使用表面涂層對(duì)生物物質(zhì)的捕獲、純化和釋放的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于捕獲循環(huán)稀有細(xì)胞的表面涂層，其包含用以阻止非特異性細(xì)胞的結(jié)合和血清組分的吸附的抗污組合物；用于結(jié)合生物物質(zhì)如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物活性組合物；具有或沒有結(jié)合所述抗污和生物活性組合物的連接體組合物。本發(fā)明還提供一種用于捕獲并純化生物物質(zhì)的表面涂層，其包含用以釋放非特異性細(xì)胞和其它血清組分的釋放性組合物；用于結(jié)合生物物質(zhì)如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物活性組合物；具有或沒有結(jié)合所述釋放性和生物活性組合物的連接體組合物。本發(fā)明還公開了一種新型的微流體芯片，其具有特定圖案化的微結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生流動(dòng)擾動(dòng)并提高生物物質(zhì)的捕獲率。
【專利說明】使用表面涂層對(duì)生物物質(zhì)的捕獲、純化和釋放
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0001]本申請(qǐng)是2011年6月29日提交的美國專利申請(qǐng)序號(hào)61/502，844和2012年3月2日提交的美國專利申請(qǐng)序號(hào)61/606，220的正式申請(qǐng)，以上兩個(gè)申請(qǐng)通過引用整體并入本文。
關(guān)于在聯(lián)邦政府資助的研究與開發(fā)下進(jìn)行的發(fā)明的權(quán)利的聲明
[0002]不適用
關(guān)于“序列表”、表格或光盤提交的計(jì)算機(jī)程序列表附件
[0003]表I是EpAb4_l抗體的氨基酸序列。
【背景技術(shù)】
[0004]細(xì)胞脫落到循環(huán)中是惡性腫瘤的一種固有特性，而這一特性對(duì)于癌癥患者的診斷、分期、治療反應(yīng)和生存期提供了重要的信息。例如，Pantel等人發(fā)現(xiàn)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的數(shù)目與癌癥的攻擊性以及治療的功效相關(guān)。(Pantel，K.等人，“Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminatingtumor cells” , Nat Rev Cancer, 2008,8 (5): 329-40)。
[0005]然而，CTC是罕見的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移癌癥患者的血細(xì)胞中只占1/109。這使得CTC的檢測和分離在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。(見Kahnet等人，Breast Cancer ResTreat2004, 86:237-47)。因此，對(duì)于有效地檢測和分離CTC，富集過程是必要的。
[0006]這樣的富集過程的一個(gè)實(shí)例是使用高度過量表達(dá)的、對(duì)CTC具有高特異性和靈敏性的細(xì)胞表面生物標(biāo)志物，如上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)。唯一獲得FDA批準(zhǔn)的CTC檢測平臺(tái)一Cellsearch System? (Veridex),利用抗-EpCAM抗體涂覆的磁性納米粒子捕獲和富集CTC，接著進(jìn)行細(xì)胞角蛋白免疫染色。另一種可商業(yè)獲得的CTC檢測系統(tǒng)一AdnaTest(AdnaGen AG,德國)，采用了類似的免疫磁性方法,這種方法是通過使用抗-EpCAM和黏蛋白I (MUCl)偶聯(lián)的磁珠。最近，開發(fā)了基于抗-EpCAM抗體涂覆的微流體芯片的“CTC芯片”用于CTC檢測和富集(Nagrath等人，Nature2007，450:1235-9)。然而，由于抗-EpCAM抗體與血細(xì)胞的非特異性結(jié)合，上述技術(shù)的缺點(diǎn)是純CTC的檢測率低。
[0007]為了使CTC的檢測和分離最大化，降低其它循環(huán)血細(xì)胞的非特異性結(jié)合是必要的。這可以通過用生物惰性材料進(jìn)行表面修飾來實(shí)現(xiàn)。例如，Kaladhar等人觀察到了明顯更少的循環(huán)血細(xì)胞(如血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞)結(jié)合到由含磷脂酰膽堿、膽固醇和糖脂的各種脂質(zhì)組合物的支撐單層修飾的固體基質(zhì)上(Kaladhar等人，Langmuir2004, 20:11115-22和 Kaladhar 等人,J Biomed Mater Res A2006, 79A: 23-35)。
[0008]盡管在檢測和分離CTC的技術(shù)方面取得了進(jìn)步，但仍然需要更特異的、有效的用于檢測、純化和釋放CTC和其它生物物質(zhì)的方法，以便進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)和表征。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]一方面，本發(fā)明涉及一種用來捕獲循環(huán)稀有細(xì)胞(CRC)的表面涂層。這種表面涂層提高諸如CTC、循環(huán)干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胚胎細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等CRC的捕獲效率，并且減少非特異性細(xì)胞的結(jié)合或蛋白質(zhì)吸附。
