用于鑒定小于48小時之前發(fā)作的心房纖維性顫動患者的中段前心鈉肽(pro-ANP)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于確定患者從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間的方法，包括步驟：提供所述患者的體液樣品，確定所述樣品中proANP(SEQ?ID?NO:1)或其片段的水平，使proANP或其片段的水平與所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間相關(guān)聯(lián)，其中所述片段具有至少6個氨基酸殘基長度。
【專利說明】用于鑒定小于48小時之前發(fā)作的心房纖維性顫動患者的中段前心鈉肽(pro-ANP)
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于臨床診斷領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及確定在源自心房纖維性顫動患者的體液的樣品中的中段前心鈉肽(MR-proANP)水平。
[0002]發(fā)明背景
[0003]心房纖維性顫動(AF)是需要治療并涉及心臟的兩個上室(心房)的最常見心臟心率失常。在美國大約二百二十萬名個人并且在歐盟大約四百五十萬名個人患有AF(_等人，2010.Eur Heart T.31:2369-2429:Go 等人，2001.TAMA285:2370-2375)。它也占因心臟節(jié)律紊亂而住院的1/3人數(shù)(Fuster等人，2006.Circulationl 14: e257_354),并且近年來因 AF 而住院的比率已經(jīng)上升(Friberg 等 K , 2004.Epidemiologyl4:666-672)。 AF的患病率隨年齡而增加，從40-50歲時0.5%至80歲時5-15% (Camm等人，2010.Eur HeartT.31:2369-2429)。心房纖維性顫動的發(fā)生率也隨年齡而增加。在發(fā)達國家中，心房纖維性顫動患者的數(shù)目可能下一個50年期間增加，原因在于老年個體的比例增長(Go等人，2001.TAMA285:2370-2375)。
[0004]其名稱源自心房的心肌纖維性顫動(即，顫抖)，而非協(xié)調(diào)收縮。經(jīng)?？梢酝ㄟ^搭脈并觀察到心搏不以規(guī)律間隔出現(xiàn)而鑒定它。然而，AF的更有力指標是在心電圖(ECG或EKG)缺少P波，在每次心臟搏動伊始存在協(xié)調(diào)的心房收縮時，所述P波正常情況下存在。
[0005]AF與改變的耐力和增加的死亡風險相關(guān)，獨立于其他心臟風險因子(Beniamin等人，1998.Circulation98:946-952)。AF的最常見和毀滅性的后果是中風。源自AF的中風占全部缺血性中風的 6-24%(Narumiya 等人，2003.Circulation Journal67 (I):68-72)。在恢復心房機械活動后，AF的電復律和藥理學復律可能并發(fā)中風(Camm等人，2010.Eur HeartT.31:2369-2429:Halperin 等人，1988, Strokel9:937-941)。
[0006]美國心臟病學會(ACC)、美國心臟協(xié)會(AHA)和歐洲心臟學學會(ESC)在它們的指南基于簡潔性和臨床相關(guān)性推薦以下分類系統(tǒng)(Fuster等人，2006.Circulationl 14:e257-354)。全部心房纖維性顫動患者起初在該分類中稱作首次檢測的AF。這些患者可以存在或可以不存在先前檢測不到的發(fā)作。如果首次檢測的發(fā)作在不到7日內(nèi)自我終止并且隨后另一次發(fā)作稍后開始，則病例進展至陣發(fā)性AF的分類。雖然處于這個分類的患者具有持續(xù)至多7日的發(fā)作，但在大多數(shù)陣發(fā)性AF病例中，發(fā)作將在不到24小時內(nèi)自我終止。如果發(fā)作反而持續(xù)超過7日，則它不太可能自我終止(Levy2000.Curr OpinCardiol 15:54-57)并將它稱作持續(xù)性AF。在這種情況下，可以通過復律終止發(fā)作。如果復律不成功或不想采用它并且發(fā)作繼續(xù)長時間進行(例如一年或更長時間)，則患者的AF稱作永久性的。
[0007]除主要由發(fā)作時程和終止限定的以上4種分類之外，ACC/AHA/ESC指南就患者其他特征而言描述了另外的AF分類(Fuster等人，2006.Circulationl 14:e257_354):孤立性心房纖維性顫動(LAF)-不存在其他心血管疾病(包括高血壓)、相關(guān)肺病或心臟異常(如左心房擴張)的臨床或超聲心動術(shù)結(jié)果并且年齡小于60歲；非瓣膜性AF-不存在風濕性二尖瓣病、心臟瓣膜假體或二尖瓣修復；繼發(fā)性AF-在原發(fā)性病狀的背景下發(fā)生，所述原發(fā)性病狀可能是AF的病因，如急性心肌梗死、心臟外科、心包炎、心肌炎、甲狀腺功能亢進、肺栓塞、肺炎或其他急性肺病。
[0008]心房纖維性顫動常伴隨與快速心率相關(guān)的癥狀?？焖俸筒灰?guī)則的心率可能覺察為心悸、鍛煉不耐受并且偶爾產(chǎn)生咽峽炎(如果速率更快并且使心臟處于緊張時)和氣短或水腫的充血癥狀。有時，將僅隨著中風或暫時性缺血性發(fā)作(TIA)的發(fā)作鑒定到心率失常。對于從例行體格檢查或ECG首先知道AF的患者，它并不少見，因為它在許多情況下可能是無癥狀的(Fuster 等人,2006.Circulationll4:e257~354)。
[0009]由于大部分心房纖維性顫動病例繼發(fā)于其他醫(yī)學問題，所以胸痛或咽峽炎的存在、甲狀腺功能亢進癥狀(過度活躍的甲狀腺)如體重減輕和腹瀉以及提示肺病的癥狀將指示潛在病因。中風或TIA的先前病史以及高血壓(高血壓)、糖尿病、心力衰竭和風濕熱可以指示患有AF的某人是否存在較高的并發(fā)癥風險(Fuster等人，2006.Circulationll4:e257~354)。
[0010]心房纖維性顫動可以用減慢心率或使心臟節(jié)律恢復至正常的藥物治療。復律是利用電手段或化學手段使不規(guī)則心搏非侵入性地轉(zhuǎn)變成正常心搏(Fuster等人，2006.Circulationll4:e257-354)。外科療法和基于導管的療法也可以用來防止某些個體中AF的復發(fā)。經(jīng)常給予患有AF的人抗凝血藥如阿司匹林、肝素、華法林或達比加群以保護他們免于中風。
