蛋白偶聯(lián)的試劑化合物的整體分子量測(cè)定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于快速測(cè)定藥物偶聯(lián)物連接于鏈間半胱氨酸殘基所致的非共價(jià)結(jié)合抗體重鏈(HC)和抗體輕鏈(LC)的完整分子量的方法和系統(tǒng)。通過使用天然脫鹽條件分析抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，ADC的完整-二價(jià)結(jié)構(gòu)得以維持，該二價(jià)結(jié)構(gòu)通常會(huì)因LCMS常用的變性色譜條件而降解。隨后使用去溶劑化和離子化的ESI-MS條件測(cè)定脫鹽ADC的分子量。本文中描述的方法用于直接測(cè)量在鏈間半胱氨酸殘基上偶聯(lián)的ADC的完整分子量。本文描述的方法也用于個(gè)體ADC種類的相對(duì)定量測(cè)得。
【專利說明】蛋白偶聯(lián)的試劑化合物的整體分子量測(cè)定
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年9月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/540，839和2012年9月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/701，489的優(yōu)先權(quán)和利益，二者通過引用的方式將它們整體引入在此。
[0003]發(fā)明背景
[0004]抗體藥物偶聯(lián)物(Antibody Drug Conjugates, ADC)是將有效負(fù)荷祀向遞送至革巴標(biāo)的化合物。在許多實(shí)例中，靶標(biāo)是腫瘤相關(guān)的抗原(TAA)，有效負(fù)荷是藥物。
[0005]抗體分為許多類別，包括IgGl和IgG2。IgGl和IgG2抗體的結(jié)構(gòu)包括2條重鏈(HC)和2條輕鏈(LC)。兩條重鏈和兩條輕鏈表現(xiàn)為一復(fù)合體組成完整抗體。各IgGl抗體通過各抗體鏈上相應(yīng)的半胱氨酸氧化形成12個(gè)鏈內(nèi)和4個(gè)鏈間二硫鍵。在重鏈和輕鏈之間具有兩個(gè)二硫鍵，在重鏈和重鏈之間具有兩個(gè)二硫鍵。完全的還原IgG I抗體的鏈間二硫鍵會(huì)導(dǎo)致抗體復(fù)合物依靠非共價(jià)相互作用維持。
[0006]完全還原IgG I抗體的鏈間二硫鍵會(huì)產(chǎn)生八個(gè)可使用的(accessible)硫醇以便與藥物偶聯(lián)，一般通過接頭。改變還原參數(shù)能夠得到具有O至8個(gè)硫醇以供偶聯(lián)的抗體同分異構(gòu)體。例如，使用DTT還原IgG I能夠產(chǎn)生具有2、4、6或8個(gè)可用硫醇的抗體。充分還原的ADC靠非共價(jià)相互作用，例如氫鍵、離子鍵、疏水和范德華相互作用維持在一起，在變性條件下(例如，反相色譜)將會(huì)分離為輕和重鏈。非充分還原的ADC靠共價(jià)的和非共價(jià)相互作用維持在一起。在變性條件下，依靠共價(jià)鍵維持在一起的非充分還原的ADC也可能被分離。
[0007]充分負(fù)載的IgG I ADC中的一個(gè)藥物分子構(gòu)成抗體的二硫鍵的每一個(gè)半胱氨酸，每個(gè)抗體總計(jì)有八個(gè)藥物。部分負(fù)載的ADC —般具有2、4或6個(gè)藥物分子連接在半胱氨酸殘基上。也觀察到部分負(fù)載的ADC具有1、3、5個(gè)藥物分子連接在半胱氨酸殘基上。雖然通過質(zhì)譜(MS)測(cè)定了負(fù)載ADC的組成片段的分子量，但本發(fā)明所屬領(lǐng)域仍存在測(cè)定負(fù)載ADC的整體分子量的問題。
[0008]雖然缺乏直接測(cè)定負(fù)載ADC的整體分子量的技術(shù)，但已知測(cè)量負(fù)載ADC的整體分子量的各種間接手段。例如，采用以下方法測(cè)量ADC的分子量:在有低濃度有機(jī)溶劑或沒有有機(jī)溶劑存在下，將樣品(例如，ADC)結(jié)合至加熱的反相高效液相色譜柱(rp-HPLC)，所述有機(jī)溶劑典型地也包含離子配對(duì)酸(例如，三氟乙酸)并且能將不揮發(fā)的鹽和表面活性劑自樣品中洗脫(通常稱為脫鹽)。在此例中，通過提高溶劑中有機(jī)組分的含量至某一點(diǎn)，在該點(diǎn)疏水的蛋白結(jié)構(gòu)域和rp-HPLC色譜柱表面的相互作用被非極性有機(jī)溶劑破壞，從而將蛋白從rp-HPLC色譜柱上洗脫下來。該技術(shù)的不良影響是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)因蛋白樣品經(jīng)歷加熱、酸和有機(jī)溶劑而破壞，其中任一因素都能使蛋白變性并破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。當(dāng)非共價(jià)的蛋白復(fù)合物經(jīng)歷rp-HPLC時(shí)，它們會(huì)降解為構(gòu)成它們的共價(jià)實(shí)體。以具有8個(gè)鏈間連接的半胱氨酸藥物的IgGl抗體為例，在rp-HPLC柱上作脫鹽導(dǎo)致ADC完全分解為每鏈3個(gè)藥物的重鏈和每鏈I個(gè)藥物的輕鏈。雖然可以通過質(zhì)譜(MS)測(cè)定組分片段的分子量，但是本發(fā)明所屬領(lǐng)域缺乏測(cè)定完整實(shí)體的分子量的方法。[0009]目前的MS技術(shù)無法測(cè)定ADC整體分子量，部分是因?yàn)檫@些技術(shù)導(dǎo)致蛋白的變性和/或就本文考慮的應(yīng)用而言耗費(fèi)太多時(shí)間。事實(shí)上蛋白的所有天然電噴霧電離(nativeelectrospray ionization) (ESI)質(zhì)譜方法均規(guī)定該過程應(yīng)在納米噴霧(nanospray)水平(流速為100至500納升/分鐘)以最大程度降低蛋白結(jié)構(gòu)的損壞，而這些損壞在標(biāo)準(zhǔn)ESI所用的加熱護(hù)套和去溶劑化氣體中可能發(fā)生。采用常規(guī)納米噴霧ES1-MS技術(shù)測(cè)定ADC天然分子量的樣品處理過程非常耗時(shí)并且無法滿足高通量。即便不包括抗體去糖基化(deglycosylate)的時(shí)間，每個(gè)樣品至少需要一小時(shí)才能獲得分子量測(cè)定值。
[0010]而且，分析鏈間半胱氨酸-連接的ADC的已知方法既不能滿足在線質(zhì)譜法(spectrometry)(例如，HIC),又在層析分離和隨后的分子量測(cè)定(例如，rp-HPLC)過程中導(dǎo)致偶聯(lián)的重鏈和輕鏈變性分解。因此，本發(fā)明所屬領(lǐng)域需能夠常規(guī)和快速地測(cè)定半胱氨酸-連接ADC的整體分子量的方法。
[0011]令人意外地，通過提供檢測(cè)非共價(jià)結(jié)合的蛋白藥劑偶聯(lián)物的分子量的方法、設(shè)備和系統(tǒng)，本發(fā)明滿足了這一需求以及相關(guān)領(lǐng)域中其它未滿足的需求。
[0012]發(fā)明概述
[0013]在第一方面,本發(fā)明提供了檢測(cè)蛋白藥劑偶聯(lián)物(protein agent conjugate)分子量(mass)的方法。該方法包括以下步驟，在揮發(fā)性鹽且不含非揮發(fā)性鹽的條件下提供非共價(jià)結(jié)合且未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物(protein agent conjugate compound);將蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；和，通過質(zhì)譜直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。