[0010]這種表面涂層包含I)抗污組合物(nonfouling composition),該組合物會(huì)減少非特異性血細(xì)胞的結(jié)合和其它血液組分如蛋白質(zhì)的吸附；和2)捕獲CRC的生物活性組合物。該表面涂層還包含連接到所述抗污組合物和生物活性組合物上的連接體組合物，如圖1A所示。
[0011]另一方面，本發(fā)明涉及一種用來捕獲和釋放生物物質(zhì)的表面涂層。這種表面涂層提高諸如CTC、循環(huán)干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞、肝干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胚胎細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等生物物質(zhì)的捕獲效率，并且增強(qiáng)非特異性細(xì)胞或蛋白質(zhì)從表面涂層上的去除或釋放。
[0012]所述表面涂層包含I)釋放性組合物，用于從表面涂層上釋放或去除非特異性的血細(xì)胞和其它血液組分，如蛋白質(zhì)；和2)捕獲生物物質(zhì)的生物活性組合物。該表面涂層還包含連接到所述釋放性組合物和生物活性組合物上的連接體組合物。
[0013]本發(fā)明還涉及一種微流體裝置，其具有特定的微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，用以產(chǎn)生血液、體液或生物樣品的擾流以提聞生物物質(zhì)的捕獲率。
[0014]本發(fā)明還涉及一種制造表面涂層的方法，包括:a)形成抗污或釋放性組合物；和
b)將連接體組合物與來自步驟a)的抗污/釋放性組合物和生物活性組合物連接，或c)將來自步驟a)的抗污/釋放性組合物與生物活性組合物連接。
[0015]本發(fā)明還涉及從表面涂層上捕獲和釋放生物物質(zhì)的方法。在表面涂層上的生物物質(zhì)可通過去除非特異性細(xì)胞或蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。所捕獲的生物物質(zhì)可通過氣泡、紫外線照射等得到釋放。
[0016]本發(fā)明還涉及使用生物素化的抗-EpCAM抗體——EpAb4-l抗體來捕獲CTC。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]本發(fā)明的實(shí)施方案可以參照附圖加以說明。
[0018]圖1A示意性地顯示了包含抗污組合物、連接體組合物和生物活性組合物的表面涂層的實(shí)施方案。
[0019]圖1B示意性地顯示了循環(huán)腫瘤細(xì)胞與圖1A的表面涂層的結(jié)合。
[0020]圖2A到圖2F顯示了抗污材料的實(shí)例的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0021]圖3顯示了在抗污組合物和生物活性組合物上的官能團(tuán)之間的耦合的化學(xué)反應(yīng)。
[0022]圖4A示意性地顯示了不使用表面連接體的表面涂層和固體基質(zhì)的連接。
[0023]圖4B和4C示意性地顯示了具有可裂解官能團(tuán)的連接體組合物。
[0024]圖4D示意性地顯示了使用表面連接體的表面涂層和固體基質(zhì)的連接。
[0025]圖5A和5B示意性地顯示了固體基質(zhì)上的表面涂層的形成。
[0026]圖6A和6B示意性地顯示了微流體芯片的組件。
[0027]圖6C示意性地顯示了微流體芯片組裝件，用以從生物樣品中捕獲CTC。
[0028]圖7A到7H示意性地顯示了固體基質(zhì)上的微結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)。
[0029]圖71和7J分別顯示了各種微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)在DMEM溶液和血液中的捕獲效率。
[0030]圖8顯示了用來釋放非特異性細(xì)胞和純化所捕獲的生物物質(zhì)的緩沖液的剪切應(yīng)力。
[0031]圖9示意性地顯示了通過氣泡方法釋放生物物質(zhì)。
[0032]圖1OA示意性地顯示了在固體基質(zhì)上的含有可裂解連接體組合物的表面涂層。
[0033]圖1OB示意性地顯示了生物物質(zhì)從圖1OA中的表面涂層上的釋放。
[0034]圖11顯示了表面涂層結(jié)構(gòu)的QCM-D反應(yīng)。
[0035]圖12顯示了向表面涂層添加牛血清白蛋白的QCM-D反應(yīng)。
[0036]圖13是在緩沖液沖洗之前和之后，表面涂層上的非特異性細(xì)胞(頂部圖片)和CTC(底部圖片)的照片。
[0037]圖14A顯示了各種表面涂層的捕獲效率和非特異性血細(xì)胞結(jié)合。
[0038]圖14B是照片圖片，其顯示了在緩沖液沖洗之前和之后，各種表面涂層的非特異性血細(xì)胞結(jié)合。
[0039]圖15A到圖15C是在緩沖液沖洗純化之前和之后，表面涂層上的非特異性細(xì)胞和生物物質(zhì)的照片。
[0040]圖16顯示了用于從表面涂層上去除HCT116和NIH-3T3細(xì)胞群體的不同剪切應(yīng)力和沖洗時(shí)間。
[0041 ] 圖17是通過氣泡釋放的CTC的照片。
[0042]圖18顯示了在第I天、第10天和第14天釋放出的CTC的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0043]圖19示意性地顯示了 CTC過濾裝置。