[0011]當考慮復律時，AF的持續(xù)時間變得重要，并且通常認為具有小于48小時的AF發(fā)作的患者可以安全地接受迅速復律，而具有超過48小時的AF發(fā)作的患者必須用抗凝血藥治療持續(xù)多于3周或在復律之前接受經(jīng)食道超聲心動術(shù)(TEE) (Camm等人，2010.Eur Heart T.31:2369-2429:Fuster 等 人,2006.Circulationll4:e257~354:Page 等人，2004.NE頂351:2408-2416:Klein 等人，2001.NE頂344:1411-1420: Tessup 等人，2009.Circulationll9:1977-2016)?？梢栽趫蟾婕毙孕募?、呼吸困難或暈厥的患者中確定AF的持續(xù)時間。然而，無癥狀或不明顯的AF經(jīng)常發(fā)生(Savelieva等人，2000.Pacing clin Electrophysiol23:145-148);在加拿大 AF 記錄中，21% 新診斷患有 AF 的患者是無癥狀的(Kerr等人，1996.Eur Heart T17Suppl C:48-51)。在另一項研究中，17%的患者在他們提到明顯的AF相關(guān)癥狀之前具有無癥狀的AF發(fā)作(Page等人，2003.Circulationl07:1141-5)。總體上，AF持續(xù)時間的臨床確定(低于或高于48小時)可能在臨床實踐中經(jīng)常是有害的，這指出需要幫助臨床醫(yī)生在呈現(xiàn)之前精確確定AF持續(xù)時間的新工具。
[0012]先前研究已經(jīng)提出一些生物標志物(主要是B-型鈉尿肽類)在AF患者的風險分級或予頁測AF發(fā)生方面的可倉M尤點(Defteros等人,2010.Heart96:1033-1036:.Tourdain等人，2002.Eur T Heart Fail4:263_267:Maisel 等人，2002.NETO347:161-167:Theius 等人,2009.1ndian Pacing Electrophysiol.T9:1-4)。Deftereos 及其合作者手艮道，患有小于24小時的AF并且沒有心力衰竭的患者具有ΝΤ-ρι.οΒΝΡ波動的特定樣式，所述樣式以頭24小時內(nèi)進行性升高隨后快速下降為特征(Defteros等人，2010.Heart96:1033-1036)。他們得出結(jié)論:在沒有心力衰竭的不能令人滿意地確定發(fā)作時間的AF患者中在24小時獲得2個至3個血漿ΝΤ-ρι.οΒΝΡ水平可以輔助確定心率失常發(fā)作是否為新近的，并且這類信息將與涉及抗凝和復律的決策相關(guān)。然而，基于這類ΝΤ-ρι.οΒΝΡ波動的患者分類可能在臨床實踐中是有害的并且在可以作出決定之前需要延長對患者的監(jiān)測。相比之下，Tsuchida和Tanabe顯示BNP已經(jīng)在AF發(fā)作后4小時內(nèi)立即升高并且BNP水平并不顯著地與AF發(fā)作后流逝的時間相關(guān)(Tsuchida 和 Tanabe2004.T Cardiol44:1~11)。
[0013]發(fā)明簡述
[0014]本發(fā)明的主題是一種用于確定患者從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間的方法，包括步驟:
[0015]i)提供所述患者的體液樣品，
[0016]ii)確定所述樣品中proANP或其片段的水平，
[0017]iii)使proANP或其片段的水平與所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間相關(guān)，
[0018]其中所述片段具有至少6個氨基酸殘基的長度。
[0019]在從屬權(quán)利要求中描述優(yōu)選的方法變體。
[0020]發(fā)明詳述
[0021]心房纖維性顫動(AF)定義為不規(guī)則的異常心臟節(jié)律，伴隨心臟的心房中不規(guī)則地生成電信號，這可以通過以下方式鑒定:搭脈并觀察到心搏不以規(guī)則間隔出現(xiàn)和/或進行心電術(shù)(ECG或EKG)，其中缺少P波表示有AF，所述正P波在每次心臟搏動伊始存在協(xié)調(diào)的心房收縮時通常情況下存在。
[0022]復律是使用電或藥物將異常快的心率或心臟心率失常轉(zhuǎn)變成正常節(jié)律的醫(yī)療方法(Shea等人，2002.Ciculationl06:el76~178)。同步電復律在心動周期中的特定時刻向心臟使用治療性劑量的電流。藥理學復律，也稱作化學復律，使用抗心律失常藥物而非電擊。
[0023]為了進行同步電復律，使用兩個電極極板(或，可選地，傳統(tǒng)手持式“電極板”)，每種極板包括面朝基于鹽水的導電凝膠的金屬板。將極板置于患者的胸部上，或?qū)⒁粋€極板置于胸部上并將一個極板置于背部上。這些極板由電纜連接至一臺儀器，該儀器具有ECG顯示器和除顫器電功能的聯(lián)合功能。同步功能(或者:手工地操作或自動的)允許復律器借助極板在預(yù)定的毫秒數(shù)內(nèi)在心動周期中的最佳時刻遞送具有所選擇量的電流的逆轉(zhuǎn)電擊，所述最佳時刻對應(yīng)于ECG上QRS復合波的R波。相對于R波對電擊計時防止在心動周期的易顫期(或相對不應(yīng)期)期間遞送電擊，這可能誘導心室顫動。如果患者是有意識的，則經(jīng)常使用各種藥物幫助鎮(zhèn)靜患者并使得該方法更可忍受。然而，如果患者在血液動力學上是不穩(wěn)定的或無意識的，則一旦證實心率失常則立即給予電擊。當同步電復律作為可選方法進行時，電擊可以結(jié)合藥物療法一起進行直至竇性節(jié)律實現(xiàn)。在該方法后，監(jiān)測患者以確保竇性節(jié)律的穩(wěn)定性。同步電復律法用來治療血液動力學上明顯的室上(或窄復合波)心動過速，包括心房纖維性顫動和心房撲動。當脈搏存在時，它也用于急救治療寬復合波心動過速，包括室性心動過速。無脈搏室性心動過速和心室顫動用稱作除顫的非同步電擊法治療。電治療不適用于竇性心動過速，它應(yīng)當總是鑒別診斷的部分。
