣列，導致通過將關于待測量的結(jié)合參數(shù)的值例如表觀kd和Kd值外推至Rmax=O或RfO的單一速率和親和常數(shù)。理論上，這意味著單一配體分子與其單一分析物分子的親和常數(shù)在極限為零的響應中測定。
[0013]根據(jù)本發(fā)明提供的是用于測定分析物與配體(例如藥物和蛋白質(zhì)、藥物和受體以及抗體和抗原)的固有結(jié)合參數(shù)例如KD、kd和ka的方法，其中最大結(jié)合應答Rniax和至少一個結(jié)合參數(shù)以傳感器載體上存在的至少兩個不同配體表面密度進行測定，并且將結(jié)合參數(shù)的值外推至Rmax=O或Rl=O0
[0014]Rniax值反映與配體密度成比例的分析物結(jié)合容量。如果配體無法直接固定或是不純的，則使抗配體配體偶聯(lián)至傳感器載體，并且通過抗配體捕獲配體。隨后應測量兩步相互作用過程；首先捕獲目的配體，隨后為分析物與所捕獲配體的結(jié)合。在這種情況下，配體密度被測量為稱為&的捕獲值，并且可以執(zhí)行至配體密度接近于零的外推。&值還可以測定，如果配體的固定水平是由配體與傳感器表面的結(jié)合程度得知的。換言之，生物分子相互作用速率和平衡參數(shù)可以通過外推至計算的Rmax=O或測量的R^O (以捕獲或直接方式)或兩者進行計算。
[0015]本發(fā)明基于下述了解:當測量分析物與以漸減表面密度存在于傳感器載體的測量表面上的配體的結(jié)合時，與再結(jié)合、大量轉(zhuǎn)運限制和/或雙相行為有關的問題得到校正或避免，并且測定明顯更接近在配體和分析物兩者之間的1:1相互作用條件。
[0016]使用可接受的外推法，特征在于Rmax=O或RfO值的接近于零的配體密度可以由多個傳感圖測定，并且導致對于特定配體/分析物組合特有的固有結(jié)合參數(shù)。在極限為零的條件RfO或Rniax=O中的這個配體密度時，分析物與傳感器載體的表面上的一個配體結(jié)合，并且基本上回避其他配體和/或分析物分子。相應地，本發(fā)明提供了用于用于測定分析物與配體(例如藥物和蛋白質(zhì)、藥物和受體以及抗體和抗原)的固有結(jié)合參數(shù)例如KD、kd和ka的方法，其中最大結(jié)合應答Rmax和至少一個結(jié)合參數(shù)以至少兩個不同的配體濃度進行測定，并且將結(jié)合參數(shù)的值外推至Rmax=O或R1=O。[0017]應當指出通過定義配體與傳感器載體的測量表面結(jié)合，而分析物以不同濃度提供用于與固定配體結(jié)合。相應地，配體可以是抗體或抗原，并且依次地分析物則分別是抗原和抗體。這同樣適用于配體是藥物、蛋白質(zhì)或受體。&是配體捕獲的應答，并且對應于分析物結(jié)合位點數(shù)目/點。數(shù)據(jù)點用指數(shù)方程y=a ebx擬合。通過將R^X外推至0，可以測定接近于單一分析物分子與單一配體分子相互作用的速率常數(shù)kdK°、kaE0和解離平衡常數(shù)Kd'代替使用&值，由分析物應答計算的Rmax可以用于將kd和Kd值外推至零應答。Rmax值是當所有配體分子都由分析物分子飽和時的理論應答值。計算的Rmax和&的比值是恒定的，并且與分子量成比例:Mw^_/Mws#:=Rmax/RL。交叉檢查可以通過比較對于將Rl或Rmax外推至零計算的R_和實驗測定的&的比值進行。理論上，對于將&或Rmax外推至零的值應是相等的。
[0018]明顯地，當對分析物實施超過兩個不同的配體濃度或表面密度時，用于測定固有結(jié)合參數(shù)的方法更可靠。優(yōu)選地，使用3-10和更實際的3-6個不同的配體濃度或表面密度。
[0019]當通過兩個不同的配體表面密度或配體的系列表面稀釋度來測定結(jié)合參數(shù)時，在Rl=O或Rmax=O時的結(jié)合參數(shù)可以通過外推進行測定。然而，已發(fā)現(xiàn)指數(shù)擬合是有利地優(yōu)選的，因為指數(shù)擬合更好地考慮到較低&或Rmax值的影響。 [0020]如上文所示，優(yōu)選結(jié)合參數(shù)使用1:1相互作用模型進行測定。這個模型不僅是相對直截了當?shù)?，而且在RfO或Rmax=O時的結(jié)合參數(shù)測定也基于在配體和分析物兩者之間的1:1相互作用。