[0044]圖20顯示了生物素化的0C9801抗體、生物素化的EpAb4_l抗體、生物素化的EpCaM抗體和IgG抗體的CTC結(jié)合特異性。
發(fā)明詳述
[0045]本發(fā)明涉及一種用來有效地捕獲循環(huán)稀有細(xì)胞(CRC)如CTC、循環(huán)干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胚胎細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的表面涂層。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，用來捕獲CRC的表面涂層包含I)抗污組合物，該組合物阻止非特異性細(xì)胞的結(jié)合和其它血液組分如蛋白質(zhì)的吸附；和2)能捕獲循環(huán)稀有細(xì)胞的生物活性組合物。該抗污組合物和生物活性組合物通過存在于該抗污和生物活性組合物中的離散官能團(tuán)或部分而連接。通常，這兩種組合物之間的連接是通過相互作用而形成的，該相互作用包括靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補(bǔ)DNA結(jié)合、磁力或其組合。
[0047]在一組實(shí)施方案中，互補(bǔ)DNA片段用于結(jié)合抗污組合物和生物活性組合物。該片段連接到每一個(gè)組合物上，并且可以在其長度上部分或完全互補(bǔ)。DNA的合適的長度一般至少為15、20、25、35、50、100個(gè)或更多個(gè)堿基的長度。在本發(fā)明中使用的DNA的一個(gè)實(shí)例是DNA 懾子(DNA tweezer)。(參見，B Yurke 等人，A DNA-fuelled molecular machine made ofDNA.Nature2000, 406:605-608)
[0048]在另一組實(shí)施方案中，所述表面涂層包含I)抗污組合物；2)生物活性組合物；和3)連接體組合物，其將所述抗污組合物和生物活性組合物連接起來。參見圖1A。
[0049]本發(fā)明還涉及一種表面涂層，其用來有效地捕獲生物物質(zhì)，如CTC、循環(huán)干細(xì)胞(例如腫瘤干細(xì)胞、肝干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞)、胚胎細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等等，通過經(jīng)由緩沖液沖洗來釋放或去除非特異性細(xì)胞和其它血清組分(例如蛋白質(zhì))從而純化表面涂層表面上的生物物質(zhì)，并從表面涂層上釋放所捕獲的生物物質(zhì)。
[0050]用于捕獲和純化生物物質(zhì)的表面涂層包含:1)釋放性組合物，其用于通過緩沖液沖洗來釋放非特異性血細(xì)胞和其它血液組分，如蛋白質(zhì)；和2)捕獲生物物質(zhì)的生物活性組合物。該釋放性組合物和生物活性組合物通過存在于該釋放性和生物活性組合物中的離散官能團(tuán)或部分而連接。通常，這兩種組合物之間的連接是通過相互作用而形成的，該相互作用包括靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補(bǔ)DNA結(jié)合、磁力或其組合。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面涂層還包含連接到釋放性組合物和生物活性組合物上的連接體組合物。
[0052]如下文更詳細(xì)說明的，可將所述表面涂層引入下列配置中:細(xì)胞培養(yǎng)皿，微流體通道，微流體芯片，過濾器，毛細(xì)管，管，珠，納米顆粒，等等，其具有從約50至約1000微米的內(nèi)直徑。
抗污和釋放性組合物
[0053]“抗污”組合物(參見圖1A)降低非特異性細(xì)胞的結(jié)合和血清蛋白質(zhì)的吸附。
[0054]“釋放性”組合物包含抗污組合物，后者也作為“潤滑”表面，使得只需要低流動(dòng)剪切應(yīng)力即可從表面涂層上去除或釋放非特異性細(xì)胞或血液組分，而生物物質(zhì)保持完好。
[0055]該抗污組合物選自:支撐的脂質(zhì)層如脂質(zhì)體，支撐的脂雙層(SLB)或脂質(zhì)多層，多肽，聚電解質(zhì)多層(PEM)，聚乙烯醇，如圖2A所示的聚乙二醇(PEG)，水凝膠聚合物，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，碳水化合物，聚合物刷，兩性離子材料，如圖2D所示的聚(羧基甜菜堿)(pCB)，如圖2E所示的聚(磺基甜菜堿)(pSB)和如圖2F所示的pDMAEMA，小有機(jī)化合物，和形成單層或多層的上述材料的組合。
[0056]對(duì)于那些其中抗污組合物包含支撐脂雙層(SLB)的實(shí)施方案，該SLB通常包含脂質(zhì)，例如，如圖2B所示的1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(帽生物素基)(鈉鹽)(b-PE)和1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC)。SLB的抗蛋白質(zhì)特性可以通過在寬PH值范圍內(nèi)中性和兩性離子磷脂酰膽堿頭基的存在以及在親水性脂質(zhì)頭基和本體溶液之間形成的水性薄膜來解釋(參見，Johnson等人，Biophys J1991, 59:289-94)。
[0057]在另一組實(shí)施方案中，抗污組合物包含PEG，優(yōu)選分子量為約100至約100，000并且展示出抗污性質(zhì)的PEG。
[0058]在又另一組實(shí)施方案中，抗污組合物包含聚電解質(zhì)多層(PEM)或聚合物刷。在本發(fā)明中有用的合適的PEM的實(shí)例包括，但不限于，聚-L-賴氨酸/聚-L-谷氨酸(PLL/PLGA)、聚-L-賴氨酸/聚-L-天冬氨酸或類似的反荷離子聚合電解質(zhì)。所述聚合物刷包括:如圖2C中所示的([2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨，TMA)/ (2-羧基丙烯酸乙酯，CAA)共聚物。通常，該抗污層具有從幾納米到幾百微米的厚度。
