目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】該目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，(a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有前述發(fā)光探針的前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序；(b)在前述工序(a)之后，從前述溶液中通過(guò)固液分離處理回收前述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；(c)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法算出前述試樣溶液中存在的前述復(fù)合體的分子數(shù)；前述分離回收用粒子與由前述目標(biāo)粒子和前述發(fā)光探針形成的結(jié)合體結(jié)合。
【專(zhuān)利說(shuō)明】目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)到來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)求出在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)、且與基于固液分離處理的分離回收用粒子結(jié)合后的粒子的濃度的方法。
[0002]本申請(qǐng)基于2011年8月30日在日本提交的日本特愿2011-187600號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來(lái)光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)行生物分子等的分子間相互作用或者分子間的結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測(cè)的各種裝置或方法。提出有例如，熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn) I ?3、非專(zhuān)利文獻(xiàn)I?3)中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)定來(lái)自在試樣溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光聚光而成的焦點(diǎn)區(qū)域，被稱為共焦體積。)內(nèi)出入的熒光分子或進(jìn)行了熒光標(biāo)記的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度。然后基于由測(cè)定的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值確定的、微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值，能夠取得熒光分子等的運(yùn)動(dòng)速度或大小、濃度這類(lèi)信息，或者檢測(cè)到分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集的各種現(xiàn)象。此外，提出有利用突光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)4、非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)或光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)5)，與FCS同樣地，生成檢測(cè)到的出入共焦體積內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖。并且，通過(guò)對(duì)該直方圖的分布擬合統(tǒng)計(jì)學(xué)公式而算出熒光分子等固有的明亮度的平均值和滯留于共焦體積內(nèi)的分子的個(gè)數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息，推測(cè)分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)6、7中提出了:基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定出的試樣溶液的熒光信號(hào)的時(shí)程來(lái)檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。專(zhuān)利文獻(xiàn)8中提出了一種信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)，其用于:使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量在流式細(xì)胞儀內(nèi)流過(guò)的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘Ｋl(fā)出的微弱光，檢測(cè)液流中或基板上的熒光微粒的存在。
[0004]特別是，通過(guò)應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測(cè)定技術(shù)的方法，測(cè)定所必需的試樣的濃度比以前低得多且可以是微量(每次測(cè)定使用的量最多數(shù)十UL左右)，測(cè)定時(shí)間也大幅地縮短(每次測(cè)定中可重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的秒數(shù)量級(jí)時(shí)間的測(cè)定。)。因此，特別在對(duì)于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價(jià)的試樣進(jìn)行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待能夠成為低廉或迅速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)的強(qiáng)有力的工具。[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0007]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2005-098876號(hào)公報(bào)
[0008]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-292371號(hào)公報(bào)
[0009]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2009-281831號(hào)公報(bào)
[0010]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本專(zhuān)利第4023523號(hào)公報(bào)
[0011]專(zhuān)利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)第2008/080417號(hào)
[0012]專(zhuān)利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2007-20565號(hào)公報(bào)
[0013]專(zhuān)利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)2008-116440號(hào)公報(bào)
[0014]專(zhuān)利文獻(xiàn)8:日本特開(kāi)平4-337446號(hào)公報(bào)
[0015]非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0016]非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號(hào)、第1431?1438 頁(yè)。
[0017]非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler編、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁(yè)。
[0018]非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號(hào)、第271?277 頁(yè)。
[0019]非特許文獻(xiàn)4:P.Kask、其他3名(K.Palo, D.Ullmann, K.Gall)、美國(guó)《國(guó)家科學(xué)院院刊》(PNAS)、1999年、第96卷、第13756?13761頁(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0021]上述的FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)簡(jiǎn)而言之是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理算出所測(cè)量的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)的大小，根據(jù)該波動(dòng)的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度適合調(diào)制成:在平衡狀態(tài)下在秒數(shù)量級(jí)長(zhǎng)度的一次測(cè)量時(shí)間中有能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)；優(yōu)選調(diào)制成在微小區(qū)域內(nèi)經(jīng)常地存在有一個(gè)左右的熒光分子等(典型地，共焦體積的體積為IfL左右，所以熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。)。換言之，試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度大幅地低于能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的程度時(shí)(例如，大幅地低于InM時(shí))，產(chǎn)生測(cè)量時(shí)間內(nèi)只有稀少的觀測(cè)對(duì)象物進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，在熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果中長(zhǎng)期包括著觀測(cè)對(duì)象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)，并且顯著的熒光強(qiáng)度的觀測(cè)量變少，所以通過(guò)如上述的基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)的光分析技術(shù)難以獲得有意義的或精度良好的分析結(jié)果。
[0022]專(zhuān)利文獻(xiàn)6、7中所述的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測(cè)方法中公開(kāi)有:不進(jìn)行如上述的涉及熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)數(shù)秒的測(cè)量時(shí)間內(nèi)有無(wú)顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的產(chǎn)生，判斷試樣中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的有無(wú)，而得到顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專(zhuān)利文獻(xiàn)7中，提出了產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機(jī)流動(dòng)時(shí)，檢測(cè)靈敏度提高。然而，即便在這些方法，也只停留在檢測(cè)通過(guò)擴(kuò)散或隨機(jī)的流動(dòng)概率地進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子行為，并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)例如:粒子的計(jì)數(shù)、定量地算出粒子的濃度或數(shù)密度。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)8中記載的技術(shù)是逐個(gè)檢測(cè)流式細(xì)胞儀的液流中的熒光微粒或固定在基板上的熒光微粒的存在的技術(shù)，而不是用于檢測(cè)試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等的粒子，即不是用于對(duì)于在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，所以并沒(méi)有定量地算出在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)8的技術(shù)包含流式細(xì)胞儀中的測(cè)量或者熒光粒子向基板上的固定化處理的過(guò)程，因此可以認(rèn)為，檢測(cè)所需要的試樣量遠(yuǎn)大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技術(shù)的情況，并且對(duì)實(shí)施者要求復(fù)雜的高難度的操作技術(shù)。
[0023]另一方面，使用光分析技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)粒子的情況下，通常將目標(biāo)粒子用發(fā)光探針標(biāo)記，將與該目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出的光作為指標(biāo)間接地進(jìn)行檢測(cè)。該情況下，如果試樣溶液中存在不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針，則不僅檢測(cè)到由目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體的發(fā)出的光還檢測(cè)到由游離的發(fā)光探針的光；結(jié)果，存在目標(biāo)粒子的檢測(cè)精度降低的問(wèn)題。
[0024]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)方法，其不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)中進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，因此，對(duì)于觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述的光分析技術(shù)中處理水平的試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的狀態(tài)或特性也能夠檢測(cè)，根據(jù)該新型的光分析技術(shù)，抑制由游離的發(fā)光探針導(dǎo)致的影響并且高精度地檢測(cè)使用發(fā)光探針標(biāo)記后的目標(biāo)粒子。
[0025]用于解決問(wèn)題的方案
[0026]本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，在以由與該粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出的光作為指標(biāo)間接地進(jìn)行檢測(cè)的情況下，通過(guò)使用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行結(jié)合有發(fā)光探針的粒子的檢測(cè)，即便試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠靈敏度良好地檢測(cè)結(jié)合有發(fā)光探針的粒子。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，使被發(fā)光探針標(biāo)記的目標(biāo)粒子與分離回收用粒子結(jié)合之后通過(guò)固液分離處理進(jìn)行回收，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)所回收的分離回收用粒子，對(duì)由目標(biāo)粒子、發(fā)光探針和分離回收用粒子形成的復(fù)合體的分子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，由此能夠高精度地檢測(cè)目標(biāo)粒子，至此完成本發(fā)明。