[0014]在第二方面，本發(fā)明提供了系統(tǒng)，例如，但不限于，設(shè)置為用于執(zhí)行本文所述方法之一的質(zhì)譜儀。
[0015]附圖簡(jiǎn)述
[0016]圖1顯示MR為O至8的各種代表性ADC的IgGl結(jié)構(gòu)，包括異構(gòu)體，將抗體和藥劑偶聯(lián)產(chǎn)生，所述藥劑，在一方面為藥物，在另一方面為標(biāo)記物，在還有另一方面為毒素。ADC中抗體(圖中示為mAb) (MR = 0)亞基間的二硫連接橋連接于藥物，產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合的2LC-2HC藥物-連接的種類。
[0017]圖2顯示在變性的和非變性條件下，與去糖基化mAb-A的分子量檢測(cè)值相關(guān)的未處理的和去卷積的MS。在變性條件下獲得的未處理的和去卷積的MS數(shù)據(jù)分別顯示于圖A和C中，在非變性條件下獲得的未處理的和去卷積的MS數(shù)據(jù)分別顯示于圖B和D中。圖B中在200和3500m/z之間(該區(qū)域是變性抗體明顯的區(qū)域)明顯的離子是存在用來去糖基化的PNG酶F (PNGase F)和非離子去垢劑吐溫_80所致。
[0018]圖3顯示在變性的和非變性條件下，去糖基化馬來酰亞胺己?；鶈渭谆鶌W利司他汀 F(deglycosylated maleimidocaproyl monomethyl auristatin F, mcMMAF)偶聯(lián)物ADC-A的分子量檢測(cè)值相關(guān)的未處理和去積MS。在變性條件下獲得的未處理和去卷積MS數(shù)據(jù)分別顯示于圖A和C中，在非變性條件下獲得的未處理和去卷積MS數(shù)據(jù)分別顯示于圖B和D中。完整ADC-A的多個(gè)荷電離子在圖B中用括號(hào)示出；圖C和圖D中存在的去卷積化人工結(jié)果用星號(hào)不出。
[0019]圖4顯示去糖基化馬來酰亞胺己?；鶈渭谆鶌W利司他汀F (mcMMAF)偶聯(lián)物ADC-A和相應(yīng)母體物質(zhì)，mAb-A的去卷積質(zhì)譜圖。非共價(jià)結(jié)合的ADC結(jié)構(gòu)顯示在MS中相應(yīng)離子上。
[0020]圖5顯示去糖基化mc-Val-Cit-PAB單甲基奧利司他汀E(vcMMAE)偶聯(lián)物ADC-B和相應(yīng)母體物質(zhì)，mAb-A的反卷積質(zhì)譜圖。非共價(jià)結(jié)合的ADC結(jié)構(gòu)顯示在MS中相應(yīng)離子上。
[0021]圖6 顯示每 IgGlADC-A 的 vcMMAF(圖 A)和每 IgG I ADC-B 的 vcMMAE(圖 B)的摩爾比的相對(duì)水平，通過從去反卷積質(zhì)譜作基于MS的定量和通過HIC分離諸種類的UV積分測(cè)定。
[0022]圖7顯示脫鹽ADC和相應(yīng)初始材料的雙柱SEC分析的色譜圖對(duì)比。
[0023]圖8顯示MR值為0、2、4、6、8的偶聯(lián)物物在各鹽濃度下的vcMMAE相對(duì)百分比。
[0024]圖9顯示通過HIC分離mcMMAF ADC (圖A)，隨后通過SEC-MS分析收集的組分(圖B)的表征結(jié)果。
[0025]圖10顯示HIC分離的各組分的分析，顯示可采用SEC-MS，通過解離片段的分子量來評(píng)估ADC多肽鏈上的藥物連接位置。
[0026]圖11顯示具有MR = 0、2、4、6或8的蛋白藥劑偶聯(lián)物的去卷積MS分子量檢測(cè)值。
[0027]圖12顯示具有MR = 0、2、4、6或8的蛋白藥劑偶聯(lián)物的去卷積MS分子量檢測(cè)值。
[0028]發(fā)明詳述
[0029]1.概述
[0030]本發(fā)明提出了用于檢測(cè)非共價(jià)結(jié)合蛋白藥劑偶聯(lián)化合物分子量的方法。這些方法包括步驟:(a)在基質(zhì)中提供蛋白藥劑偶聯(lián)化合物；(b)將洗脫的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；和(C)通過質(zhì)譜直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在進(jìn)一步地實(shí)施方式中，在所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的非變性條件下應(yīng)用分離介質(zhì)以實(shí)現(xiàn)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與所述基質(zhì)分離。在部分的這些實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是基本上未變性的。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述非變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在揮發(fā)性鹽中從分離介質(zhì)化合物洗脫。
[0031]1.定義
[0032]除非另有定義，本文中使用的所有的詞語(yǔ)、符號(hào)和其它科技詞語(yǔ)或術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)理解的含義。在一些例子中，本文定義具有常規(guī)理解意義的詞語(yǔ)是為了清晰和/或便于參考起見，本文包括這些定義不應(yīng)當(dāng)理解為表示與本領(lǐng)域常規(guī)理解的有實(shí)質(zhì)性不同。此處描述或引用的很多技術(shù)和方法是熟知的，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)方法加以利用。如果合適，涉及使用商業(yè)可得的試劑盒和試劑的方法通常按照供應(yīng)商確定的方案和/或參數(shù)進(jìn)行，除非另有說明。
[0033]當(dāng)本文使用商品名時(shí)，應(yīng)獨(dú)立包括含該商品名產(chǎn)品的配方、通用藥物和該商品名產(chǎn)品的一種或多種藥學(xué)活性成分。
[0034]本文所用的縮寫“MR”指偶聯(lián)于，例如蛋白或抗體的藥物分子數(shù)量。例如，MR = O意味著沒有藥物分子偶聯(lián)至給定的蛋白或給定的抗體。MR = 8意味著有8個(gè)藥物分子偶聯(lián)至給定的蛋白或給定的抗體上。MR可以包括0、1、2、3、4、5、6、7和8。
[0035]除非另有陳述，本文中使用的以下術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)應(yīng)具有如下的含義:
[0036]本文所用的術(shù)語(yǔ)“ADC”指抗體藥物偶聯(lián)物。ADC的抗體部分對(duì)抗原具有特異性。感興趣的抗原包括但不限于，⑶30、⑶40、⑶19、⑶33和⑶70。
[0037]本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”指包含一個(gè)或更多個(gè)通常折疊成三維形式的多肽的化合物，其可以促進(jìn)生物學(xué)功能。
[0038]本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指氨基酸及其等價(jià)物的聚合物，且并不指特定的產(chǎn)物長(zhǎng)度；因此，“肽”和“蛋白”包括在多肽的定義中。本文定義的“抗體”也包括在蛋白的定義中。“多肽區(qū)域”指多肽的區(qū)段，該區(qū)段可能包含，例如，一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域或基序(例如，抗體的多肽區(qū)域可包含，如一個(gè)或多個(gè)OTR)。