[0059]抗污組合物包含官能團(tuán)，該官能團(tuán)能夠直接共價(jià)、非共價(jià)或共價(jià)和非共價(jià)組合地連接到存在于生物活性組合物中的官能團(tuán)上，或者直接連接到作為連接組合物的一部分的官能團(tuán)上。
[0060]在一些實(shí)施方案中，抗污組合物的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)選自:羥基、胺基、羧酸或酷基、硫酷基、醒基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙燒基團(tuán)、餅基和疏基，它們被選為對(duì)存在于連接體或者生物活性組合物中的官能團(tuán)具有反應(yīng)性。在其它實(shí)施方案中，作為結(jié)合對(duì)的第一成員的抗污組合物的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)選自由生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷組成的使用特異性結(jié)合識(shí)別的組，其中的每一個(gè)被選為與存在于連接體或生物活性組合物中的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
連接體組合物
[0061]連接體組合物連接抗污/釋放性組合物和生物活性組合物,并且包含能夠直接共價(jià)、非共價(jià)或共價(jià)和非共價(jià)組合地連接到存在于抗污/釋放性組合物中的官能團(tuán)上和連接到作為生物活性組合物的一部分的官能團(tuán)上的官能團(tuán)。
[0062]在一些實(shí)施方案中，連接體組合物包含選自以下的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前):羥基、胺基、竣酸或酷基、硫酷基、醒基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙燒基團(tuán)、餅基和疏基，它們被選為對(duì)存在于抗污或者生物活性組合物中的官能團(tuán)具有反應(yīng)性。
[0063]在其它實(shí)施方案中，連接體組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自由生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷組成的使用特異性結(jié)合識(shí)別的組，其中的每一個(gè)被選為與存在于抗污/釋放性組合物或生物活性組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
[0064]連接體組合物上的官能團(tuán)也可以是可裂解官能團(tuán)，其選自:可通過紫外線照射而裂解的光敏官能團(tuán)，可通過電脈沖機(jī)制而裂解的電敏官能團(tuán)，可通過磁力的缺失而裂解的磁性材料，可通過破壞靜電相互作用而裂解的聚電解質(zhì)材料，可通過雜交而裂解的DNA，等
坐寸ο
生物活性組合物
[0065]生物活性組合物連接到連接體組合物或抗污組合物上，并且包含對(duì)生物物質(zhì)或CRC的檢測具有選擇性的結(jié)合部分。
[0066]生物活性組合物包含能夠直接共價(jià)、非共價(jià)或共價(jià)和非共價(jià)組合地連接到存在于抗污層中的官能團(tuán)上或者連接到為連接體組合物的一部分的官能團(tuán)上的官能團(tuán)。
[0067]在一些實(shí)施方案中，生物活性組合物的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)選自:羥基、胺基、竣酸或酷基、硫酷基、醒基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙燒基團(tuán)、餅基和疏基，它們被選為對(duì)存在于抗污或連接體組合物中的官能團(tuán)具有反應(yīng)性。在其它實(shí)施方案中，生物活性組合物的官能團(tuán)(非共價(jià)結(jié)合之前)選自由生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原-抗體和正-負(fù)電荷組成的使用特異性結(jié)合識(shí)別的組，其中的每一個(gè)被選為與存在于抗污/釋放性組合物或連接體組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
[0068]生物活性組合物的結(jié)合部分通過分子識(shí)別、化學(xué)親和力或幾何/形狀識(shí)別而對(duì)生物物質(zhì)具有特異性親和力。用于生物物質(zhì)檢測的結(jié)合部分的實(shí)例包括但不限于:合成聚合物、分子印跡聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、結(jié)合受體、抗體、DNA、RNA、抗原或任何其它對(duì)生物物質(zhì)呈現(xiàn)出高親和力的表面標(biāo)記物。一種優(yōu)選的抗體是抗-EpCAM膜蛋白抗體(可購自許多來源，包括R & D Systems，MN，USA)，其提供對(duì)CTC的高特異性，因?yàn)镋pCAM在肺、結(jié)腸直腸、乳腺、前列腺、頭頸和肝的惡性腫瘤中經(jīng)常過量表達(dá)，但是它不存在于血液系統(tǒng)細(xì)胞中。另一種優(yōu)選的抗體是抗-HER2，它對(duì)CTC具有高特異性，但不存在于血液系統(tǒng)細(xì)胞中。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗-EpCAM膜蛋白抗體是EpAb4_l抗體，其包含具有SEQID NO:1的重鏈序列和具有SEQ ID NO: 2的輕鏈序列，如表I所示。