[0024]多種抗心律失常藥可以用來使心臟回轉(zhuǎn)至正常竇性節(jié)律。藥理學復律在顫動最近發(fā)作的患者中是特別好的選項。在電復律后有效維持正常節(jié)律的藥物也可以用于藥理學復律。在復律之前給予藥物如胺碘酮、地爾硫卓、維拉帕米和美托洛爾以降低心率、穩(wěn)定患者并增加復律成功的機會。存在最有效用于藥理學復律的兩類藥物。I類藥物是鈉(Na)通道阻滯劑(其通過阻斷Na+通道減慢傳導)并且劃分成3個亞類a、b和c:1a類減慢心室中的O期去極化并增加絕對不應(yīng)期。普魯卡因胺、奎尼丁和丙吡胺是Ia類藥物。Ib類藥物縮短3期復極化。它們包括利多卡因，美西律(mexiletine)和苯妥英并且Ic類藥物最終大幅度減慢心室中的O期去極化(然而不同于la，對不應(yīng)期沒有影響)。氟卡尼、莫雷西嗪和普羅帕酮是Ic類藥物。II類藥物是抑制SA和AV節(jié)去極化并減慢心率的β阻滯劑。它們也降低心臟需氧量并且可以防止心臟重塑。并非全部β阻滯劑是相同的，一些是具有心臟選擇性(僅影響β I受體)，其他是非選擇性的(影響β I和2受體)。靶向β -1受體的β阻滯劑稱作心臟選擇性，因為β-1負責增加心率；因此β阻滯劑將減慢心率。III類藥物通過阻斷向外的K+流延長復極化。胺碘酮和索他洛爾是有效的III類藥物。伊布利特是另一種III類藥物，但是具有不同的作用機制(發(fā)揮作用促進鈉經(jīng)慢鈉通道內(nèi)流)。已經(jīng)顯示它在新近發(fā)作型心房纖維性顫動和心房撲動的急性復律方面有效。IV類藥物是鈣(Ca)通道阻滯劑。它們通過抑制SA節(jié)和AV節(jié)的動作電位發(fā)揮作用。
[0025]如果可獲得有經(jīng)驗的技術(shù)人員和適宜設(shè)施，推薦經(jīng)食道超聲心動術(shù)(TEE)指導的復律策略作為3周復律前抗凝法的替代，并且當需要早期復律時，不適用復律前口服抗凝血藥，原因在于患者選擇或潛在的出血風險或當存在左心房/左心耳血栓的高風險時(Klein等人，2001.NETM344:1411-1420)。TEE是進行超聲心動術(shù)的替代方式。在其尖端含有超聲法換能器的專用探測器通入患者的食道中。這產(chǎn)生可以記錄的圖像和多普勒評價。
[0026]充分認識到復律后血栓栓塞風險增加。因此，對于超過48小時的AF或持續(xù)時間未知的AF，認為在電復律之前抗凝是必須的。對于AF超過48小時的電復律和藥理學復律，推薦預(yù)防血栓。在小于48小時的明確AF發(fā)作的患者中，可以在靜脈內(nèi)施用未分級肝素，隨后輸注或皮下給予低分子量肝素的掩護下方便地進行復律。在具有中風風險因子(例如心力衰竭、高血壓、老年、糖尿病、先前中風或TIA)的患者中，應(yīng)當在復律后啟動口服抗凝血藥治療并終生持續(xù)。在無血栓栓塞風險因子的患者中不需要口服抗凝血藥。
[0027]抗凝血藥是防止凝血的物質(zhì)；即，它阻止血液凝固。一組稱作抗凝血藥的藥物可以在體內(nèi)用作血栓形成病癥的藥物?？诜鼓幇ㄏ愣顾?維生素K拮抗藥)，例如華法林、醋硝香豆醇和苯丙香豆素或苯茚二酮?？梢酝ㄟ^注射使用抗凝血藥肝素。通過防止血凝塊形成和血液內(nèi)部現(xiàn)有血凝塊擴大，肝素和其低分子量衍生物(例如依諾肝素、達肝素鈉、亭扎肝素)有效在存在風險的患者中預(yù)防深靜脈血栓形成和肺栓塞。另一種類型的抗凝血藥是凝血酶直接抑制劑。該類型的現(xiàn)有成員包括阿加曲班、來匹盧定、比伐蘆定和達比加群。
[0028]在本發(fā)明的一個實施方案中，確定患者中從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間高于或低于某個時間臨界值。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，確定患者中從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間是48小時或高于或低于48小時。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，確定患者中從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間是24小時或高于或低于24小時。
[0029]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，當確定所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間低于所述時間臨界值時，以此作為患者應(yīng)當適用于立即復律的指標。
[0030]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，當確定所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間處在或高于所述時間臨界值時，以此作為患者應(yīng)當用抗凝血藥治療和/或應(yīng)當在復律之前接受經(jīng)食道超聲心動術(shù)(TEE)的指標。
[0031]在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，復律優(yōu)選地是電復律和/或藥理學復律。
[0032]心鈉肽(ANP)(鈉尿肽家族的成員)調(diào)節(jié)幾項生理學參數(shù)，包括利尿和鈉尿增多，并且降低動脈血壓(BP)。它優(yōu)勢地在心臟的心房中產(chǎn)生并且占到循環(huán)狀態(tài)下鈉尿肽的98% (Vesely DL.Life2002; 53:153-159)。ANP衍生自其前體激素原的切割，所述前體激素原在循環(huán)時比成熟肽顯著地更穩(wěn)定。前體激素的中段片段(ΝΤ-ρι?ΑΝΡ的第53-90位氨基酸)(稱作中段-proANP (MR-proANP))，可以相對地抵抗外蛋白酶類降解，不同于先前免疫測定法中所使用的proANP N-端或C端中的表位(MorRenthaler NG等人，ClinChem2004; 50:234-236:Gerszten RE 等人，2008.Am T Physiol Lung Cell Mol Physiol)。
[0033]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用針對與proANP片段MR-proANP(SEQ IDNO:4)相對應(yīng)的氨基酸序列的至少一種抗體，確定proANP或其片段的水平。