[0039]本文所用的術(shù)語(yǔ)“片段”指多肽的一部分，通常具有該多肽的至少20個(gè)連續(xù)的或至少50個(gè)連續(xù)的氨基酸。
[0040]本文所用的短語(yǔ)“非共價(jià)結(jié)合的蛋白”指這樣一種蛋白，其中多肽鏈之間的至少一個(gè)共價(jià)結(jié)合作用被破壞但該蛋白維持其完整的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，參考ADC，非共價(jià)結(jié)合蛋白是其鏈間的二硫鍵經(jīng)歷還原卻仍維持其整體結(jié)構(gòu)的蛋白(例如，兩條重鏈仍然維持與兩條輕鏈結(jié)合)。ADC為共價(jià)和非共價(jià)相互作用的復(fù)合體。在一些ADC中仍保留共價(jià)相互作用，例如，那些具有2、4或6個(gè)藥物負(fù)載的ADC。在具有2個(gè)藥物負(fù)載的ADC例子中，該ADC在兩條重鏈間和一條輕鏈-重鏈間具有共價(jià)的鏈間二硫鍵，在其它輕鏈-重鏈存在非共價(jià)結(jié)構(gòu)。同樣地，在負(fù)載有4個(gè)藥物的ADC中，其也是由重鏈和輕鏈間的共價(jià)和非共價(jià)相互作用構(gòu)成的復(fù)合體。
[0041]本文所用的短語(yǔ)“蛋白藥劑偶聯(lián)化合物”指這樣一種化合物，該化合物包含與藥劑偶聯(lián)的蛋白。該蛋白可以但不限于，抗體、抗體片段、Fe融合蛋白、或非共價(jià)蛋白復(fù)合體，在某些方面，該蛋白可以為抗體。在另一方面，該蛋白是抗體片段。在其它方面，該蛋白可以為Fe融合蛋白。在還有其它方面，該蛋白可以由亞基的復(fù)合體組成，而所述亞基不是通過共價(jià)鍵鍵合。這類蛋白的例子是血紅蛋白，其是非共價(jià)結(jié)合的2條α鏈和2條β鏈的四聚體；伴刀豆球蛋白Α，其是四聚體；雌激素受體，其是二聚體。Fe融合蛋白包括將功能蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域嫁接至Fe 二聚體,其中Fe單體由Fe絞鏈區(qū)的半胱氨酸殘基鍵合。該蛋白可以具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，該四級(jí)結(jié)構(gòu)僅由非共價(jià)相互作用維持而不是由共價(jià)鍵維持。一個(gè)例子是血紅蛋白，血紅蛋白包含在變性條件下能夠解離的4個(gè)亞基。血紅蛋白的半胱氨酸可以偶聯(lián)藥物，但是，相對(duì)于抗體，該半胱氨酸不參與將亞基結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合在一起。
[0042]本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥劑”指藥物、標(biāo)記物、毒素等。
[0043]本文所用的術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)(matrix) ”指蛋白或蛋白藥劑偶聯(lián)化合物存在的環(huán)境或背景。例如，“基質(zhì)”包括制劑緩沖液、生物學(xué)血清、表面活性劑、賦形劑或細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。
[0044]本文所用的短語(yǔ)“非變性條件”指蛋白(例如，抗體)不喪失其二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的條件。非變性條件包括不存在超過能引起熱解折疊的高溫(例如，50°C或更高)和極端pH(例如，低于pH5和高于pH8)。
[0045]本文所用的短語(yǔ)“非變性蛋白”意為維持其二級(jí)、三級(jí)和，在適用情況下，四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白(例如，抗體)。
[0046]本文所用的術(shù)語(yǔ)“還原的蛋白”(例如，抗體)指其鏈間二硫鍵已被破壞的蛋白。
[0047]本文所用的短語(yǔ)“變性的蛋白”(例如，抗體)指那些已經(jīng)喪失了其二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白。
[0048]本文所用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)性(substantially) ”指測(cè)得數(shù)量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的蛋白(如，抗體)在分離介質(zhì)步驟(例如，通過SEC)后是非變性的，該數(shù)量通過通過從去反卷積質(zhì)譜作基于MS的定量測(cè)得和通過HIC分離諸物質(zhì)的UV積分測(cè)定的摩爾比的相對(duì)水平測(cè)得。
[0049]本文所用的術(shù)語(yǔ)“洗脫劑”指將分析物與色譜柱固定相分離的液體流動(dòng)相。分析物包括但不限于，一種或多種待測(cè)量的感興趣化合物。
[0050]本文所用的術(shù)語(yǔ)“直接地”是指確立蛋白(包括蛋白藥劑偶聯(lián)化合物)分子量的前后關(guān)系，包括測(cè)量完整的四元整體C1Uaternar ensemble),例如完整的實(shí)體,如抗體復(fù)合物的分子量。
[0051]本文所用的術(shù)語(yǔ)“間接地”是指通過以下方式測(cè)量蛋白(包括蛋白藥劑偶聯(lián)化合物)的分子量，測(cè)量組成四元整體的亞基，如抗體的輕鏈和重鏈的分子量，然后將這些分子量相加獲得完整實(shí)體的分子量。
[0052]“脫鹽”是指將蛋白(包括蛋白藥劑偶聯(lián)化合物)樣品與非揮發(fā)性鹽、賦形劑和/或表面活性劑分離。
[0053]“揮發(fā)性鹽”指在環(huán)境大氣壓下(I個(gè)大氣壓)能夠進(jìn)入氣相的鹽。揮發(fā)性鹽包括，例如，甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨。
[0054]“表面活性劑”包括，但不限于，基質(zhì)的非揮發(fā)性化合物。例如，表面活性劑包括非離子和兩性離子洗滌劑，如聚山梨醇酯20 ( “吐溫20”)和聚山梨醇酯80 ( “吐溫80”)。
[0055]“離液劑(chaotropic agent) ”指這樣一種化學(xué)物質(zhì),能夠使得蛋白間的或蛋白內(nèi)亞結(jié)構(gòu)間的氫鍵、范德華力和疏水作用不穩(wěn)定，并隨后導(dǎo)致變性。代表性的化合物包括，但不限于，鹽酸胍、尿素和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它化合物。
[0056]“賦形劑”包括例如糖、多元醇等化合物，例如，蔗糖、海藻糖和山梨醇。
[0057]“質(zhì)譜”(MS)是分析技術(shù)，用來測(cè)定帶電粒子的質(zhì)荷比。它可用于闡明蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0058]“液相色譜”或“LC”指分離混合物的方法?；旌衔锶芙庠诜Q為流動(dòng)相的液體中，流動(dòng)相攜帶混合物穿過稱為固定相的結(jié)構(gòu)。在尺寸排阻色譜(SEC)中，混合物的不同成分以不同速度流動(dòng)，從而導(dǎo)致它們被分開。分離基于在流動(dòng)相和固定相間的不同分配情況。