[0027]此處，掃描分子計(jì)數(shù)法是日本特愿2010-044714中由本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:提出的新型光分析技術(shù)。
[0028]即，本發(fā)明提供以下的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法。
[0029](I) 一種目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其特征在于，其為檢測(cè)在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有:
[0030](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有前述發(fā)光探針的前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序；
[0031](b)在前述工序(a)之后，從前述溶液中通過(guò)固液分離處理回收前述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；和[0032](c)算出前述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序；
[0033]前述分離回收用粒子與由前述目標(biāo)粒子和前述發(fā)光探針形成的結(jié)合體結(jié)合，如下進(jìn)行前述工序(C)的前述復(fù)合體的分子數(shù)的計(jì)數(shù):
[0034]使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序；
[0035]—邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置,一邊檢測(cè)由該光檢測(cè)區(qū)域中的前述復(fù)合體發(fā)出的光的工序；
[0036]由前述檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)復(fù)合體的光信號(hào)而逐個(gè)檢測(cè)復(fù)合體的工序;
[0037]對(duì)前述逐個(gè)檢測(cè)到的復(fù)合體的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
[0038](2)根據(jù)前述⑴所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，前述分離回收用粒子在前述試樣溶液中的沉降速度為lX10_6m/s以下。
[0039](3)根據(jù)前述⑴或(2)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，在前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著第二路徑移動(dòng)，所述第二路徑的位置沿著第一路徑移動(dòng)。
[0040](4)根據(jù)前述(3)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，前述第一路徑以及第二路徑為循環(huán)路徑；沿著前述第二路徑的前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)周期短于沿著前述第一路徑的前述第二路徑的位置的移動(dòng)周期。
[0041](5)根據(jù)前述(3)或⑷所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)周期τ 1、前述第二路徑的位置的移動(dòng)速度ν2、和前述光檢測(cè)區(qū)域的直徑d滿足:
[0042]ν2.τ I > do
[0043](6)根據(jù)前述(3)?(5)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，通過(guò)改變前述光學(xué)系統(tǒng)的光路而使前述光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著前述第二路徑移動(dòng)；通過(guò)移動(dòng)前述試樣溶液的位置而使前述試樣溶液內(nèi)的前述第二路徑的位置沿著前述第一路徑移動(dòng)。
[0044](7)根據(jù)前述(3)?(6)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，前述第二路徑為圓形或橢圓形，前述第一路徑為圓形、橢圓形或直線。
[0045](8)根據(jù)前述(I)?(7)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，在前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比前述復(fù)合體的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)。
[0046](9)根據(jù)前述(I)?(8)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，在由前述檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)復(fù)合體的光信號(hào)而逐個(gè)檢測(cè)復(fù)合體的工序中，根據(jù)檢測(cè)到的按照時(shí)間順序的光信號(hào)的形狀，檢測(cè)到一個(gè)復(fù)合體進(jìn)入了前述光檢測(cè)區(qū)域。
[0047](10)根據(jù)前述(I)?(9)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，前述分離回收用粒子為磁性粒子。
[0048]發(fā)明的效果
[0049]本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中應(yīng)用的掃描分子計(jì)數(shù)法不進(jìn)行算出熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，通過(guò)本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，即便試樣中僅極微量地存在作為解析對(duì)象的目標(biāo)粒子時(shí)，也能夠檢測(cè)試樣中的該目標(biāo)粒子。進(jìn)而，本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法中，使用分離回收用粒子，從結(jié)合有目標(biāo)粒子的發(fā)光探針中分離去除不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針之后，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)。因此，由游離的發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測(cè)被有效地抑制，能夠高精度地檢測(cè)目標(biāo)粒子。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1A是用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0051]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0052]圖1C是改變鏡7的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0053]圖1D是移動(dòng)微孔板的水平方向位置而移動(dòng)試樣溶液的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0054]圖2A是說(shuō)明基于用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測(cè)原理的示意圖。
[0055]圖2B是用掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0056]圖2C是說(shuō)明通過(guò)改變本實(shí)施方式的光學(xué)系統(tǒng)的光路而實(shí)現(xiàn)的、光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著掃描軌跡(第二路徑)移動(dòng)的方式的圖。
[0057]圖2D是說(shuō)明試樣溶液的位置的移動(dòng)(第二路徑的位置沿著第一路徑移動(dòng))的方式的圖。
[0058]圖2E是說(shuō)明試樣溶液的位置的移動(dòng)、與光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著掃描軌跡移動(dòng)的關(guān)系的圖。
[0059]圖3A是觀測(cè)對(duì)象粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0060]圖3B是表示圖3A的示意圖中的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0061]圖4A是以快于觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置、從而觀測(cè)對(duì)象粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0062]圖4B是表示圖4A的示意圖中的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0063]圖5是以流程圖的形式顯示根據(jù)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理次序的圖。
[0064]圖6A為表示通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖的一例。
[0065]圖6B是說(shuō)明在根據(jù)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理工序的例子的圖。
[0066]圖7表示通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例(柱狀圖)、和將數(shù)據(jù)平滑化后獲得的曲線(虛線)、和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。圖中，帶有“噪音”的信號(hào)作為由噪音或雜質(zhì)帶來(lái)的信號(hào)被無(wú)視。
[0067]圖8是表示實(shí)施例1中，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為240秒鐘通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)使用磁體進(jìn)行了純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
[0068]圖9是表示實(shí)施例1中，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為2秒鐘通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)沒(méi)有使用磁體進(jìn)行純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
[0069]圖10是表示實(shí)施例2中，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為240秒鐘通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)使用磁體進(jìn)行了純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
[0070]圖11是表示實(shí)施例2中，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為2秒鐘通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)沒(méi)有使用磁體進(jìn)行純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0071]以下，對(duì)于本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法的一實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
[0072]首先，對(duì)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說(shuō)明。掃描分子計(jì)數(shù)法為如下技術(shù):一邊通過(guò)微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)出光的粒子(以下，稱為“發(fā)光粒子”。))橫穿微小區(qū)域內(nèi)時(shí)，檢測(cè)由微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，一個(gè)一個(gè)逐個(gè)檢測(cè)試樣溶液中的發(fā)光粒子，能夠獲得發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的相關(guān)信息。掃描分子計(jì)數(shù)法與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，檢測(cè)所需的試樣可以是微量(例如，數(shù)十UL左右)，另外，測(cè)定時(shí)間短；并且與FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，對(duì)于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，可以定量檢測(cè)其濃度或數(shù)密度等特性。
[0073]需要說(shuō)明的是，發(fā)光粒子是指通過(guò)熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的定量方法中，目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而成的物質(zhì)為發(fā)光粒子。
[0074]本實(shí)施方式和本說(shuō)明書(shū)中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測(cè)到光的微小區(qū)域，當(dāng)由物鏡照射照明光時(shí)，相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。在共聚焦顯微鏡中，所述區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔之間的位置關(guān)系確定。發(fā)光粒子沒(méi)有照明光而發(fā)光的情況下，例如，為通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光而發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中，言及發(fā)光粒子的“信號(hào)”時(shí)，只要沒(méi)有特別的限定，是指表示由發(fā)光粒子發(fā)出的光的信號(hào)。