[0034]在本發(fā)明的一個特定實施方案中，另外地確定可能影響所述患者中proANP或其片段的水平的至少一個臨床參數(shù)。這種臨床參數(shù)優(yōu)選地選自年齡、性別、共病和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)，最優(yōu)選地選自年齡和BMI。例如，已知proANP水平隨年齡漸增而增力卩。當固定年老患者的臨界值時，應(yīng)當考慮這種更高的水平。與這些臨床參數(shù)相關(guān)，可以參考Morgenthaler等人,Clin Chem.2004, 234 ；Gegenhuber 等人,Clin Chem.2006, 827 ；Gegenhuber 等人,JCard Fail.2007, 42 ；von Haehling 等人，J Am Coll Cardiol.2007，1973 ;Khaleghi 等人，Am J Cardiol.2009, 1257 ;Krueger等人，Intensive Care Med.2007, 2069 ;&Mueller等人，J Intern Med.2006，568,所述文獻均通過引用的方式并入本文。
[0035]也可能并且可以改善結(jié)果的可靠性以確定除proANP或其片段之外的一個或多個生物標志物，尤其通常與心房纖維性顫動或心血管疾病相關(guān)的生物標志物。這類另外生物標志物的優(yōu)選例子是ProBNP及其片段，特別是NT-proBNP和/或BNP。在這個方面，可以參考TO2008/077396A1和W02008/106938A2，所述文獻是通過引用的方式并入本文。
[0036]如本文中提到，術(shù)語“片段”指從較大蛋白質(zhì)或肽可衍生的較小蛋白質(zhì)或肽，因此它包含較大蛋白質(zhì)或肽的部分序列。所述片段是從較大蛋白質(zhì)或肽，通過其一個或多個肽鍵的皂化而可衍生的。所述片段是從ANP的激素原(proANP ;SEQ ID NO:1)可衍生的任何片段。proANP的這些片段優(yōu)選地涉及至少6個氨基酸長度、最優(yōu)選地至少12個氨基酸殘基長度的片段。proANP的已知片段包括ANP (SEQ ID NO: 2)、NT-proANP (SEQ ID NO: 3)和MR-proANP(SEQ ID N0:4)。這類片段優(yōu)選地用如本文所述的免疫學測定法可檢測。
[0037]如本文中提到，“測定法”或“診斷測定法”可以是診斷領(lǐng)域中應(yīng)用的任何類型測定法。這種測定法可以基于待檢測的分析物以某種親和力與一個或多個捕獲探針結(jié)合。就捕獲分子和靶分子或目的分子之間的相互作用而言，親和常數(shù)優(yōu)選地大于IO8M'
[0038]在本發(fā)明的上下文中，“捕獲分子”是可以用來結(jié)合來自樣品的靶分子或目的分子即分析物(即在本發(fā)明的上下文中，心血管肽)的分子。捕獲分子因此必須在空間上并且就表面特征，如表面 電荷、疏水性、親水性、存在或不存在路易斯供體和/或受體而言充分地成型，以特異性結(jié)合靶分子或目的分子。因此，結(jié)合可以例如由捕獲分子和靶分子或目的分子之間離子性、范德瓦爾斯、、σ-J1、疏水性或氫鍵相互作用或兩種或更多種前述相互作用的組合介導。在本發(fā)明的上下文中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、糖分子、PNA分子、蛋白質(zhì)、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選地，捕獲分子是抗體，包括對靶分子或目的分子具有足夠親和力的其片段并且包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體或其片段的化學和/或生物化學修飾的衍生物，所述片段源自具有至少12個氨基酸長度的變體鏈。
[0039]優(yōu)選的檢測方法包括各種形式的免疫測定法，例如放射免疫測定(RIA)、化學發(fā)光免疫測定法和熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、基于Luminex的珠陣列、蛋白質(zhì)微陣列測定法和快速檢測形式，例如免疫層析試紙條檢測。
[0040]測定法可以是均相或多相測定法、競爭性或非競爭性測定法。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，測定法處于夾心測定法的形式，所述夾心測定法是非競爭性免疫測定法，其中待檢測和/或定量的分子與第一抗體結(jié)合并且與第二抗體結(jié)合。第一抗體可以與固相(例如珠、板孔或其他容器的表面、芯片或試紙條)結(jié)合，并且第二抗體是(例如用染料、用放射性同位素或反應(yīng)性或催化活性部分)標記的抗體。隨后通過適宜的方法測量與分析物結(jié)合的標記抗體的量。涉及“夾心測定法”的一般組成和程序是充分建立的并且是技術(shù)人員已知的(The Tmmunoassay Handbook,編者 David Wild, Elsevier LTD, Oxford:第 3 版(2005 年 5 月)，ISBN-13:978-0080445267:Hultschig C 等人，Curr Qpin ChemBiol.2006Feb:10(1):4~10.PMID: 16376134,通討弓I用的方式并入本文)。
[0041]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，測定法包含兩種捕獲分子，優(yōu)選地包含均作為分散體存在于液體反應(yīng)混合物中的抗體，其中第一標記組分與第一捕獲分子連接，其中所述第一標記組分是基于熒光猝滅或化學發(fā)光猝滅或擴增的標記系統(tǒng)的部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二標記組分與第二捕獲分子連接，從而一旦兩種捕獲分子與分析物結(jié)合，則生成可度量信號，所述可度量信號允許檢測包含樣品的溶液中所形成的夾心復合物。