[0059]“尺寸排阻色譜”(SEC)指這樣一種層析方法，它根據(jù)分子的大小而不是其它分離參數(shù)如分子量或極性來分離分子。它被應(yīng)用于大分子如蛋白。在尺寸排阻色譜中，鹽主要用作流動(dòng)相。在某些實(shí)例中，流動(dòng)相中也可以存在有機(jī)或離液劑。固定相經(jīng)常是但不限于以下中的一種:交聯(lián)的聚苯乙烯、衍生化二氧化娃(derivitized silica)、丙烯酸、輕基丙烯酸、丙烯酸、瓊脂糖或聚輕乙基-天冬酰胺(polyhydroxyethyl-aspartamide)骨架。該樹脂的骨架可以用任何數(shù)量的種類作衍生，衍生試劑的選擇通常由以下需求確定，即，降低待分離的分析物和色譜柱之間不良的分子相互作用，而這種不良的分子相互作用用于基于混合物大小以外的其它分離參數(shù)的分離方法中。
[0060]本文所用的短語(yǔ)“質(zhì)譜相容的揮發(fā)性SEC緩沖液(mass spectrometry compatiblevolatile SEC buffer) ”指與MS使用相兼容的SEC流動(dòng)相。
[0061]本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指廣義的抗體，如本發(fā)明所屬領(lǐng)域中使用的那樣，尤其包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(如，雙特異性抗體)、和抗體片段?？贵w可以是鼠源的、人源的、人源化的、嵌合的、或衍生自其它物種。
[0062]本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”也指全長(zhǎng)的免疫球蛋白分子或全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠免疫特異性地結(jié)合感興趣靶標(biāo)或其一部分的抗原上，此類靶標(biāo)包括但不限于，腫瘤細(xì)胞或產(chǎn)生與自身免疫性疾病相關(guān)自身免疫抗體的細(xì)胞。本文中揭示的免疫球蛋白可以是任何類型(如，IgG、IgE、IgM、IgD、和IgA)、類別(如，IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類。
[0063]本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體片段”包括但不限于全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；Fc、半Fe (1/2FC)、二聚體(diabodies)、線性抗體、Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗-獨(dú)特型(ant1-1d)抗體、⑶R(互補(bǔ)決定區(qū))、ECD (胞外區(qū))、和任何上述的表位-結(jié)合片段，該片段能夠免疫特異性地結(jié)合到癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原，單鏈抗體分子、和抗體片段形成的多特異性抗體。
[0064]本文所用的“完整抗體”指包含VL和VH區(qū)的抗體，以及完全的輕鏈和重鏈恒定區(qū)并?！巴暾目贵w片段”包括通過至少一個(gè)非共價(jià)相互作用維持結(jié)合的全長(zhǎng)抗體的一部分。
[0065]就抗體而言，術(shù)語(yǔ)“鏈間二硫鍵”是指在兩條重鏈間的或重鏈和輕鏈間的二硫鍵。
[0066]就抗體而言，術(shù)語(yǔ)“鏈內(nèi)二硫鍵”是指由同一多肽鏈上的2個(gè)半胱氨酸殘基形成的~二硫鍵。
[0067]術(shù)語(yǔ)“鏈間硫醇”指抗體重鏈或輕鏈上的硫醇基團(tuán)，該基團(tuán)能夠參與鏈間二硫鍵的形成。
[0068]本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“mAb”指從實(shí)質(zhì)性同源的抗體組群中獲得的抗體，即，構(gòu)成該組群的各抗體是相同的，除了少量存在的可能自然發(fā)生的突變。單克隆抗體是高特異性的，能夠定向結(jié)合單一的抗原位點(diǎn)。而且，多克隆抗體制品包含定向于不同決定簇(表位)的不同抗體，每相比之下，單克隆抗體定向于抗原上的單一決定簇。
[0069]本文中的單克隆抗體尤其包括“嵌合”抗體，在“嵌合”抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或是同源的，而鏈的余下部分與衍生于另一特定物種或?qū)儆诹硪惶囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或是同源的，以及此類抗體的片段。
[0070]所述完整的抗體可能具有一個(gè)或更多個(gè)“效應(yīng)子功能(effector functions)”，“效應(yīng)子功能”指那些由抗體Fe區(qū)(天然序列的Fe區(qū)或氨基酸序列不同的Fe區(qū))產(chǎn)生的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的例子包括，但不限于，Clq結(jié)合，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性、Fe受體結(jié)合、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、吞噬作用、和細(xì)胞表面受體(如，B細(xì)胞受體，BCR)的下調(diào)。
[0071]所述抗體可以為抗體的融合蛋白，或其功能活性片段。例如，所述抗體可以通過共價(jià)鍵(如，肽鍵)，在N端或C端的任一端與并非該抗體的另一蛋白的氨基酸序列(或其部分，例如該蛋白的至少10、20或50個(gè)氨基酸的部分)融合。所述抗體或其片段可以在恒定區(qū)的N端共價(jià)地連接其它蛋白。
[0072]本文所用的術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”也可以指結(jié)合域-1g相融合，其中結(jié)合域可以為，例如，配體、受體的胞外域、肽、非自然產(chǎn)生的肽等，前提是結(jié)合域不包括抗體的可變域。與本文描述的蛋白和抗體相似，融合蛋白的Ig部分必需包含至少一個(gè)可還原的二硫鍵。在一方面，Ig (結(jié)合)域?yàn)榭贵w的Fe區(qū)。Ig (結(jié)合)域融合蛋白包括，依那西譜(etanercept),其是sTNFRII與Fe區(qū)的融合蛋白(美國(guó)專利號(hào)5，605，690);阿法賽特(alefac印t)，其是抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的LFA-3與Fe區(qū)的融合蛋白(美國(guó)專利號(hào)5，914，111);細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)和Fe區(qū)的融合蛋白(J.Exp.Med.181:1869(1995));白介素15和Fe區(qū)的融合蛋白(J.1mmunol.160:5742(1998)) ;VII 因子和 Fe 區(qū)的融合蛋白(Proc.Natl.Acad.Sc1.LISA98:12180 (2001));白介素 10 和 Fe 區(qū)的融合蛋白(J.1mmunol.154:5590 (1995))；白介素2和Fe區(qū)的融合蛋白(J.1mmunol.146:915 (1991)) ；CD40和Fe區(qū)的融合蛋白(Surgeryl32:149 (2002)) ;Flt_3 (fms-樣酪氨酸激酶)和抗體Fe區(qū)的融合蛋白(Acta.Haeraat0.95:218(1996)) ;0X40 和抗體 