[0075]邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置、即通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測(cè)。這樣一來(lái)，移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含與隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時(shí)，檢測(cè)到由發(fā)光探針發(fā)出的光，由此檢測(cè)到一個(gè)粒子的存在(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，也包括如下情況:發(fā)光探針暫時(shí)與要檢測(cè)的粒子(目標(biāo)粒子)結(jié)合之后，在檢測(cè)光時(shí)從粒子解離。)。接著，在逐次檢測(cè)到的光中逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自發(fā)光探針的光信號(hào)，由此，一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)逐次地檢測(cè)到(結(jié)合有發(fā)光探針的)粒子的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在上述構(gòu)成中，可以計(jì)數(shù)逐個(gè)檢測(cè)到的粒子，從而計(jì)數(shù)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)中檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)所述構(gòu)成，通過(guò)組合粒子的個(gè)數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是，通過(guò)任意手法例如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，并不是直接確定絕對(duì)數(shù)密度值或濃度值，也可以算出相對(duì)于多個(gè)試樣溶液、或者相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比。
[0076]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的構(gòu)成。根據(jù)該構(gòu)成，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)是迅速的，并且在試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用。因此，作為檢測(cè)對(duì)象的粒子能夠不受力學(xué)的作用的影響，在穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測(cè)量(試樣溶液中，振動(dòng)或流動(dòng)起作用時(shí)，粒子的物理性質(zhì)存在變化的可能性。)。并且，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，由于使試樣溶液流動(dòng)的構(gòu)成不是必需的，因此能夠用與FCS、FIDA等情況下同樣微量(I?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進(jìn)行測(cè)量和分析。[0077]在上述的逐個(gè)地檢測(cè)粒子的工序中，由逐次檢測(cè)到的光信號(hào)判斷與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針(包括:一個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；多個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)方式的、與一個(gè)粒子結(jié)合之后從粒子解離的發(fā)光探針的情況。以下同樣)是否進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域，可以根據(jù)按照時(shí)間順序檢測(cè)到的光信號(hào)的形狀而進(jìn)行。本實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測(cè)到具有比規(guī)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，能夠檢測(cè)到與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。更具體而言，通常，表示由發(fā)光粒子發(fā)出的光的信號(hào)在光檢測(cè)部的按照時(shí)間順序的檢測(cè)值即光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為具有某種程度以上的強(qiáng)度的鐘形的脈沖狀信號(hào)形式。噪音或者并非鐘形的脈沖狀或者表現(xiàn)為強(qiáng)度小的信號(hào)的形式。因此，也可以在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，檢測(cè)具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的脈沖狀信號(hào)，將其作為表示由單一的發(fā)光粒子發(fā)出的光的信號(hào)?！耙?guī)定閾值”能夠通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)定為適當(dāng)?shù)闹怠?br> [0078]此外，在上述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變?cè)嚇尤芤簝?nèi)部的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，由與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針?biāo)鶛z測(cè)到的光的形態(tài)，可能會(huì)根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，如果光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度過(guò)快，則由與I個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針得到的光量減少，為了精度良好且靈敏度良好地檢測(cè)到由與I個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針發(fā)出的光，優(yōu)選適宜改變光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0079]進(jìn)一步，在上述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，適當(dāng)?shù)氖菍⒃嚇尤芤簝?nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與作為檢測(cè)對(duì)象的粒子結(jié)合后的發(fā)光探針(即，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的定量方法中，與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針)的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)造成的粒子的平均移動(dòng)速度)。如上述說(shuō)明，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)存在有與一個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的位置時(shí)，檢測(cè)由該發(fā)光探針發(fā)出的光而逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)移動(dòng)，在光檢測(cè)區(qū)域中出入多次時(shí)，多次檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)發(fā)光探針的(表示希望檢測(cè)的粒子存在的)光信號(hào)，難以將檢測(cè)到的光信號(hào)與一個(gè)希望檢測(cè)的粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上所述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度(具體而言，設(shè)定為以比與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng))；由此，能夠使與一個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針對(duì)應(yīng)于一個(gè)(表示粒子的存在的)光信號(hào)。需要說(shuō)明的是，擴(kuò)散移動(dòng)速度隨著與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針而改變，所以如上述，優(yōu)選根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))，適當(dāng)改變光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0080]可以以任意方式，進(jìn)行用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0081]例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡改變光路，使光檢測(cè)區(qū)域的位置發(fā)生變化。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定，也可以選自例如圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0082]掃描分子計(jì)數(shù)法中，其光檢測(cè)機(jī)理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對(duì)來(lái)自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的構(gòu)成，所以試樣溶液的量同樣地可以是微量的。然而，掃描分子計(jì)數(shù)法中，不進(jìn)行算出熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所以掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)能夠適用于粒子的數(shù)密度或濃度大幅地低于FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平的試樣溶液。
[0083]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，由于能夠逐個(gè)檢測(cè)溶液中分散或溶解的每個(gè)粒子，所以可以使用該信息定量地進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，使通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)一一對(duì)應(yīng)，一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)出粒子，所以能夠進(jìn)行溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的計(jì)數(shù)，與以前相比較，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。實(shí)際上，根據(jù)逐個(gè)檢測(cè)與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針并計(jì)數(shù)其數(shù)目、確定粒子濃度的本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的定量方法，即使試樣溶液中的與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的濃度是比通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠定量地檢測(cè)目標(biāo)粒子。
[0084]進(jìn)一步，根據(jù)改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、利用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液中的方式，不對(duì)試樣溶液產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)作用，使試樣溶液內(nèi)部在均勻的狀態(tài)或試樣溶液機(jī)械上穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行觀察。因此，與例如使試樣產(chǎn)生流動(dòng)的情況(賦予流動(dòng)的情況下難以恒常地賦予同樣的流速，并且裝置構(gòu)成變得復(fù)雜，還有需要的試樣量大幅地增大，并且由于流動(dòng)導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用，溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)存在變質(zhì)或變性的可能性。)相比較，定量的檢測(cè)結(jié)果的可靠性提高；另外，對(duì)于試樣溶液中的成為檢測(cè)對(duì)象的粒子，能夠在沒(méi)有力學(xué)作用的影響下或沒(méi)有人為影響的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。
[0085]<用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0086]可以通過(guò)在基本的構(gòu)成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器而構(gòu)成的光分析裝置實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法。參照同一圖，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣，此處，自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光，通過(guò)準(zhǔn)直儀4成為平行光，在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9 ;自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的粒子、與所述粒子結(jié)合的發(fā)光探針、帶有發(fā)光標(biāo)記(典型地為熒光色素等)的分子，與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，與粒子暫時(shí)結(jié)合后與粒子解離的發(fā)光探針)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針就在其間被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)通過(guò)物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光，通過(guò)小孔13，透過(guò)二次濾片14 (此處，只選擇特定的波長(zhǎng)范圍的光成分。)被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測(cè)器16，轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號(hào)之后，輸入至計(jì)算機(jī)18，按照后面說(shuō)明的方式實(shí)施用于光分析的處理。需要說(shuō)明的是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上，由此，僅自圖1B中示意地所示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)小孔13，而來(lái)自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有I?IOfL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛倫茲型分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為l/e2的面為界面的幾乎橢球體的體積。)，被稱為共焦體積。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測(cè)來(lái)自一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來(lái)自發(fā)光探針的光，例如，來(lái)自一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光色素分子的微弱光，所以光檢測(cè)器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測(cè)器。此外，為了改變欲進(jìn)行觀察的孔10，在顯微鏡的平臺(tái)(沒(méi)有圖示)上可以設(shè)有用于移動(dòng)微孔板9的水平方向位置的平臺(tái)位置變化裝置17a?？梢酝ㄟ^(guò)計(jì)算機(jī)18控制平臺(tái)位置變化裝置17a的動(dòng)作。通過(guò)所述的構(gòu)成，即使被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測(cè)量。