[0042]甚至更優(yōu)選地，所述標記系統(tǒng)包含與熒光染料或化學發(fā)光染料、尤其花青型染料組合的稀土元素穴狀化合物或稀土元素螯合物。在本發(fā)明的上下文中，基于熒光的測定法包括使用染料，所述染料可以例如選自FAM(5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、IRD-700/800、菁染料，如 CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、咕噸、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯熒光素(HEX)、TET、6_羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基熒光素(JOE)、N，N，N’，N’_四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5_羧基羅丹明-6G(R6G5)、6-羧基羅丹明-6G(RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、B0DIPY染料，如BODIPY TMR、俄勒網(wǎng)綠、香豆素類，如傘形酮、苯甲酰亞胺類，如Hoechst33258 ;菲啶，如德克薩斯紅、Yakima黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙啶、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、多次甲基染料等。
[0043]在本發(fā)明的上下文中，基于化學發(fā)光的測定法包括基于在下述文獻中對化學發(fā)光材料所述的物理原理使用染料Kirk-Qthmer, Encyclopedia of chemical technology,第 4版.執(zhí),對丁編輯,T.1.Kroschwitz:編輯,M.Howe-Grant, Tohn ffiley&Sons, 1993,第 15 卷，第518-562頁，所沭文獻通過引用的方式并入本文，包括第551-562頁上的引文。優(yōu)選的化學發(fā)光染料是吖啶酯。
[0044]甚至更優(yōu)選,所述標記系統(tǒng)包含與突光染料組合的稀土元素穴狀化合物或稀土元素螯合物。
[0045]如本文所用的術(shù)語“患者”指正在接受醫(yī)療護理或因疾病而應(yīng)當接受醫(yī)療護理的活人或非人生物。這包括未患有限定疾病的人，其中對這些人就病變的體征研究。
[0046]如本文所用，術(shù)語“樣品”指出于受試者(如患者)的診斷、預(yù)后或評價目的所獲得的體液樣品。優(yōu)選的測試樣品包括血清、血漿、腦脊液、尿、唾液、痰、和胸腔積液。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到在分級或純化方法(例如，將全血分離成血清或血漿組分)后將更輕易地分析一些試樣。
[0047]因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿樣或前述任何樣品的提取物。優(yōu)選地，樣品是血液樣品，最優(yōu)選地血清樣品或血漿樣品。
[0048]在適宜的情況下，樣品可能在本發(fā)明中使用之前需要均化或用溶劑提取以獲得液體樣品。液體樣品因而可以是溶液或懸液。液體樣品可以在本發(fā)明中使用之前經(jīng)歷一個或多個預(yù)處理。這類預(yù)處理包括但不限于稀釋、過濾、離心、濃度、沉降、沉淀、透析。預(yù)處理也可以包括向溶液添加化學或生物化學物質(zhì)，如酸、堿基、緩沖液、鹽、溶劑、反應(yīng)性染料、去垢齊U、乳化劑、螯合劑。
[0049]診斷和/或預(yù)后試驗的靈敏度和特異性不只是取決于檢驗的分析“品質(zhì)”，它們還取決于構(gòu)成異常結(jié)果的定義。在實踐中，接受者操作特征曲線(R0C曲線)一般通過將變量的值對其在“正常”群體(即，表觀健康)和“疾病”群體(即患有心房纖維性顫動的患者)中的相對頻率作圖進行計算。對于任何特定標志物，針對患病或不患病的受試者的標志物水平的分布將可能重疊。在這類條件下，某檢驗的確無法以100%準確度絕對地區(qū)分正常與患病，并且重疊區(qū)域表示該檢驗在何處不能區(qū)分正常與患病。選擇閾值，其中高于所述閾值(或低于所述閾值，這取決于標志物怎樣隨疾病變化)，則將該檢驗視為異常并且低于所述閾值，則將該檢驗視為正常。ROC曲線下面積是所構(gòu)思量值將導致正確鑒定某病狀的概率的量度。甚至當檢驗結(jié)果并不必然地給出精確數(shù)字時，可以使用ROC曲線。只要可以將結(jié)果排序，就可以產(chǎn)生ROC曲線。例如，可以根據(jù)程度將對“患病”樣品檢驗的結(jié)果排序(例如1=低，2=正常，和3=高)。這種排序可以與“正常”群體中的結(jié)果相關(guān)，并且產(chǎn)生ROC曲線。這些方法是本領(lǐng)域熟知的(見例如，Hanley等人，1982.RadioloRyl43:29-36)。優(yōu)選地，ROC曲線產(chǎn)生大于約0.5、更優(yōu)選地大于約0.7、仍更優(yōu)選地大于約0.8、甚至更優(yōu)選地大于約0.85并且最優(yōu)選地大于約0.9的曲線下(AUC)面積。術(shù)語“約”在這種語境下指給定量值的+/_5%。
[0050]ROC曲線的水平軸代表(1-特異性)，其隨假陽性率而增加。該曲線的垂直軸代表靈敏度，其隨真陽性率而增加。因此，對于選擇的特定截值，可以確定(1-特異性)的值，并且可以獲得相應(yīng)的靈敏度。ROC曲線下面積是所測量的標志物水平將導致正確鑒定某疾病或病狀的概率的量度。因此，ROC曲線下面積可以用來確定檢驗的有效性。
[0051]在某些實施方案中，標志物或標志物組合顯示出至少約70%靈敏度、更優(yōu)選地至少約80%靈敏度、甚至更優(yōu)選地至少約85%靈敏度、仍更優(yōu)選地至少約90%靈敏度并且最優(yōu)選地至少約95%靈敏度，前者與至少約70%特異性、更優(yōu)選地至少約80%特異性、甚至更優(yōu)選地至少約85%特異性、仍更優(yōu)選地至少約90%特異性并且最優(yōu)選地至少約95%特異性組合。在特別優(yōu)選的實施方式中，靈敏度和特異性均是至少約75%、更優(yōu)選地至少約80%、甚至更優(yōu)選地至少約85%、仍更優(yōu)選地至少約90%并且最優(yōu)選地至少約95%。術(shù)語“約”在這種語境下指給定量值的+/_5%。