Fe 區(qū)的融合蛋白(J.Leu.Biol.72:522 (2002))；和與以下分子的融合蛋白:其它CD分子(如，CD2，CD30(TNFRSF8)，CD95 (Fas)，CD106 (VCAM-1)，CD137)、粘附分子(如，ALCAM(活化的白細(xì)胞粘附分子))、鈣粘素、ICAM((胞間粘附分子)_1、ICAM-2、ICAM-3)細(xì)胞因子受體(如，白介素_4R、白介素-5R、白介素-6R、白介素-9R、白介素-10R、白介素-12R、白介素-13Ra 1、白介素-13Ra 2、白介素-15R、白介素-21Ra )、趨化因子、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)信號(hào)分子(如，B7-H1、DR6(死亡受體6)、PD-1 (程序性死亡-1)、TRAIL Rl)、協(xié)同刺激分子(如，B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(可誘導(dǎo)協(xié)同刺激因子))、生長(zhǎng)因子(如，ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化誘導(dǎo)因子(如，B7-H3)、活化因子(如，NKG2D)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(如，gpl30)、BCMAJ TAC10
[0073]縮寫詞“MMAE” 指單甲基 E (monomethyl auristatin E)。
[0074]縮寫詞“MMAF”指朵纈氨酸-纈氨酸-朵拉異亮氨酸_朵拉脯氨酸_苯丙氨酸(doval ine-val ine-do Iai so I euine-do lapro ine-pheny lalanine),也指單甲基奧利司他汀F(monomethyl auristatin F)。
[0075]術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”意為能夠共價(jià)連接于抗體的任何部分，其具有如下功能:(i)提供可檢測(cè)的信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記物相互作用以改變由第一或第二標(biāo)記物提供的可檢測(cè)信號(hào)，如FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)增加與抗原或配體結(jié)合的親和性或使與抗原或配體的相互作用更加穩(wěn)定；(iv)通過電荷、疏水性、形狀或其它物理參數(shù)影響移動(dòng)性能，如，電泳移動(dòng)性能，或細(xì)胞-滲透性；或(V)提供捕獲部分，以調(diào)節(jié)配體親和性、抗體/抗原結(jié)合或離子絡(luò)合。
[0076]抗體可以與任何標(biāo)記物部分偶聯(lián)，該標(biāo)記物部分能夠通過半胱氨酸硫醇共價(jià)結(jié)合至抗體。對(duì)于診斷應(yīng)用，通?？捎每蓹z測(cè)部分標(biāo)記抗體。
[0077]“藥物”或“藥物部分”可以是任何細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制的或免疫調(diào)節(jié)的(如，免疫抑制)藥物。在許多實(shí)例中，所述藥物通過接頭(linker)偶聯(lián)在抗體上。例如，描述接頭的文獻(xiàn)有美國(guó)專利 7, 754，681,7, 375078,7, 829，531,7, 659，241,7, 851，437,7, 829，531、7，659，241,7, 498，298,7, 994，135,7, 964，567 和 7，964，567，所有這些文獻(xiàn)均出于所有目的全文引用在此。在一方面，該接頭是纈氨酸-瓜氨酸("Val-Cit〃或〃vc〃)。在另一方面，該接頭為馬來酰亞胺己?；?〃mc〃)。
[0078]I1.方法
[0079]以下將詳細(xì)參考某些實(shí)施方式。雖然結(jié)合列舉的實(shí)施方式描述本發(fā)明，但應(yīng)理解不應(yīng)將本發(fā)明限制于這些實(shí)施方式。相反地，本發(fā)明應(yīng)涵蓋所有的可替代的，變形的和等同的技術(shù)方案，這些技術(shù)方案包含在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0080]本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知曉與本文所述相似或等同的很多方法和材料，這些方法和材料能夠用于實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明并不僅限于所述的方法和材料。
[0081]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了測(cè)定蛋白藥劑偶聯(lián)化合物分子量的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟:(a)在揮發(fā)性鹽且不含非揮發(fā)性鹽中提供非共價(jià)結(jié)合且未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物；(b)將蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；和(C)通過質(zhì)譜直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。[0082]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供測(cè)定非共價(jià)結(jié)合的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物分子量的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟:(a)在揮發(fā)性鹽且不含非揮發(fā)性鹽中提供未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物；(b)將蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；和(C)通過質(zhì)譜直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。
[0083]在本文所述的一些方法中，所述方法還包括在所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的非變性條件下應(yīng)用分離介質(zhì)以實(shí)現(xiàn)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)的分離，由此所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物實(shí)質(zhì)上未變性。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法包括以下步驟:在蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的非變性條件下引入分離介質(zhì)以實(shí)現(xiàn)所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)的分離，由此所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物實(shí)質(zhì)上未變性。