[0021]在許多情況下，如果配體無法直接固定或是不純的，則使抗配體配體偶聯(lián)至傳感器載體，并且通過抗配體捕獲配體。信號&可以用于外推。
[0022]抗配體的例子包括但不限于鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、抗IgG等。當配體是所謂的標簽時，則抗配體是抗標簽，例如針對標簽的抗標簽，包括但不限于his標簽、FLAG標簽、CBP標簽、MBP標簽、GST標簽、HA標簽、myc標簽、isopep標簽、BCCP、f丐調(diào)蛋白標簽、nus標簽、綠色滅光蛋白標簽、硫氧還蛋白標簽、S標簽、Sof標簽、SBP標簽、Ty標簽、DNA標簽等。
[0023]對于測定，使用標記和非標記分析物(例如生物素化和非生物素化)的混合物可以是有利的。不同類型的分析物可以順次使用或作為混合物在結(jié)合實驗中使用。
[0024]如果測定將在含水介質(zhì)中執(zhí)行和/或傳感器載體具有非最適性質(zhì)，則使中間層例如親水層附著至傳感器載體，并且使配體與傳感器載體直接結(jié)合或者經(jīng)由中間(親水)層例如水凝膠基質(zhì)或扁平單層(planair monolayer)或薄層與傳感器載體間接結(jié)合可以是有利的。首先使抗配體與傳感器載體或中間層例如水凝膠基質(zhì)共價結(jié)合可以是優(yōu)選的，所述抗配體隨后可以在測定已執(zhí)行前捕獲配體。為了捕獲配體密度系列，抗配體可以以抗配體密度系列稀釋度固定。以另一種方式，抗配體可以作為均質(zhì)捕獲表面偶聯(lián)，并且配體可以在梯度密度系列中捕獲。通過例如鏈霉抗生物素蛋白或經(jīng)由標簽的此類親和捕獲是充分公認的用于使配體與固體載體結(jié)合的方法。
[0025]根據(jù)優(yōu)選實施方案的是配體在具有此類厚度的表面層中分布，從而使得導致對于抗體優(yōu)選在50-500RU范圍中的5-3000RU (折射單位)的Rl值。對于具有~150kD的分子量的抗體，這分別對應于5pg/mm2-3ng/mm2和50_500pg/mm2的配體表面密度。因而形成其中配體均質(zhì)或非均質(zhì)分布的3維層。這將獲得更大的結(jié)合容量/表面區(qū)域。[0026]根據(jù)優(yōu)選實施方案，使分析物濃度同時暴露于不同的配體表面密度或濃度，并且對于每個配體表面密度或濃度生成傳感圖。相應地，能夠使用多個分析物濃度的更少注入以更高速度和以更可靠方式執(zhí)行測定。
[0027]不同配體表面密度可以通過各自具有不同配體表面密度的不同表面區(qū)域形成。然而，還能夠提供具有兩個或更多個表面區(qū)域的傳感器載體，所述表面區(qū)域各自包含沿著表面區(qū)域的一個或兩個方向延伸的配體表面密度中的逐漸和/或逐步變化。明顯地，用經(jīng)由抗配體或抗標簽與傳感器載體間接結(jié)合的配體也將獲得相同結(jié)果。
[0028]如果使用至少兩個不同類型的配體，并且使用在混合物中的兩種不同分析物或順次使用兩種不同分析物，則能夠同時執(zhí)行更多配體與分析物的相互作用。在此類情況下，優(yōu)選外推通過局部或總體擬合優(yōu)選通過局部擬合來完成。局部擬合意味著由每個傳感圖測定速率和平衡值，而總體擬合意味著聚合來自若干次分析物注入的傳感圖并且測定所謂的動力學速率和親和常數(shù)的“總體”值。換言之，當總體擬合使用多個分析物濃度執(zhí)行時，則可以僅對于Rmax和結(jié)合參數(shù)計算一個值/配體表面密度或濃度。相應地，使用局部擬合是有利的，因為即使outcast (排斥)也可以容易地甚至自動地被拒絕。此外，為局部擬合提供相當大的測量點集合，這可以導致通過外推更可靠和更容易的Rmax=O測定。