[0052]閾值水平可以例如從Kaplan-Meier分析獲得，其中疾病的出現(xiàn)與標志物在群體中的四分位數(shù)相關(guān)。根據(jù)這項分析，標志物水平高于第75百分位數(shù)的受試者具有顯著增加的屬于下述組的概率，其中所述組低于某個時間臨界值的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間。這個結(jié)果進一步得到對經(jīng)典風險因子全面調(diào)節(jié)的Cox回歸分析支持:相對于全部其他受試者的最高四分位數(shù)高度顯著地與低于某個時間臨界值的時間間隔相關(guān)。
[0053]其他優(yōu)選的臨界值例如是正常群體的第90百分位數(shù)、第95百分位數(shù)或第99百分位數(shù)。通過使用比第75百分位數(shù)更高的百分位數(shù)，降低了鑒定的假陽性受試者的數(shù)目，但是可能錯過鑒定風險為中度但仍增加的受試者。因而，可以根據(jù)是否認為如下更適宜:以還鑒定出“假陽性”為代價鑒定出大多數(shù)存在風險的受試者，或是否認為如下更適宜:以錯失幾位處于中度風險的受試者為代價主要鑒定出高風險受試者，采用該臨界值。
[0054]通過使用個體的標志物水平值和其他預(yù)后性實驗室參數(shù)和臨床參數(shù)計算個體風險的其他數(shù)學概率，例如NRI (凈重新分類指數(shù))或IDI (綜合區(qū)分指數(shù))?？梢愿鶕?jù) Pencina(Pencina M.T 等人，Evaluating the added predictive ability of a newmarker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond.StatMed.2008:27:157-172)計算這些指數(shù)。
[0055]根據(jù)該方法，當所述確定的proANP或其片段水平、MR-proANP水平高于預(yù)定閾值水平時，診斷該患者具有流逝的小于48小時從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間。優(yōu)選地，預(yù)定閾值水平在100和350pmol/L之間，更優(yōu)選地在100pmol/L和250pmol/L之間，甚至更優(yōu)選地在100pmol/L和190pmol/L之間,最優(yōu)選地在100pmol/L和160pmol/L之間。
[0056]上文提到的值可能在檢測proANP或其片段的其他測定法中是不同的，如果這些測定法已經(jīng)按不同方式校準?？紤]到校準中的差異，上文提到的值應(yīng)當因此適用于這類按不同方式校準的ProANP測定法。一種對校準中差異量的可能性是所討論的proANP測定法與通過使用兩種方法測量樣品中proANP或其片段的在本發(fā)明中使用的MR-proANP測定法的方法比較分析(相關(guān)性)。另一個可能性是鑒于這個檢驗法具有足夠的分析性靈敏度，采用所討論的proANP測定法確定；將代表性正常群體的中位數(shù)proANP水平與如本文所述的中位數(shù)分析物水平比較；并且基于借助這種比較所獲得的差異，重新計算校準。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]現(xiàn)在將參考附圖和以下實施例更詳細地描述本發(fā)明。在附圖中，
[0058]圖1顯示與小于48小時從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間相關(guān)的MR-proANP和ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的接受者操作曲線，和
[0059]圖2顯示與小于24小時從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間相關(guān)的MR-proANP和ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的接受者操作曲線。
實施例
[0060]研究設(shè)計和群體
[0061]從2010年6月至2010年9月，考慮納入推薦至柯欽醫(yī)院(Cochin Hospital)心內(nèi)科以便管理AF的連續(xù)患者。基于ECGJf RR間距(心電圖中兩個連續(xù)R波之間的時間)不規(guī)則、無明顯P波和心房周期長度(當可見時)可變且<200ms的AF定義為心臟心率失常。排除標準是1)AF作為急性病狀(即術(shù)后急性心肌梗死、敗血癥、急性呼吸衰竭)的并發(fā)癥，2)患有嚴重腎衰竭的患者(肌酐清除率<30ml/分鐘)，和3)以下患者，其呈現(xiàn)AF及臨床上基于氣短(新近或惡化)疑似并且必須根據(jù)當前指南加以證實的并發(fā)性急性失代償性心力衰竭(.Tessup等人，2009.Circulationll9:1977-2016)?；颊咛峤粫嬷橥鈺?，并且本地倫理委員會批準該方案。
[0062]例行臨床評估和管理
[0063]除臨床史、體格檢查和12導聯(lián)ECG之外，全部患者均進行I)胸部放射線照相術(shù)；2)標準血液檢查，包括血清學檢測甲狀腺功能和肝臟酶測量；和3)經(jīng)胸超聲心動圖(TTE)，由有經(jīng)驗的心臟病專家使用ATLHDI5000系統(tǒng)(ATL超聲和Bothell，華盛頓，DC)根據(jù)美國超聲心動圖協(xié)會指南進行。
[0064]進行TEE和在采用復律的節(jié)律控制策略或心率控制策略之間選擇的決定交由醫(yī)師決定。根據(jù)目前建議，考慮對其復律的患者必須用口服抗凝血藥治療至少3 周或接受 TEE (Camm 等人，2010.Eur Heart T.31:2369-2429:Fuster 等人，2006.Circulationll4:e257~354)。
[0065]評估發(fā)作至呈現(xiàn)的時間
[0066]將AF劃歸為陣發(fā)性、持續(xù)性或長期，并且由2位心臟病學家按以下事項獨立地確定發(fā)作時間:1)由患者報告的癥狀發(fā)作(主要是心悸)，2)先前的可能院內(nèi)和院外ECG和24小時霍爾特監(jiān)測結(jié)果，和3)掌管病人的院外醫(yī)師(包括全科醫(yī)生)通知的最后心臟節(jié)律。由第三位心臟病學家消除不一致。
[0067]生物化學分析