[0084]在本文所述方法的一些實(shí)施方式中，所述方法包括從分離介質(zhì)上洗脫未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物。在某些實(shí)施方式中，所述非變性條件包括質(zhì)譜相容的揮發(fā)性SEC緩沖液。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽包括甲酸銨、乙酸銨或碳酸銨。在某些實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽為甲酸銨。在某些其它實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽為乙酸銨。在其它實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽為碳酸銨。在某些其它實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽為本文上述揮發(fā)性鹽的混合物。
[0085]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供本文上述的方法，其中所述基質(zhì)包括非揮發(fā)性的鹽、表面活性劑或緩沖液。
[0086]在本文上述方法的進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法包括通過去卷積離子強(qiáng)度定量測(cè)定蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的相對(duì)分布。在一些這類的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法包括定量測(cè)定蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的相對(duì)分布。在一些這類的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法包括使得本文所述實(shí)驗(yàn)的離子強(qiáng)度去卷積以定量測(cè)定蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的相對(duì)分布。
[0087]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物包括抗體藥物偶聯(lián)物。
[0088]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的基質(zhì)包括某種制劑。在某些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)為某種制劑。
[0089]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的分離介質(zhì)包括尺寸排阻色譜(SEC)。在某些實(shí)施方式中，所述分離介質(zhì)為尺寸排阻色譜(SEC)。在本文所述一些方法中，所述方法包括通過尺寸排阻色譜法分離本文上述蛋白藥劑偶聯(lián)物。
[0090]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的藥劑包括藥物、毒素、或標(biāo)記物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述藥劑為藥物。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，所述藥劑為毒素。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，所述藥劑為標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑為本文上述任何藥劑的組合。
[0091]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的SEC包括二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚輕乙基-天冬酰胺(polyhydroxyethyl-aspartamide)柱。在某些實(shí)施方式中，SEC包括二氧化硅柱。在某些其它實(shí)施方式中，SEC包括聚苯乙烯-二乙烯基苯柱。在某些其它實(shí)施方式中，SEC包括聚羥乙基-天冬酰胺柱。
[0092]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的非變性條件包括50°C的溫度。在某些實(shí)施方式中，非變性條件的溫度不高于50°C。在一些實(shí)施方式中，非變性條件的溫度為室溫。室溫包括，但不限于，20-24°C。
[0093]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的質(zhì)譜法在ES1-MS上操作。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的質(zhì)譜法在連接有其它設(shè)備，例如色譜儀或噴霧噴嘴以便將待分析樣品輸送至MS的質(zhì)譜儀上操作。
[0094]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的揮發(fā)性鹽的濃度為50至400mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為50mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為400mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、或400mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約400mM。在本文中，“約”指在用詞語(yǔ)“約”修飾的數(shù)值的10%范圍內(nèi)的某一數(shù)值。例如，約50mM包括45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 55mM。例如，約 400mM 包括 360、370、380、390、400、410、420、430、和440mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約300mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約200mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約100mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約100至約400mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約200至約400mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約300至約400mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約lOOmM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約200mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約300mM。在一些實(shí)施方式中，揮發(fā)性鹽的濃度為約50至約350mM。