[0029]與總體擬合有關，值得注意的是來自更高分析物濃度的傳感器貢獻對“總體”值相等貢獻，而在外推過程中使用局部擬合參數(shù)，更低分析物濃度(更好地接近分析物與配體的單一分子結(jié)合)對“真正的”親和常數(shù)貢獻更多。
[0030]當生物傳感器不僅包含兩個不同的配體表面密度或濃度，而且測定也以至少兩個分析物濃度執(zhí)行時，提供了固有結(jié)合參數(shù)的極佳測定方法。
[0031]當需要測定超過一個固有結(jié)合參數(shù)例如平衡解離常數(shù)和/或解離和結(jié)合速率時，可以優(yōu)選同時測定每個傳感圖的至少兩個結(jié)合參數(shù)，隨后為結(jié)合參數(shù)的值外推至&或R =0
iVmax w °
[0032]如前所示，任何無標記的相互作用分析技術(shù)可以用于根據(jù)本發(fā)明測定固有結(jié)合參數(shù)。此類技術(shù)包括石英晶體微量天平(QCM)表面聲波、干涉量度法例如楊和馬赫曾德爾干涉儀(Young and Mach Zehnder interferometer)、雙層干涉儀,但優(yōu)選表面等離振子共振(SPR)。
[0033]本發(fā)明的另一個方面涉及用于選擇與配體結(jié)合的分析物或分析物群的方法，其包括步驟:
[0034]i)根據(jù)如權(quán)利要求1-9中任一項要求的方法測定分析物或分析物群的固有結(jié)合參數(shù)；和
[0035]ii)選擇具有更佳固有結(jié)合參數(shù)的一種或多種分析物。
[0036]當已測定多種分析物對于相同配體或多種配體的固有結(jié)合參數(shù)時，則能夠測定對于配體的最佳或最適分析物。這意味著配體或分析物對于抑制生理學狀態(tài)、病理學狀態(tài)或疾病將是最佳的。
[0037]本發(fā)明的另外一個方面涉及根據(jù)這種方法選擇且隨后對于治療生理學狀態(tài)、病理學狀態(tài)或疾病是最適的分析物(或配體)。
[0038]本發(fā)明的最后一個方面涉及適合于在根據(jù)本發(fā)明用于測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)的方法中使用的傳感器。此類傳感器特別預期用于在表面等離振子共振(SPR)中使用。表面等離振子共振適合于檢測特定分析物與配體的實時和無標記生物分子相互作用，所述配體固定在具有微芯片形式的傳感器上。例如，IBIS-1SPR儀器的成像特征允許同時檢測例如數(shù)百個例如120個相互作用。
[0039]表面區(qū)域可以具有環(huán)形、矩形點、斑點等形式，具有10-1000 μ m、優(yōu)選50-600 μ m、更優(yōu)選100-300 μ m的尺度。
[0040]配體可以與傳感器載體直接結(jié)合或者經(jīng)由抗配體或抗標簽與傳感器載體結(jié)合。優(yōu)選地，傳感器載體包括包含金包衣(厚度10- 100A,例如30-70 如50 和/或鈦
或鉻包衣(厚度1-5人)的基底表面。這提供了在SPR測量中的最佳測試結(jié)果。配體與基
底表面直接結(jié)合或者經(jīng)由抗配體或抗標簽或者經(jīng)由中間層例如具有所需厚度的親水層與基底表面結(jié)合。
[0041]具有所需配體表面密度的表面區(qū)域或點可以使用點樣儀例如陣列點樣儀在陣列中定向。當表面包含以逐漸、逐步或隨機次序的多個配體表面密度時，則表面區(qū)域可以具有更大的尺寸或非環(huán)形或延伸形式。例如，5-1000個點可以通過使用陣列點樣儀在陣列中排列。優(yōu)選地，使用可以點不同陣列的連續(xù)流微型點樣儀，所述不同陣列例如48個點(6x8陣列)或96個點(8x12陣列)的陣列。
[0042]傳感器載體還可以包含參考和空白表面區(qū)域或點。這些點可以用于校正、用于補償非特異性結(jié)合。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的方法所提及的及其他的特征和特點將參考下述實施例進一步舉例說明和討論，所述實施例僅給出用于信息目的并且不預期在任何方面限制本發(fā)明。在這方面，對附圖作出參考，其中:
[0044]圖1是其中通過將Kd和kd外推至其中Rmax=O計算的Kd和kd值/RoI針對具有漸減配體密度的Rniax進行標繪的圖表；
[0045]圖2是其中用Scrubber生成的局部擬合數(shù)據(jù)的Kd和kd值針對具有漸減配體密度的RoI的Rniax或&進行標繪的圖表；
[0046]圖3是用于測定和驗證LGR5與RSP0-1結(jié)合的速率和親和常數(shù)kd、ka和Kd的圖表；和
[0047]圖4-7示意了 SPR傳感器載體的多個實施方案提供不同配體密度。
[0048]實施例1:使用Scrubber總體曲線擬合在Rmax=O時的Kd和kd外推
[0049]執(zhí)行關于全長抗體赫賽汀的Fab片段的研究，并且通過應用低濃度的分析物和弱點分析在Fab片段和完全IgG分子之間有效存在親和常數(shù)的恒定關系。當存在對于該抗體可用的豐富表位時，雙相行為尤其在高配體密度時是顯著的。
[0050]使用本發(fā)明的方法，測定Kd親和常數(shù)。由于IgG結(jié)構(gòu)包含兩個結(jié)合臂/位點的性質(zhì)，存在關于雙相效應的潛在危險。危險隨著陣列點上的配體密度降低而降低?？捎玫谋砦辉缴?，IgG分子的第二個“臂”可以在第一個“臂”解離后結(jié)合變得越不可能。另外，當少數(shù)表位可用時，則解離分子立即擴散到傳感器表面的消逝場外是更可能的。因此所謂的“再結(jié)合效應”也降到最低。使用IBIS MX96 (IBIS BV，Enschede，荷蘭)允許測量與漸減配體密度/點的陣列的生物分子相互作用。每個點的雙相行為和再結(jié)合效應將降低，并且每個點的有效親和常數(shù)可以使用每個相互作用曲線的局部擬合分析進行測定。以這種方式，親和力Kd可以外推至其中僅一個配體分子可用的理論情況，因此“理論上”完全取消雙相效應和再結(jié)合效應。有效地，測定在最大應答O時的Kd值。
[0051]Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, UTAH, US 的 CFM 陣列打印機用于產(chǎn)生整個點陣列，其中相同配體以系列更低的配體密度。通過使點暴露于系列稀釋的(2x)配體濃度生成陣列中至8個點的多個配體密度。通過首先測定在解離相的kd值，隨后測定在結(jié)合相的ka和Rmax值，對于所有這些ROI計算的局部速率和親和參數(shù)可以用于標繪計算的kd和Kd相對于計算的Rmax。在圖1中，使用用于四個ROI的Ab數(shù)據(jù)集的例子用于將Kd和kd外推MR_0。對于這個外推，使用常規(guī)指數(shù)擬合算法，因為在更低的配體密度下，更多的統(tǒng)計權(quán)重必須給予數(shù)據(jù)點-這些值理論上更接近于“真正的”或固有結(jié)合參數(shù)Kd和kd。
[0052]通過將Rmax=X=O輸入擬合方程y=aebx，e的指數(shù)變成0，因此基數(shù)e變成1，僅留下系數(shù)a作為在Rmax=O時的Kd和kd值。在這種情況下，在Rmax=O時的Kd可以計算為1.10E-10M，并且在Rmax=O時的kd可以計算為3.34E-05，還參見圖1。直接由單個點計算結(jié)合參數(shù)可以從 KD=30pM 到 IlOpM 不等。
[0053]實施例2:使用Scrubber局部曲線擬合在Rmax=O或Rlj時的Kd和kd外推
[0054]Scrubber2.0[BioLogic Software, Campbell,澳大利亞]的局部擬合選項可以用于通過更多數(shù)據(jù)點生成曲線擬合，參見圖2。使用在段落3.4.3下所述的方法，可以由用Scrubber2.0生成的局部擬合數(shù)據(jù)計算在Rmax=O時的Kd和kd。在這種情況下,在Rmax=O或Rl=O時的Kd可以計算為7.55E-11M，并且在Rmax=O或Rl=O時的kd可以計算為2.68E-05。
[0055]表1概括了使用不同分析方法對于赫賽汀數(shù)據(jù)集獲得的親和參數(shù)。用針對平均值具有最小殘值的IBIS局部方法獲得良好校正。