[0068]在含有Li+-肝素鹽的塑料管中采集血液樣品，并且在分析之前血漿貯存在_80°C。在呈現(xiàn)時在以仰臥位置持續(xù)至少30分鐘的患者中從外周肘前靜脈采集血液樣品。使用Kryptor分析儀(B.R.A.H.M.S GmbH,黑尼格斯多夫，德國)測量MR-proANP。這種熒光免疫測定法使用時間分辨放大穴狀化合物發(fā)射(TRACE)技術(shù)，所述技術(shù)基于因完成的免疫反應(yīng)而從供體分子(穴狀化合物)至接納體分子(XL665)的非放射性能量轉(zhuǎn)移。已經(jīng)在其他地方評價和描述了該方法的分析性能。在我們的實驗室中，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)(CV)是〈5%，在419.0pmoI/L 時是3.4%并且在 89.2pmol/L 時是 3.7%(Chenevier-Gobeaux 等人，2010.ClinChem56:1708-1717)。
[0069]使用市售免疫突光測定法(ElecsysproBNP, Roche Diagnostics, Mannheim,德國)測量血漿ΝΤ-ρι.οΒΝΡ水平。測定法具有30pg/mL的功能靈敏度，測量上限為35000pg/mL并且變異系數(shù)處于1.0-6.0%范圍內(nèi)。
[0070]統(tǒng)計分析
[0071]數(shù)值表述為均值土標準偏差，中位數(shù)加四分位[IQR]范圍，或如果適宜，計數(shù)和百分比。使用Spearman相關(guān)性研究鈉尿肽和其他變量之間任何相關(guān)性的存在。首先使用針對連續(xù)變量的Student t_檢驗或Mann-Whitney U檢驗和用于頻率差異的卡方檢驗或Fisher精確檢驗(如果適宜)，以單變量分析研究鈉尿肽和其他臨床參數(shù)和實驗室參數(shù)在新近發(fā)作(小于48小時)患者與具有更延長的AF的患者之間區(qū)分的能力。隨后進行多變量對數(shù)回歸，包含從單變量分析出現(xiàn)的全部變量以檢驗由鈉尿肽提供的可能的獨立診斷信息。構(gòu)建接受者操作特征(ROC)曲線以評估整個鈉尿肽濃度范圍內(nèi)的靈敏度和特異性；從ROC曲線確定理想臨界值并且報告靈敏度和特異性。使用STATA版本10.1 (StataCorp LP,College Station, TX)執(zhí)行全部統(tǒng)計分析并且小于0.05的p-值視為統(tǒng)計顯著。[0072]結(jié)果
[0073]從2010年6月至2010年9月，推薦57位患者以便管理AF。在這些患者中，不能納入9位患者(4位患者具有急性心肌梗死，3位患者患有心原性或非心原性休克，I位患者患有嚴重腎衰竭并且I位患者患有急性失代償性心力衰竭)。在一位另外的患者中未測量鈉尿肽。因此納入47位患者。表1中列出患者的〈/≥48小時的AF發(fā)作至呈現(xiàn)時間特征。納入時的中位數(shù)年齡是72歲[61-81]并且性別比率是1.9。AF在22位患者中呈陣發(fā)性，在6位患者中呈持續(xù)性并且在19位患者中呈長期性。19位患者(40.4%)在48小時內(nèi)出現(xiàn)AF發(fā)作，整個隊列中AF的中位數(shù)持續(xù)時間是5日[1-120]。
[0074]MR-proANP水平是78.8至903.3pmol/L。MR-proANP部分地但是顯著與從AF發(fā)作至呈現(xiàn)的時間、LV射血分數(shù)(LVEF)，血紅蛋白相關(guān)，但是不與心率或肌酐濃度相關(guān)(表2)。另外,MR-proANP 和 NT-proBNP 是顯著相關(guān)的(Spearman r=0.71,ρ〈0.001)。表 3 中顯不不同亞組(分別是陣發(fā)性、持續(xù)性和長期AF)之間的MR-proANP濃度。
[0075]分析從AF發(fā)作至呈現(xiàn)的時間(〈/≥48小時)
[0076]AF發(fā)作小于48小時的患者與AF發(fā)作≥48小時的患者相比，具有明顯降低的 MR-proANP(分別是 144.0[129.2-213.7]pmol/L 對比 321.7[236.4-425.6]pmol/L,p〈0.001)(表3)。與AF〈48小時相關(guān)的其他變量是較小年齡、增加的心率、保持的LVEF (左心室射血分數(shù))、保持的血紅蛋白(表1)。在多變量分析中，MR-proANP是保持與小于48小時的AF相關(guān)的唯一變量(p=0.021)。
[0077]鑒定入院之前具有小于48小時的AF發(fā)作的患者的ROC曲線下面積對于MR-proANP 和 NT-proBNP 分別是 0.90 及 0.82 (ρ〈0.05 ;圖1)。移除 LVEF〈50% 的患者(12位患者)不改變結(jié)果；在這種情況下MR-proANP在AF小于48小時的患者中是140.8[129.2-191.6]pmol/L,相比之下在 AF ≥ 48 小時的患者中是 321.7[213.5-422.0]pmol/L (ρ〈0.001)。
[0078]基于ROC曲線分析，我們鑒定了 MR-ρι?ΑΝΡ的兩個可能臨界值以檢測入院之前具有小于48小時的AF發(fā)作的患者。191.6pmol/L的臨界值將分別產(chǎn)生85.7%的靈敏度和73.8%的特異性，161.9pmol/L的臨界值將分別產(chǎn)生92.9%的靈敏度和63.2%特異性，表4中給出示例性MR-proANP臨界值在從AF發(fā)作至呈現(xiàn)的時間小于48小時的患者和從AF發(fā)作至呈現(xiàn)的時間> 48小時的患者之間進行區(qū)分的靈敏度和特異性。
[0079]序列
[0080]SEQ ID NO:1 (proANP 的氨基酸序列):
[0081]I NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS
[0082]51 PLPEVPPffTG EVSPAQRDGG ALGRGPffDSS DRSALLKSKL RALLTAPRSL
[0083]101 RRSSCFGGRM DRIGAQSGLG CNSFRY
[0084]SEQ ID NO: 2 (ANP 的氨基酸序列):
[0085]I SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY
[0086]SEQ ID NO:3 (NT-proANP 的氨基酸序列):