[0095]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，洗脫的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物立即弓I入質(zhì)譜儀。
[0096]在本文上述方法的一些實(shí)施方式中，洗脫的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物連續(xù)引入質(zhì)譜儀。在某些實(shí)施方式中，所述分離介質(zhì)是在非變性條件下運(yùn)行的HIC色譜。在其它實(shí)施方式中，所述SEC是聚羥乙基-A柱。
[0097]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述SEC柱尺寸為0.1至7.8mm內(nèi)徑且100至300mm長(zhǎng)度。
[0098]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法包括步驟，使用去糖基化試劑(deglycosylating reagent)處理所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物。在某些實(shí)施方式中，所述去糖基化試劑為PNG酶F。在其它實(shí)施方式中，去糖基化試劑包括外切糖苷酶(exoglycosidase)促處理、內(nèi)切糖苷酶(endoglycosidase)處理或能在N-聚糖(N-glycan)的第I和第2N-乙酰葡糖胺殘基(N-acetylglucosamine residue)之間切割的酶處理。
[0099]在本文所述的一些實(shí)施方式中，所述外切糖苷酶促處理包括唾液酸酶(sialidase)或β -半乳糖苷酶(處理)。
[0100]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在N-聚糖的第I和第2Ν-乙酰葡糖胺殘基之間作切割的酶促處理包括Endo-Fl、F2或F3 (處理)。
[0101]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽的pH為5.5-7.0。在其它實(shí)施方式中，本文所述方法包括的步驟中所述揮發(fā)性鹽的pH為5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9或7.0。在本文上述方法的一些實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽的pH為6.0。在本文上述方法的一些實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽的pH為6.5。在本文上述方法的一些實(shí)施方式中，所述揮發(fā)性鹽的pH為7.0。
[0102]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法包括通過質(zhì)譜對(duì)未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物進(jìn)行定量。
[0103]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物包括重鏈或輕鏈抗體片段。在一些此類實(shí)施方式中，所述重鏈或輕鏈抗體片段還包括一個(gè)或多個(gè)藥物。
[0104]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述抗體藥物偶聯(lián)物的抗體是抗體片段。
[0105]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述抗體片段選自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、雙特異抗體、線形抗體或單鏈抗體分子。在本文所述的一些實(shí)施方式中，所述抗體選自抗-CD30、抗4040、抗-0019、抗-CD33或抗-CD70抗體。在其它實(shí)施方式中，所述抗體藥物偶聯(lián)物的抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體藥物偶聯(lián)物的抗體包括人源化的抗體。
[0106]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中,所述藥物為美登醇(maytansinoid)。在其它一些實(shí)施方式中，所述藥物為奧利司他汀。在某些實(shí)施方式中，所述藥物是MMAE。在一些實(shí)施方式中，所述藥物是MMAF。
[0107]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在7.0Ta以內(nèi)。在其它實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在25Da以內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在7.0、7.1、
7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、
9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,10.1,10.2,10.3,10.4,10.5,10.6,10.7、
10.8,10.9、11.0、11.1、11.2,11.3,11.4,11.5,11.6,11.7,11.8,11.9,12.0,12.1,12.2、
12.3,12.4,12.5,12.6,12.7,12.8,12.9,13.0,13.1,13.2,13.3,13.4,13.5,13.6,13.7、
13.8,13.9,14.0,14.1,14.2,14.3,14.4,14.5,14.6,14.7,14.8,14.9,15.0,15.1,15.2、
15.3,15.4,15.5,15.6,15.7,15.8,15.9,16.0,16.1,16.2,16.3,16.4,16.5,16.6,16.7、
16.8,16.9,17.0,17.1,17.2,17.3,17.4,17.5,17.6,17.7,17.8,17.9,18.0,18.1,18.2、
18.3,18.4,18.5,18.6,18.7,18.8,18.9,19.0,19.1,19.2,19.3,19.4,19.5,19.6,19.7、
19.8,19.9,20.0,20.1,20.2,20.3,20.4,20.5,20.6,20.7,20.8,20.9,21.0,21.1,21.2、
21.3,21.4,21.5,21.6,21.7,21.8,21.9,22.0,22.1,22.2,22.3,22.4,22.5,22.6,22.7、
22.8、22.9、23.0、23.1、2、23.3、23.4、23.5、23.6、23.7、23.8、23.9、24.0、24.K24.2、24.3、
24.4,24.5,24.6,24.7,24.8,24.9,25.0,25.1,25.2,25.3,25.4,25.5,25.6,25.7,25.8、或
25.9Da 以內(nèi)。