[0056]表3.用于測定赫賽汀數(shù)據(jù)集的親和參數(shù)的分析方法概括。
[0057]
【權(quán)利要求】
1.用于測定分析物與配體的固有結(jié)合參數(shù)例如KD、kd和ka的方法，所述分析物與配體例如藥物和蛋白質(zhì)、藥物和受體以及抗體和抗原，其中最大結(jié)合應答&或1?_和至少一個結(jié)合參數(shù)以傳感器載體上存在的至少兩個不同配體表面密度進行測定，并且將所述結(jié)合參數(shù)的值外推至特征在于R1=O或Rmax=O的配體密度=0。
2.如權(quán)利要求1中要求的方法，其中所述結(jié)合參數(shù)在所述配體的一系列不同配體表面密度下進行測定。
3.如權(quán)利要求1或2中要求的方法，其中所述配體分布在對所述分析物可滲透的表面層中。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項中要求的方法，其中所述配體的抗配體偶聯(lián)至所述傳感器載體，并且所述配體通過所述抗配體捕獲。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項中要求的方法，其中使所述分析物暴露于在單個表面區(qū)域和/或不同表面區(qū)域上的所述傳感器載體上的逐步或逐漸增加的配體表面密度。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項中要求的方法，其中使分析物濃度同時暴露于所述不同配體表面密度,并且其中對于每個配體濃度生成傳感圖。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項中要求的方法，其中使用至少兩種配體，并且使用在混合物中的至少兩種分析物或順次使用至 少兩種分析物。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項中要求的方法，其中所述外推通過指數(shù)擬合、通過局部或總體擬合優(yōu)選通過局部擬合完成。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項中要求的方法，其中所述結(jié)合應答通過表面等離振子共振進行測量。
10.用于從一群分析物中選擇與配體或配體群結(jié)合的分析物的方法，其包括步驟: i)根據(jù)如權(quán)利要求1-9中任一項要求的方法測定所述分析物或分析物群與所述配體或配體群的固有結(jié)合參數(shù)；和 ii)選擇具有更佳固有結(jié)合參數(shù)的所述分析物。
11.如權(quán)利要求10中要求的方法，其中所述配體和/或分析物是藥理學活性藥物，優(yōu)選地所述配體和/或分析物與生理學狀態(tài)、病理學狀態(tài)或疾病有關。
12.用于在醫(yī)學中使用例如用于治療生理學狀態(tài)、病理學狀態(tài)或疾病的，通過根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法選擇的配體和/或分析物。
13.包含任選經(jīng)由抗配體與之附著的至少一種配體的傳感器載體的傳感器，優(yōu)選表面等離子體共振傳感器，其包含所述配體的一系列不同的配體表面密度，優(yōu)選在單個表面區(qū)域和/或不同表面區(qū)域上的所述傳感器載體上的逐步或逐漸增加的配體表面密度。
14.如權(quán)利要求13中要求的傳感器，其中所述配體分布在對所述分析物可滲透的表面層中。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的傳感器，其中至少兩種配體直接或間接附著至所述傳感器載體或傳感器表面層。
【文檔編號】G01N33/543GK103748467SQ201280031506
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月11日
【發(fā)明者】R·B·M·沙斯福特, G·H·M·恩波斯 申請人:Ssens有限責任公司, Ibis技術(shù)有限責任公司