[0087]I NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS
[0088]51 PLPEVPPffTG EVSPAQRDGG ALGRGPffDSS DRSALLKSKL RALLTAPR
[0089]SEQ ID NO:4(MR-proANP 的氨基酸序列):[0090]I PEVPPffTGEV SPAQRDGGAL GRGPffDSSDR SALLKSKL
[0091]SEQ ID NO:5 (proBNP 的氨基酸序列):
[0092]I HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV
[0093]51 WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL
[0094]101 GCKVLRRH
[0095]SEQ ID NO:6 (BNP 的氨基酸序列):
[0096]I SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH
[0097]SEQ ID NO:7 (NT-proBNP 的氨基酸序列):
[0098]I HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV
[0099]51 WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPR
[0100]表1.患者特征(從AF發(fā)作至呈現(xiàn)的時間〈/≥48小時)
【權(quán)利要求】
1.一種用于確定患者中從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間的方法，包括步驟: (i)提供所述患者的體液樣品， (ii)確定所述樣品中proANP(SEQID NO:1)或其片段的水平， (iii)使ProANP或其片段的水平與所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間相關(guān)聯(lián)， 其中所述片段具有至少6個氨基酸殘基的長度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中確定患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間處在或高于某個時間臨界值或低于某個時間臨界值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中時間臨界值是48小時或高于或低于48小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中時間臨界值是24小時或高于或低于24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述樣品選自血液、血清、血漿、腦脊液、尿或唾液，優(yōu)選地血液、血清或血漿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中使用針對與proANP片段MR-proANP(SEQ ID NO:4)相對應(yīng)的氨基酸序列的至少一種抗體,確定proANP或其片段的水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的方法，其中，當確定所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間低于所述時間臨界值時，以此作為患者應(yīng)當施用于立即復律的指標。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的方法，其中，當確定所述患者的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間處在或高于所述時間臨界值時，以此作為患者應(yīng)當用抗凝血藥治療和/或應(yīng)當在復律之前接受經(jīng)食道超聲心動術(shù)(TEE)的指標。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中復律是電復律和/或藥理學復律。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中當所述確定的proANP(SEQIDNO:1)或其片段的水平高于預(yù)定閾值水平時，診斷所述患者具有低于所述時間臨界值的從心房纖維性顫動發(fā)作至呈現(xiàn)的時間。
11.根據(jù)權(quán)利要求1O所述的方法，其中預(yù)定閾值水平在100和350pmo I /L之間，更優(yōu)選地在100pmol/L和250pmol/L之間，甚至更優(yōu)選地在100pmol/L和190pmol/L之間,最優(yōu)選地在 100pmol/L 和 160pmol/L 之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中除proANP或其片段之外還確定至少一種生物標志物，優(yōu)選地與心血管疾病、優(yōu)選與心房纖維性顫動相關(guān)的生物標志物，最優(yōu)選地確定ProBNP及其片段，特別優(yōu)選地NT-proBNP和/或BNP。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中另外地確定可影響所述患者中proANP或其片段的水平的至少一個臨床參數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中臨床參數(shù)選自包括年齡、性別、共病和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)的組，優(yōu)選地年齡和BMI。
【文檔編號】G01N33/68GK103765219SQ201280037660
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月28日
【發(fā)明者】C·摩恩 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司, 公共救濟事業(yè)局-巴黎醫(yī)院, 笛卡爾巴黎大學