表1.EpAb4-l抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列
【權(quán)利要求】
1.一種用于捕獲循環(huán)稀有細(xì)胞的表面涂層，所述表面涂層包含: a)抗污組合物；和 b )生物活性組合物，其對(duì)所述循環(huán)稀有細(xì)胞具有選擇性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面涂層，其中所述抗污組合物通過相互作用與所述生物活性組合物連接，該相互作用包括靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補(bǔ)DNA結(jié)合、磁力或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面涂層，還包含連接體組合物，該連接體組合物將所述抗污組合物連接到所述生物活性組合物上，并且包含能夠共價(jià)、非共價(jià)或共價(jià)和非共價(jià)組合地連接到所述抗污組合物上以及連接到所述生物活性組合物上的官能團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面涂層，其中所述連接體組合物包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面涂層，其中所述連接體組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述抗污組合物或生物活性組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面涂層，其中所述連接體組合物包含可裂解官能團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面涂層，其中相對(duì)于不含抗污組合物的組合物，所述抗污組合物減少了非特異性生物物質(zhì)的結(jié)合，并且所述抗污組合物選自:脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物、多肽、聚電解質(zhì)多層、聚乙烯醇、PEG、水凝膠聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、聚合物刷、兩性離子材料、碳水化合物、小有機(jī)化合物及其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面涂層，其中所述脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物是脂質(zhì)層。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面涂層，其中所述PEG具有約100至約100,000的分子量。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面涂層，其中所述聚電解質(zhì)多層包含聚-L-賴氨酸/聚-L-谷氨酸，或聚-L-賴氨酸/聚-L-天冬氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面涂層，其中所述聚合物刷包括[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨/2-羧基丙烯酸乙酯)共聚物。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面涂層，其中所述兩性離子材料是聚(磺基甜菜堿)(pSB)和聚(羧基甜菜堿)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面涂層，其中所述抗污組合物包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的表面涂層，其中所述抗污組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述連接體組合物或生物活性組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面涂層，其中所述生物活性組合物包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的表面涂層，其中所述生物活性組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述連接體組合物或抗污組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面涂層，其中所述生物活性組合物具有選自合成聚合物、分子印跡聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、結(jié)合受體、DNA、RNA、抗體、抗原、表面標(biāo)記物和適體的結(jié)合部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的表面涂層，其中所述結(jié)合部分是抗-EpCAM膜蛋白抗體或抗-HER2。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的表面涂層，其中所述抗-EpCAM膜蛋白抗體是EpAb4-l。