[0087]進(jìn)一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部、即用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域(即，光檢測(cè)區(qū)域)的位置的機(jī)構(gòu)。所述用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。所述的鏡轉(zhuǎn)向器17也可以與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置相同(移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的方式)。另外，進(jìn)一步，如圖1B所例示，為了移動(dòng)注入有試樣溶液的容器10(微孔板9)的水平方向的位置而移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的相對(duì)的位置，也可以操作平臺(tái)位置變化裝置17a(移動(dòng)試樣溶液的位置的方式)。通過(guò)上述的改變光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)的位置的方式，使光檢測(cè)區(qū)域沿著掃描軌跡(第二路徑)而繞轉(zhuǎn)移動(dòng)，同時(shí)地，通過(guò)移動(dòng)試樣溶液的位置的方式，使試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡的位置沿著規(guī)定的移動(dòng)路徑(第一路徑)移動(dòng)。利用任意方式的情況下，鏡轉(zhuǎn)向器17在計(jì)算機(jī)18的控制下與光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)而被驅(qū)動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)模式。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計(jì)算機(jī)18的程序中的各種移動(dòng)模式中選擇。)。需要說(shuō)明的是，圖中沒(méi)有顯示但也可以通過(guò)上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測(cè)區(qū)域的位置沿上下方向移動(dòng)。如上所述，根據(jù)不移動(dòng)試樣溶液而改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的構(gòu)成，試樣溶液內(nèi)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)的作用，能夠排除力學(xué)作用對(duì)觀測(cè)對(duì)象物的影響，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的測(cè)量。
[0088]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)吸收多光子而發(fā)光時(shí)，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)中發(fā)出光，所以可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴激發(fā)光發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在光分析裝置I中，如圖所示，可以為如下構(gòu)成:可以設(shè)置有多個(gè)激發(fā)光源2，根據(jù)用于將粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針激發(fā)的光的波長(zhǎng)，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以在檢測(cè)光的光路上插入分色鏡14a，將檢測(cè)光分割成多個(gè)波長(zhǎng)頻帶，分別地通過(guò)多個(gè)光檢測(cè)器16進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)所述的構(gòu)成，在涉及發(fā)光粒子的發(fā)光波長(zhǎng)特性(發(fā)光光譜)的信息的檢測(cè)以及包含多種發(fā)光粒子的情況下，能夠根據(jù)它們的波長(zhǎng)分別地檢測(cè)由它們發(fā)出的光。進(jìn)而還有，關(guān)于光的檢測(cè)，還可以使用在規(guī)定的方向上偏振的光作為激發(fā)光，將檢測(cè)光的、與激發(fā)光的偏振方向垂直的方向的成分分別地進(jìn)行檢測(cè)而能夠檢測(cè)發(fā)光粒子的光的偏振特性。該情況下，在激發(fā)光的光路上插入偏振片(沒(méi)有圖示)，在檢測(cè)光的光路上插入偏振光分束器14a。
[0089]<掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0090]FIDA等分光分析技術(shù)與以前的生物化學(xué)分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是必需的試樣量非常少，并且可以快速實(shí)施檢查。然而，在FIDA等分光分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強(qiáng)度波動(dòng)計(jì)算觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或特性。因此，為了獲得精度良好的檢測(cè)結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強(qiáng)度測(cè)量中，在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子，在測(cè)量時(shí)間內(nèi)總是檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述時(shí)，例如，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子只是偶爾進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，僅在一部分測(cè)量時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))，因而難以以良好的精度計(jì)算光強(qiáng)度的波動(dòng)。此外，在觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度大幅地低于測(cè)量中通常在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的運(yùn)算易受背景的影響，為了獲得對(duì)運(yùn)算而言為充分量的顯著的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，測(cè)量時(shí)間延長(zhǎng)。與此相對(duì)，即使當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度低于FIDA等分光分析技術(shù)要求的水平時(shí)，本實(shí)施方式的掃描分子計(jì)數(shù)法也能夠檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0091]掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)中，作為進(jìn)行的處理，直接了當(dāng)?shù)卣f(shuō)，驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路,如圖2A?2E中不意地描述,一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV的位置即利用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實(shí)施光檢測(cè)。
[0092]如此一來(lái)，例如，如圖2A所示，在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)期間(圖2A中，時(shí)間t0?t2)，當(dāng)通過(guò)存在有I個(gè)粒子(圖中，發(fā)光探針結(jié)合有熒光色素)的區(qū)域時(shí)(tl)，檢測(cè)到如圖2B所述的顯著的光強(qiáng)度(Em)。如此，實(shí)施上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，通過(guò)一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)在此期間出現(xiàn)的圖2B所例示的顯著的光強(qiáng)度而逐個(gè)檢測(cè)出結(jié)合有發(fā)光探針的粒子。通過(guò)將其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠得到與存在于所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個(gè)數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。所述掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，粒子一個(gè)一個(gè)地被檢測(cè)出且不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的算出這類(lèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算處理，所以可以認(rèn)為即便是欲觀測(cè)粒子濃度低至無(wú)法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液中，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0093]另外，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法這類(lèi)逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)試樣溶液中的粒子的方法，與由通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)相比，能夠測(cè)定至更低的濃度。當(dāng)通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)某被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)，通常假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度充分地降低時(shí)，噪音信號(hào)的量相對(duì)于由被熒光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號(hào)量變大(S/N比惡化)，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號(hào)量之間的比例關(guān)系瓦解，確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由被檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，從檢測(cè)結(jié)果中排除了噪音信號(hào)，只將對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)而算出濃度，所以與通過(guò)假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度時(shí)相比較，能夠檢測(cè)至更低的濃度。
[0094]進(jìn)而還有，當(dāng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針時(shí)，與傳統(tǒng)的假定熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而確定濃度的方法相比，掃描分子計(jì)數(shù)法這類(lèi)對(duì)試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)的方法的情況下，粒子濃度高一側(cè)的粒子濃度的測(cè)量精度提高。在一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針的情況下，向試樣溶液添加某一量的發(fā)光探針時(shí)，觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度升高時(shí)，相對(duì)而言與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的個(gè)數(shù)降低。在此情況下，由于每一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的熒光強(qiáng)度降低，因此，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解，所確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由檢測(cè)到的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，每個(gè)粒子的熒光強(qiáng)度降低的影響變少，由粒子數(shù)算出濃度，所以，與假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度時(shí)相比較，能夠檢測(cè)至更高的濃度。
[0095]<通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定>