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的表面涂層，還包含固體基質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的表面涂層，其中所述固體基質(zhì)通過下列相互作用之一連接到表面涂層上:共價(jià)鍵合、氫鍵 鍵合、靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補(bǔ)DNA結(jié)合、磁力或其組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的表面涂層，還包含將所述表面涂層連接到所述固體基質(zhì)上的表面連接體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的表面涂層，其中所述表面連接體包含可裂解官能團(tuán)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的表面涂層，其中所述表面連接體包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的表面涂層，其中所述表面連接體包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述固體基質(zhì)或抗污組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
26.一種用于捕獲和純化生物物質(zhì)的表面涂層，所述表面涂層包含: a)釋放性組合物，其用來釋放非特異細(xì)胞和血液組分；和 b)生物活性組合物,其對(duì)所述生物物質(zhì)具有選擇性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，其中所述釋放性組合物通過相互作用連接到所述生物活性組合物上，該相互作用包括靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補(bǔ)DNA結(jié)合、磁力或其組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，還包含連接體組合物，該連接體組合物將所述抗污組合物連接到所述生物活性組合物上，并且包含能夠共價(jià)、非共價(jià)或共價(jià)和非共價(jià)組合地連接到所述抗污組合物上以及連接到所述生物活性組合物上的官能團(tuán)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的表面涂層，其中所述連接體組合物包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的表面涂層，其中所述連接體組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述生物活性或釋放性組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的表面涂層，其中所述連接體組合物包含可裂解官能團(tuán)。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，其中相對(duì)于不含釋放性組合物的表面涂層，所述釋放性組合物增強(qiáng)了從其表面除去非特異性細(xì)胞和血液組分，并且所述釋放性組合物選自:脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物、多肽、聚電解質(zhì)多層、聚乙烯醇、PEG、水凝膠聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、聚合物刷、兩性離子材料、碳水化合物、小有機(jī)化合物及其組合。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的表面涂層，其中所述脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物是支撐的脂質(zhì)層。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的表面涂層，其中所述PEG具有約100至約100,000的分子量。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的表面涂層，其中所述聚電解質(zhì)多層包含聚-L-賴氨酸/聚-L-谷氨酸或聚-L-賴氨酸/聚-L-天冬氨酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的表面涂層，其中所述聚合物刷包括[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨/2-羧基丙烯酸乙酯)共聚物。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的表面涂層，其中所述兩性離子材料是聚(磺基甜菜堿)和聚(羧基甜菜堿)。
38.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，其中所述釋放性組合物包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
39.根據(jù)權(quán)利要求26或28所述的表面涂層，其中所述釋放性組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述生物活性組合物或連接體組 合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
40.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，其中所述生物活性組合物包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