[0096]就掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測(cè)定而言，除了在檢測(cè)中驅(qū)動(dòng)鏡轉(zhuǎn)向器17，在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度檢測(cè)工序相同的方式實(shí)施光強(qiáng)度檢測(cè)。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺(tái)上后，使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)定開(kāi)始的指示，計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲(chǔ)裝置(沒(méi)有圖示)存儲(chǔ)的程序(將用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光路進(jìn)行改變的次序、和在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的次序)，開(kāi)始試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測(cè)量。所述測(cè)量中，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動(dòng)鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，與此同時(shí)，光檢測(cè)器16將逐次檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，傳送給計(jì)算機(jī)18，計(jì)算機(jī)18以任意方式由送達(dá)的光信號(hào)生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。需要說(shuō)明的是，典型地光檢測(cè)器16為能夠檢測(cè)到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測(cè)器，所以，光的檢測(cè)是以如下方式進(jìn)行的光子計(jì)數(shù):在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時(shí)間(BINTIME)如每10 μ秒逐次地測(cè)量到達(dá)光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0097]光強(qiáng)度測(cè)量中的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度可以是任意的，可以設(shè)定為適合例如實(shí)驗(yàn)或分析目的的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的大小或體積是必需的，所以以移動(dòng)距離受掌握的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)。需要說(shuō)明的是，測(cè)量中的經(jīng)過(guò)時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測(cè)定結(jié)果，所以移動(dòng)速度基本上優(yōu)選為恒定速度，但并非僅限于此。
[0098]此外，對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的速度，為了由測(cè)量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子，或以良好的精度定量實(shí)施觀測(cè)對(duì)象粒子數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將所述的移動(dòng)速度設(shè)定為比觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密地，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針、本實(shí)施方式中，為結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)即布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)速度更快的值。掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測(cè)對(duì)象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置伴隨著時(shí)間而移動(dòng)。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)慢時(shí)，如圖3Α示意地描述，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)，由此，光強(qiáng)度如圖3Β所示隨機(jī)地變化(如已知，光檢測(cè)區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。)，難以確定對(duì)應(yīng)于各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的顯著的光強(qiáng)度的變化。于是，如圖4Α所示，優(yōu)選粒子幾乎直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域，由此，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4Β例示，對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的光強(qiáng)度變化的分布圖大致一致(粒子幾乎直線地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的曲線與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同。)，將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的平均的移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)，以容易確定每個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子與光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
[0099]具體而言，由于布朗運(yùn)動(dòng)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密的是，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體，或與粒子結(jié)合后再分解、游離的發(fā)光探針)通過(guò)半徑Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共焦體積)時(shí)所需的時(shí)間At是由均方位移的關(guān)系式
[0100](2Wo)2 = 6D.At...(I)
[0101]推斷出
[0102]At = (2ffo)2/6D— (2)
[0103]所以觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大約是
[0104]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(3)
[0105]此處，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參考前述Vdif而設(shè)定為比之更快的值。例如，假定觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0X 10_1(lm2/S左右的情況下，Wo為0.62 μ m左右，則Vdif為1.0X10_3m/s，所以光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其大約10倍的15mm/s即可。此外，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，為了找到使在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度的各種設(shè)定下的光強(qiáng)度變化曲線成為預(yù)期曲線(典型的是與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0106]為了實(shí)現(xiàn)發(fā)光粒子以外的其他物質(zhì)的穩(wěn)定性，試樣溶液內(nèi)的流動(dòng)或振動(dòng)等干擾應(yīng)該最小。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)原則上優(yōu)選通過(guò)改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路而進(jìn)行。這是因?yàn)?，如上述說(shuō)明，通過(guò)利用鏡轉(zhuǎn)向器17的光路的改變，能夠比較容易地高速地進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。
[0107]關(guān)于這一 點(diǎn)，在物鏡的視野的周邊，通常像差變大，光檢測(cè)區(qū)域的尺寸、形狀存在根據(jù)位置而不同的可能性；所以利用改變光路進(jìn)行的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)的范圍優(yōu)選在物鏡的像差少的視野的中心附近的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。
[0108]另一方面，如果光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)范圍限于物鏡的視野的中心附近的區(qū)域內(nèi)，則光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域即掃描區(qū)域變小，能夠檢測(cè)到的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)也變少。另外，重復(fù)地通過(guò)小的區(qū)域的情況下，特別是對(duì)于擴(kuò)散慢的粒子，光檢測(cè)區(qū)域重復(fù)地通過(guò)其存在區(qū)域而多次檢測(cè)到同一粒子。當(dāng)然，通過(guò)有意地重復(fù)檢測(cè)由同一粒子發(fā)出的光而精度良好地估計(jì)其光的特性也是有用的；但發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)、濃度或數(shù)密度的檢測(cè)等想要盡可能增多發(fā)光粒子的檢測(cè)數(shù)時(shí)，優(yōu)選不多次檢測(cè)同一粒子而掃描更廣范圍的區(qū)域或更長(zhǎng)的距離。另外，此時(shí)，想要得到關(guān)于發(fā)光粒子的濃度的信息時(shí)，優(yōu)選容易估計(jì)掃描區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域的通過(guò)區(qū)域)的長(zhǎng)度或體積且光檢測(cè)區(qū)域的尺寸、形狀幾乎沒(méi)有變化。
[0109]如下進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域位置的移動(dòng):使光檢測(cè)區(qū)域的位置在規(guī)定的掃描軌跡上移動(dòng)并且使該掃描軌跡移動(dòng)，以使光檢測(cè)區(qū)域的位置在短時(shí)間內(nèi)盡可能不通過(guò)(排除路徑的交差點(diǎn))同一區(qū)域，由此能夠穩(wěn)定地掃描更廣范圍的區(qū)域或者更長(zhǎng)的距離。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)路徑任選三維的或者二維的。
[0110]即，光檢測(cè)區(qū)域的位置在試樣溶液內(nèi)沿著第二路徑移動(dòng)；所述第二路徑的位置沿著第一路徑移動(dòng)。通過(guò)所述構(gòu)成，由于光檢測(cè)區(qū)域的位置所沿著移動(dòng)的第二路徑的位置被移動(dòng)，至少至第二路徑沿著第一路徑的位置移動(dòng)結(jié)束為止，試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)路徑不通過(guò)(排除路徑瞬間地交差的情況)同一區(qū)域，檢測(cè)到同一發(fā)光粒子二次以上的可能性大幅地被降低。另外，由于光檢測(cè)區(qū)域的位置在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，所以光檢測(cè)區(qū)域的位置的形狀、尺寸的變化被抑制為最低限度。
[0111]為了盡可能地將光檢測(cè)區(qū)域的形狀、尺寸的變化抑制為最低限度，光檢測(cè)區(qū)域的位置應(yīng)該在物鏡的視野內(nèi)被限制在像差小的范圍內(nèi)。另一方面，可以認(rèn)為觀測(cè)對(duì)象物為隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子，所以經(jīng)過(guò)了充分的時(shí)間、即曾經(jīng)檢測(cè)到的發(fā)光粒子擴(kuò)散并移動(dòng)到別的地點(diǎn)后，則光檢測(cè)區(qū)域的位置也可以通過(guò)同一位置。因此，作為光檢測(cè)區(qū)域的位置的軌跡的第二路徑、與作為第二路徑的位置的軌跡的第一路徑可以分別為循環(huán)路徑。例如，第二路徑具體而言，任選圓形或橢圓形。另一方面，第一路徑的形狀任選圓形、橢圓形或直線。該情況下，以試樣溶液為基準(zhǔn)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的軌跡容易地把握，由于容易確認(rèn)光檢測(cè)區(qū)域的位置在短時(shí)間內(nèi)不連續(xù)地通過(guò)同一區(qū)域，可以將沿著第二路徑的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)周期設(shè)定為短于第二路徑的位置沿著第一路徑移動(dòng)的移動(dòng)周期。
[0112]具體而言，首先，驅(qū)動(dòng)圖1A的鏡轉(zhuǎn)向器17而改變光路，在物鏡的視野內(nèi)，如圖2C，使光檢測(cè)區(qū)域沿著掃描軌跡(第二路徑)而繞轉(zhuǎn)移動(dòng)。并且，與該運(yùn)動(dòng)同時(shí)地，如圖2D，連續(xù)地驅(qū)動(dòng)平臺(tái)位置變化裝置17a而移動(dòng)試樣溶液的位置，由此，以試樣溶液為基準(zhǔn)而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡的位置，盡量避免光檢測(cè)區(qū)域在短時(shí)間內(nèi)掃描同一區(qū)域。[如圖2D，如果將試樣溶液的位置的移動(dòng)設(shè)為循環(huán)路徑，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡的位置完成該循環(huán)路徑一圈時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域再次掃描相同的區(qū)域，而在光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡的位置完成一圈時(shí)，通?？梢约俣òl(fā)光粒子通過(guò)擴(kuò)散移動(dòng)到其他的位置，所以可以認(rèn)為再次檢測(cè)到同一發(fā)光粒子的可能性極低。]
[0113]需要說(shuō)明的是，雖然優(yōu)選以試樣溶液為基準(zhǔn)的光檢測(cè)區(qū)域的速度大致一定以使發(fā)光粒子的光的信號(hào)的脈沖狀形狀總是一定；但如果試樣溶液的位置的移動(dòng)速度高至與光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡上的移動(dòng)速度相匹敵的程度，則以試樣溶液為基準(zhǔn)的光檢測(cè)區(qū)域的速度變化。因此，合適的是，試樣溶液的位置的移動(dòng)速度優(yōu)選與光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡上的移動(dòng)速度相比較充分地低(例如，20%以下)。另外，如圖2E所示，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域完成掃描軌跡一圈時(shí)，為了避免前次(i)的繞轉(zhuǎn)時(shí)通過(guò)的區(qū)域與此次(ii)繞轉(zhuǎn)時(shí)通過(guò)的區(qū)域重復(fù)，設(shè)定試樣溶液的位置的移動(dòng)速度(掃描軌跡的位置的移動(dòng)速度)v2和光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌跡上的移動(dòng)周期τI與光檢測(cè)區(qū)域的直徑d之間滿足:
[0114]ν2.τ I > d...(4)
[0115]的關(guān)系。由此，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著第二路徑一周時(shí)，第二路徑至少移動(dòng)相當(dāng)于光檢測(cè)區(qū)域的直徑的距離，所以在光檢測(cè)區(qū)域的位置連續(xù)繞轉(zhuǎn)中能夠避免光檢測(cè)區(qū)域與前次繞轉(zhuǎn)中通過(guò)的區(qū)域重復(fù)。具體而言，光檢測(cè)區(qū)域的直徑d為0.4?30 μ m，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域在掃描軌跡上的移動(dòng)周期τ I為0.6?600m秒時(shí)，試樣溶液的位置的移動(dòng)速度v2為0.67 μ m以上。實(shí)際上，通常光檢測(cè)區(qū)域在掃描軌跡上的移動(dòng)周期τ I被設(shè)定為6?60m秒，所以該情況下，試樣溶液的位置的移動(dòng)速度v2為17μπι以上。光檢測(cè)區(qū)域在掃描軌跡上的移動(dòng)速度典型地被設(shè)定為10?90mm/秒，所以試樣溶液的位置的移動(dòng)速度v2小至幾乎可以無(wú)視。
[0116]共聚焦光學(xué)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中的試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，具體而言，能夠通過(guò)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路的改變、或包含試樣溶液的容器的移動(dòng)的任一者而進(jìn)行。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著第二路徑的移動(dòng)通過(guò)改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路而進(jìn)行，第二路徑的位置沿著第一路徑的移動(dòng)可以通過(guò)移動(dòng)試樣溶液的位置而進(jìn)行。換言之，根據(jù)該方式，通過(guò)組合利用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路的光檢測(cè)區(qū)域的繞轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)和試樣溶液的繞轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，能夠更廣或更長(zhǎng)距離地掃描試樣溶液內(nèi)。此處，利用改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路實(shí)現(xiàn)的、試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著第二路徑的移動(dòng)任選以任意的方式進(jìn)行。例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡等改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路，使光檢測(cè)區(qū)域的位置發(fā)生變化。根據(jù)改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路而改變光檢測(cè)區(qū)域的位置的方式，因?yàn)楣鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)是快速的并且試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)作用，所以能夠在作為檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子不受力學(xué)作用的影響而穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的檢測(cè)，這一點(diǎn)是有利的。第二路徑具體而言，任選圓形或橢圓形。另一方面，第一路徑的形狀任選圓形、橢圓形或直線。需要說(shuō)明的是，試樣溶液的移動(dòng)可以優(yōu)選為如前所述的移動(dòng)顯微鏡的平臺(tái)等，從而連同試樣溶液的容器一起移動(dòng)。該情況下，溶液內(nèi)不產(chǎn)生流動(dòng)，所以可以認(rèn)為試樣溶液對(duì)發(fā)光粒子的影響被降低。
[0117]<通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的光強(qiáng)度的分析>
[0118]經(jīng)上述處理獲得試樣溶液的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可以在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序進(jìn)行處理(由檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的次序)，由此實(shí)施如下所述的光強(qiáng)度的分析。
[0119](i) 一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)
[0120]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4A所示幾乎直線狀時(shí)，與該粒子相對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度變化如圖6A示意性地描述，具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)確定的)光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布的曲線(通常幾乎呈鐘形)。因此，觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的手法之一中，對(duì)于光強(qiáng)度設(shè)定閾值Ιο，超過(guò)該閾值的光強(qiáng)度持續(xù)時(shí)間寬度△ τ在規(guī)定的范圍時(shí)，判定為該光強(qiáng)度的分布圖與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)，檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子。光強(qiáng)度的閾值1以及時(shí)間寬度△ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后再分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強(qiáng)度而預(yù)想的曲線確定的；所述觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域以規(guī)定的速度相對(duì)地移動(dòng)。具體的值可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)任意地設(shè)定，也可以根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇確定。
[0121]此外，作為觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的其他方法，光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布:
[0122]I=A* exp (_2t2/a2)…(5)
[0123]此時(shí)，對(duì)顯著的光強(qiáng)度曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)擬合式(5)算出的強(qiáng)度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，該光強(qiáng)度曲線可判斷為對(duì)應(yīng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)了光檢測(cè)區(qū)域，可以視為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子。(當(dāng)強(qiáng)度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外時(shí)，可以在分析中作為噪音或異物而無(wú)視。)
[0124](ii)觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)
[0125]觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)可以如下進(jìn)行:通過(guò)任意方法計(jì)數(shù)通過(guò)上述觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)方法檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)。然而，當(dāng)粒子的個(gè)數(shù)較大時(shí)，也可以通過(guò)例如圖5和圖6B所示例的處理來(lái)進(jìn)行。
[0126]參照?qǐng)D5和圖6B，在根據(jù)按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)粒子數(shù)的方法的一個(gè)例子中，在通過(guò)上述說(shuō)明的光強(qiáng)度測(cè)定、即用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)，對(duì)所述按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(圖6B最上部分“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)，進(jìn)行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，在微小的時(shí)間內(nèi)存在數(shù)據(jù)值產(chǎn)生欠缺，所以通過(guò)所述平滑化處理，可以無(wú)視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過(guò)移動(dòng)平均法而進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)獲得光信號(hào)數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)、BIN--ΜΕ，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)，例如，在移動(dòng)平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)或移動(dòng)平均的次數(shù)等。
[0127]然后，為了檢測(cè)在平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中存在顯著信號(hào)的時(shí)間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，對(duì)平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行一階微分值運(yùn)算(步驟120)。按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值，如圖6B中下部分的“時(shí)間微分”所示信號(hào)值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大，所以通過(guò)參考所述時(shí)間微分值可以有利地確定顯著的信號(hào)(峰信號(hào))的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0128]之后，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中，逐次檢測(cè)顯著的信號(hào)(峰信號(hào))，判斷檢測(cè)到的峰信號(hào)是否是與觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。
[0129]具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索一個(gè)峰信號(hào)的始點(diǎn)和終點(diǎn)進(jìn)行確定，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。一旦確定了一個(gè)峰存在區(qū)域，就對(duì)該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行鐘形函數(shù)擬合(圖6B下部分的“鐘形函數(shù)擬合”)，算出鐘形函數(shù)的峰強(qiáng)度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum))W、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。需要說(shuō)明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。由此， 判斷算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)檢測(cè)到的光信號(hào)所描述的鐘形曲線參數(shù)的規(guī)定范圍內(nèi)，即，峰強(qiáng)度、峰寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣，如圖7左側(cè)所示，算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個(gè)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對(duì)應(yīng)的光信號(hào)規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，則該信號(hào)判定為與一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)，由此，判斷為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，計(jì)數(shù)為一個(gè)粒子(粒子數(shù)的計(jì)數(shù)增加。步驟160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)沒(méi)有在規(guī)定范圍內(nèi)的峰信號(hào)作為噪音而無(wú)視。
[0130]上述的步驟130~160的處理中的峰信號(hào)的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進(jìn)行，每檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子則作為粒子而計(jì)數(shù)。因此，在結(jié)束對(duì)按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)全部區(qū)域的峰信號(hào)搜索后(步驟170)，將所獲得的粒子計(jì)數(shù)值作為在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)。