41.根據(jù)權(quán)利要求26或28所述的表面涂層，其中所述生物活性組合物包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述釋放性組合物或連接體組合物上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
42.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，其中所述生物活性組合物具有選自合成聚合物、分子印跡聚合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、結(jié)合受體、DNA、RNA、抗體、抗原、表面標(biāo)記物和適體的結(jié)合部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的表面涂層，其中所述結(jié)合部分是抗-EpCAM膜蛋白抗體或抗-HER2。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的表面涂層,其中所述抗-EpCAM膜蛋白抗體是EpAb4_l。
45.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表面涂層，還包含固體基質(zhì)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的表面涂層，其中所述固體基質(zhì)通過下列相互作用之一連接到該表面涂層上:共價(jià)鍵合、氫鍵鍵合、靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補(bǔ)DNA或磁力。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的表面涂層，還包含將所述表面涂層連接到所述固體基質(zhì)上的表面連接體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的表面涂層，其中所述表面連接體包含可裂解官能團(tuán)。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的表面涂層，其中所述表面連接體包含選自羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環(huán)氧基或環(huán)氧乙烷基團(tuán)、肼基和巰基的官能團(tuán)(共價(jià)連接之前)。
50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的表面涂層，其中所述表面連接體包含作為結(jié)合對(duì)的第一成員的官能團(tuán)(非共價(jià)連接之前)，該官能團(tuán)選自生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體和正-負(fù)電荷，它們中的每一個(gè)被選為與存在于所述釋放性組合物或固體基質(zhì)上的結(jié)合對(duì)的第二成員結(jié)合。
51.—種微流體芯片,其包含 (a)兩個(gè)固體基質(zhì),其中一個(gè)或兩個(gè)固體基質(zhì)在表面上具有如圖7H所不的微結(jié)構(gòu)；和 (b)用于結(jié)合兩個(gè)固體基質(zhì)的粘結(jié)手段。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的微流體芯片，其中所述固體基質(zhì)涂有權(quán)利要求1-24中的任何一項(xiàng)的表面涂層。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的微流體芯片，其中所述固體基質(zhì)涂有權(quán)利要求25-49中的任何一項(xiàng)的表面涂層。
54.一種制造權(quán)利要求1的表面涂層的方法，包括: Ca)形成所述抗污組合物；和 (b)將所述抗污組合物連接到所述生物活性組合物上。
55.一種制造權(quán)利要求3的表面涂層的方法，包括: Ca)形成所述抗污組合物；和 (b )將所述連接體組合物連接到所述抗污組合物和所述生物活性組合物上。
56.一種捕獲和釋放生物物質(zhì)的方法，包括: Ca)使血液、體液或生物樣品溶液接觸權(quán)利要求1-25中的任何一項(xiàng)的表面涂層；和 (b)從該表面涂層上釋放所述生物物質(zhì)。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，還包括用緩沖液沖洗所述表面涂層以在從所述表面涂層上釋放生物物質(zhì)之前除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述緩沖液沖洗的剪切應(yīng)力小于約50達(dá)因/2cm ο
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述緩沖液沖洗的剪切應(yīng)力為約2.5到約10達(dá)因/cm2。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述生物物質(zhì)通過下列機(jī)制之一釋放:引入氣泡、紫外線輻照、磁力的缺失、電脈沖機(jī)制或破壞靜電相互作用。
61.一種使用生物素化的EpAb4-l抗體捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，其中所述抗體包含: Ca)重鏈序列，其中所述重鏈序列是SEQ ID NO:1 ;和 (b)輕鏈序列，其中所述輕鏈序列是SEQ ID NO:2。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103998932SQ201280041521
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月29日
【發(fā)明者】張瑛芝, 吳漢忠, 曾博元 申請(qǐng)人:中央研究院