[0131](iii)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0132]進(jìn)行了觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)后，使用在獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的過(guò)程中光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，確定觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測(cè)區(qū)域的實(shí)際體積依賴于激發(fā)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、透鏡的開(kāi)口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變，所以由設(shè)計(jì)值計(jì)算通常是困難的，因此，計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積也不簡(jiǎn)單。在本文中，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測(cè)定相同的條件下，對(duì)已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進(jìn)行上文說(shuō)明的光強(qiáng)度測(cè)定、粒子的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，根據(jù)檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，即確定觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)數(shù)和濃度之間的關(guān)系。[0133]作為參照溶液的粒子，可以優(yōu)選為與觀測(cè)對(duì)象粒子所形成的粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合后再游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對(duì)于粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測(cè)數(shù)為N時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)
[0134]Vt = N/C...(6)
[0135]而獲得。另外，準(zhǔn)備多個(gè)不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對(duì)其實(shí)施測(cè)定，將算出的Vt的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積Vt而采用即可。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度C就根據(jù)
[0136]c = n/Vt …(7)
[0137]而獲得。需要說(shuō)明的是，可以不通過(guò)上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測(cè)區(qū)域的體積、光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積即可。此外，本實(shí)施方式的光分析裝置也可以如下構(gòu)成，對(duì)于規(guī)定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(6))的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，裝置的使用者在實(shí)施光分析時(shí)可以適當(dāng)利用存儲(chǔ)的關(guān)系信息。
[0138]<目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法>
[0139]本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法的特征在于，其為檢測(cè)在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子的方法，使用分離回收用粒子，從與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針中將不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針?lè)蛛x去除，之后通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。掃描分子計(jì)數(shù)法為能夠在分子離散的狀況下逐個(gè)粒子地測(cè)定發(fā)光粒子的測(cè)定方法，所以對(duì)于PM級(jí)以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進(jìn)行測(cè)定。因此，通過(guò)本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對(duì)象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠高靈敏度地計(jì)數(shù)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。進(jìn)而，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法在使被發(fā)光探針標(biāo)記的目標(biāo)粒子與分離回收用粒子結(jié)合之后，通過(guò)固液分離處理回收分離回收用粒子，對(duì)于該被回收的分離回收用粒子利用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)。被發(fā)光探針標(biāo)記的目標(biāo)粒子與分離回收用粒子結(jié)合，所以通過(guò)固液分離處理與分離回收用粒子一起被回收，而不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針從分離回收用粒子中分離而被去除。即，因?yàn)樵谌コ擞坞x的發(fā)光探針之后利用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，所以由游離的發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測(cè)被有效地抑制，能夠高精度地檢測(cè)目標(biāo)粒子。
[0140]具體而言，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法具有下述工序(a)~(C)。
[0141](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有前述發(fā)光探針的前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序；
[0142](b)在前述工序(a)之后，從前述溶液中通過(guò)固液分離處理回收前述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；
[0143](C)算出前述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序。
[0144]以下，對(duì)于每個(gè)工序進(jìn)行說(shuō)明。 [0145]首先，作為工序(a)，調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含與前述發(fā)光探針結(jié)合的前述目標(biāo)粒子和前述分離回收用粒子的溶液；在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體。
[0146]本實(shí)施方式和本說(shuō)明書(shū)中，“在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子”是指在溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的或不發(fā)光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子。
[0147]目標(biāo)粒子為在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的、以檢測(cè)為目的的粒子。作為目標(biāo)粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類(lèi)似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對(duì)象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增的核酸。核酸類(lèi)似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類(lèi)天然類(lèi)型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置換的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA，HexitolNucleic Acid)、妝核酸(PNA)等。
[0148]另外，本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針為與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)，只要是在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下發(fā)出光的物質(zhì)，就沒(méi)有特別的限定。另外，發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的結(jié)合任選可逆的結(jié)合、或者共價(jià)鍵等不可逆的結(jié)合。例如，發(fā)光探針任選為發(fā)光物質(zhì)自身，或者為使發(fā)光物質(zhì)結(jié)合在與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)上而成的物質(zhì)。作為發(fā)光物質(zhì)，典型地為熒光性物質(zhì)，但也可以為通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的物質(zhì)。作為熒光物質(zhì)，只要是由特定波長(zhǎng)的光照射就發(fā)出熒光的物質(zhì)即可，沒(méi)有特別的限定，可以從用于FCS或FIDA等的熒光色素中適當(dāng)?shù)倪x擇使用。
[0149]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，發(fā)光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、與核酸結(jié)合的色素分子等。作為該寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)?？梢允遣糠只蛉堪怂犷?lèi)似物質(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類(lèi)似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對(duì)。另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)或低分子化合物等的情況下，作為發(fā)光探針，可以使用用熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)對(duì)目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體、或者將像生物素和抗生物素蛋白那樣與目標(biāo)粒子特異性結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記而得到的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)與發(fā)光物質(zhì)的結(jié)合可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行。
[0150]另外，本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針任選為能夠通過(guò)合成反應(yīng)等與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)自身。例如，可以使熒光色素等發(fā)光物質(zhì)中的官能團(tuán)與目標(biāo)粒子中的官能團(tuán)通過(guò)各種合成反應(yīng)而結(jié)合。作為該合成反應(yīng)，可列舉出例如:用水溶性碳化二亞胺使羧酸與氨基結(jié)合的EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽)反應(yīng)，預(yù)先將1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基丁二酰亞胺(NHS)混合而使羧酸和氨基結(jié)合的反應(yīng)，使活性化的醛基、甲苯磺酰基與目標(biāo)粒子中的官能團(tuán)結(jié)合的反應(yīng)等。另外，使用具有雙極性的連接體將目標(biāo)物質(zhì)中的氨基與發(fā)光物質(zhì)中的氨基交聯(lián)的反應(yīng)也可以。[0151]本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針也可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，從目標(biāo)粒子的檢測(cè)/定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的發(fā)光探針，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類(lèi)似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可，不需要與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，作為發(fā)光探針使用的被發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與該目標(biāo)粒子的堿基序列完全地互補(bǔ)的堿基序列，也可以具有與該目標(biāo)粒子的堿基序列錯(cuò)配的堿基序列。
[0152]本實(shí)施方式中，供于利用掃描分子計(jì)數(shù)法的檢測(cè)的試樣溶液中，不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針(單獨(dú)存在的發(fā)光探針)的大部分被去除。因此，與目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的發(fā)光探針、和單獨(dú)存在狀態(tài)的發(fā)光探針，即便發(fā)光特性相同，也能夠高精度地檢測(cè)出目標(biāo)粒子。
[0153]本實(shí)施方式中，也可以使用在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)、和單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同的發(fā)光探針。在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下，使特定波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度不同(例如，使熒光強(qiáng)度不同)，由此能夠更高精度地檢測(cè)出目標(biāo)粒子。需要說(shuō)明的是，在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下，發(fā)光探針的發(fā)光特性不同是指:在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下，特定的波長(zhǎng)的光強(qiáng)度不同。
[0154]例如，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，與蛋白質(zhì)結(jié)合且改變周?chē)h(huán)境時(shí)熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)變化的色素(例如，疏水性探針ANS、MANS、TNS這類(lèi)的熒光色素)可以作為發(fā)光探針使用。另外，發(fā)光探針也可以其自身不發(fā)光。例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，使用與該目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸作為發(fā)光探針，通過(guò)使與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，結(jié)合在由目標(biāo)粒子與發(fā)光探針形成的締合體上，能夠使在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下的發(fā)光特性不同。作為與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，可列舉出熒光性嵌入劑或結(jié)合了熒光物質(zhì)的溝結(jié)合劑
坐寸ο
[0155]其他的，可以使用例如:由至少兩個(gè)構(gòu)成要素形成的、通過(guò)與目標(biāo)粒子結(jié)合而使前述的至少兩個(gè)構(gòu)成要素的相互位置變化而發(fā)出熒光的物質(zhì)作為發(fā)光探針。作為這樣的物質(zhì)的例子，可列舉出:與某粒子結(jié)合時(shí)結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出強(qiáng)的熒光的熒光性蛋白質(zhì)、或者與某粒子結(jié)合時(shí)聚集而形成熒光性金屬絡(luò)合物的分子(絡(luò)合物的配體)。通過(guò)所述的構(gòu)成，在所有情況下，單獨(dú)的發(fā)光探針或不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針均幾乎不發(fā)光，或者即便發(fā)光也與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體的波長(zhǎng)不同，所以能夠選擇地檢測(cè)由目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體發(fā)出的光。
[0156]另外，通過(guò)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)，能夠使單獨(dú)存在的發(fā)光探針、和與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的發(fā)光特性不同。例如，作為發(fā)光探針可以使用如下物質(zhì):使在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)(熒光物質(zhì)、猝滅物質(zhì))按照在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)上結(jié)合而形成的物質(zhì)。與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針不再產(chǎn)生FRET，所以由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。另一方面，從單獨(dú)存在的發(fā)光探針中，檢測(cè)不到由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，或檢測(cè)到的熒光是減弱的。因此，通過(guò)檢測(cè)由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，能夠與單獨(dú)存在的發(fā)光探針區(qū)別地檢測(cè)到結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。
[0157]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，可以優(yōu)選使用分子信標(biāo)探針作為發(fā)光探針；該分子信標(biāo)探針如下形成:使FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)按照單鏈核酸分子的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、與其他單鏈核酸分子雜交形成締合體的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在當(dāng)為單鏈核酸分子的狀態(tài)時(shí)形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體的寡核苷酸上結(jié)合。可列舉出例如，3’末端側(cè)結(jié)合有成為能量供體的熒光物質(zhì)或成為能量受體的物質(zhì)、5’末端側(cè)結(jié)合有剩余的另一者并且3’末端側(cè)區(qū)域和5’末端側(cè)具有彼此互補(bǔ)的堿基序列，這些堿基序列形成堿基對(duì)由此形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(所謂的莖-環(huán)結(jié)構(gòu))的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，分子信標(biāo)探針的形成分子內(nèi)堿基對(duì)的彼此互補(bǔ)的區(qū)域，可以?shī)A著與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域而存在；3’末端側(cè)的區(qū)域和5’末端側(cè)的區(qū)域既可以為分別包含3’末端或5’末端的區(qū)域，也可以為不包含3’末端或5’末端的區(qū)域。此外，就形成堿基對(duì)的區(qū)域的堿基數(shù)或堿基序列而言，為所形成的堿基對(duì)的穩(wěn)定性低于與目標(biāo)粒子的締合體、且在檢測(cè)條件下能夠形成堿基對(duì)的程度即可。
[0158]另外，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，使用與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，即便該熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生FRET，也能夠區(qū)別單獨(dú)存在的發(fā)光探針和與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針。即，熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)中的任一者成為FRET的能量供體，另一者成為FRET的能量受體。由單獨(dú)存在的發(fā)光探針，檢測(cè)到由標(biāo)記該發(fā)光探針的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。與此相對(duì)，與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，所以能夠檢測(cè)到由FRET發(fā)出的熒光，結(jié)果能夠與單獨(dú)存在的發(fā)光探針區(qū)別而檢測(cè)。
[0159]此外，當(dāng)進(jìn)入發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體的堿基對(duì)之間的熒光性嵌入劑的量過(guò)多時(shí)，檢測(cè)自FRET發(fā)出的熒光時(shí)的背景變得過(guò)高，存在影響檢測(cè)精度的擔(dān)心。因此，優(yōu)選將發(fā)光探針設(shè)計(jì)成在發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體中形成雙鏈的區(qū)域?yàn)?00bp以下。
[0160]其他的，本實(shí)施方式中，也可以使用兩種發(fā)光探針。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，將兩種發(fā)光探針設(shè)計(jì)成相對(duì)于目標(biāo)粒子相互鄰接而雜交，將一者的發(fā)光探針用FRET中的成為能量供體的熒光物質(zhì)標(biāo)記，將另一者的發(fā)光探針用該FRET中的成為能量受體的物質(zhì)標(biāo)記。該情況下，單獨(dú)存在的發(fā)光探針不產(chǎn)生FRET，而通過(guò)與目標(biāo)粒子結(jié)合，該兩種發(fā)光探針相互接近而產(chǎn)生FRET。因此，通過(guò)檢測(cè)自該FRET發(fā)出的熒光，能夠檢測(cè)出與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0161]目標(biāo)粒子為核酸或核酸類(lèi)似物質(zhì)的情況下，可以使用2種發(fā)光探針，利用猝滅自動(dòng)連接(Quenched Autoligation, QUAL)反應(yīng)，使與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出光(J.AM.CHEM.S0C.，2002，(10)，p2096)。
[0162]具體而言，設(shè)計(jì)并制作:與目標(biāo)粒子雜交并且具有特殊的3’末端修飾堿基的核酸探針(N探針)；和與該N探針的3’末端側(cè)相鄰且與目標(biāo)粒子雜交并且在5’末端側(cè)修飾有猝滅色素和熒光色素的核酸探針(E探針)。如果2個(gè)探針與目標(biāo)粒子雜交，則發(fā)生非酶連接(Autoligation)反應(yīng),此時(shí),粹滅色素從E探針脫離。S卩，只在2個(gè)探針與目標(biāo)粒子雜交時(shí)才產(chǎn)生熒光。
[0163]本實(shí)施方式中使用的分離回收用粒子，與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體特異地或非特異地結(jié)合或吸附，并且能夠懸浮于水中，能夠通過(guò)通常的固液分離處理與液體分離。作為分離回收用粒子，可以使用例如:使能夠懸浮于水中并且通過(guò)通常的固液分離處理能夠與液體分離的粒子，與特異地或者非特異地結(jié)合或吸附目標(biāo)粒子的物質(zhì)結(jié)合而成的粒子。其他的，也可以使用如下粒子作為分離回收用粒子:表面具有不與未和目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針結(jié)合而能夠結(jié)合與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的部位，能夠懸浮于水中并且能夠通過(guò)通常的固液分離處理與液體分離。
[0164]分離回收用粒子在通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定中，需要在試樣溶液中維持懸浮狀態(tài)。因?yàn)樵跍y(cè)定中，在試樣溶液中沉淀的粒子難以通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行正確的檢測(cè)。因此，本實(shí)施方式中使用的分離回收用粒子在試樣溶液中的沉降速度優(yōu)選為lX10_6m/s以下，更優(yōu)選為lX10_7m/s以下。
[0165]需要說(shuō)明的是，粒子的沉降速度通常通過(guò)Stokes式而求出。下述式(8)中， 為珠半徑，P P為珠密度，Pf為溶液密度，g為重力加速度，η為溶液的粘度。
【權(quán)利要求】
1.一種目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其特征在于， 其為檢測(cè)在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有: (a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有所述發(fā)光探針的所述目標(biāo)粒子、所述發(fā)光探針和所述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由所述目標(biāo)粒子、所述發(fā)光探針和所述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序； (b)在所述工序(a)之后，從所述溶液中通過(guò)固液分離處理回收所述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；和 (C)算出所述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的所述復(fù)合體的分子數(shù)的工序， 所述分離回收用粒子與由所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針形成的結(jié)合體結(jié)合，如下進(jìn)行所述工序(C)的所述復(fù)合體的分子數(shù)的計(jì)數(shù): 使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由該光檢測(cè)區(qū)域中的所述復(fù)合體發(fā)出的光的工序； 由所述檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)復(fù)合體的光信號(hào)而逐個(gè)檢測(cè)復(fù)合體的工序；和 對(duì)所述逐個(gè)檢測(cè)到的復(fù)合體的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述分離回收用粒子在所述試樣溶液中的沉降速度為lX10_6m/s以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著第二路徑移動(dòng)，所述第二路徑的位置沿著第一路徑移動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述第一路徑以及第二路徑為循環(huán)路徑；沿著所述第二路徑的所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)周期短于沿著所述第一路徑的所述第二路徑的位置的移動(dòng)周期。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中， 所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)周期τ 1、所述第二路徑的位置的移動(dòng)速度ν2、和所述光檢測(cè)區(qū)域的直徑d滿足:
ν2.τ 1 > d0
6.根據(jù)權(quán)利要求3~5的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，通過(guò)改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路而使所述光檢測(cè)區(qū)域的位置沿著所述第二路徑移動(dòng)；通過(guò)移動(dòng)所述試樣溶液的位置而使所述試樣溶液內(nèi)的所述第二路徑的位置沿著所述第一路徑移動(dòng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3~6的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述第二路徑為圓形或橢圓形，所述第一路徑為圓形、橢圓形或直線。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比所述復(fù)合體的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，在由所述檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)復(fù)合體的光信號(hào)而逐個(gè)檢測(cè)復(fù)合體的工序中，根據(jù)檢測(cè)到的按照時(shí)間順序的光信號(hào)的形狀，檢測(cè)到一個(gè)復(fù)合體進(jìn)入了所述光檢測(cè)區(qū)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測(cè)方法，其中，所述分離回收用粒子為 磁性粒子。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103765194SQ201280041270
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月30日
【發(fā)明者】葉梨拓哉 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社