[0108]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在8.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在9.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在10.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在11.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在12.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在13.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在14.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在15.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在16.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在17.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在18.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在19.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在
20.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在21.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在22.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在23.0Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在24Da內(nèi)。在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在25Da內(nèi)。
[0109]在本文上述方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在理論值的IOOppm以內(nèi)。在其他實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在理論值的 80、90、100、110、120、或 130ppm 以內(nèi)。
[0110]本發(fā)明的上述方法用于分析蛋白藥劑偶聯(lián)物的天然完整分子量。本發(fā)明的上述方法也用于測(cè)定蛋白藥劑偶聯(lián)物的天然完整分子量。
[0111]本發(fā)明提出檢測(cè)非共價(jià)結(jié)合的蛋白藥劑偶聯(lián)物的分子量的方法，所述方法在揮發(fā)性鹽且不含非揮發(fā)性鹽中提供未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物；將蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；和，通過質(zhì)譜直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。
[0112]本發(fā)明提供的方法中將蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接檢測(cè)完整蛋白藥劑偶聯(lián)物的分子量。在一個(gè)此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的且在甲酸銨中。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的且在乙酸銨中。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的且在碳酸銨中。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，該抗體藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的且在碳酸銨中。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，該抗體藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的且在甲酸銨中。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，該抗體藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的且在乙酸銨中。
[0113]本發(fā)明提供的方法中蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接測(cè)量完整的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物的片段，其未變性的且在碳酸銨中。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物的片段，其未變性的且在甲酸銨中。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物的片段，其未變性的且在乙酸銨中。
[0114]本發(fā)明提供的方法中蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接測(cè)量完整的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是在甲酸銨中且所述藥劑是藥物。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是在乙酸銨中且所述藥劑是藥物。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是在碳酸銨中且所述藥劑是藥物。在任何此類實(shí)施方式中，中所述藥物包括MMAE或MMAF。
[0115]在相關(guān)實(shí)施方式中，文本描述的方法提供的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑軛合化合物，該抗體藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨中且所述藥劑是藥物。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在甲酸銨中且所述藥劑是藥物。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在乙酸銨中且所述藥劑是藥物。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述藥物包括，但不限于，MMAE或MMAF。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述藥物包括MMAE。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述藥物是MMAF。
[0116]本發(fā)明提供的方法中蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接測(cè)量完整的蛋白藥劑偶聯(lián)物的分子量。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在甲酸銨中且所述藥劑是毒素。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在碳酸銨中且所述藥劑是毒素。在其它此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在乙酸銨中且所述藥劑是毒素。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述藥劑是毒素。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述鹽濃度任選在50和400mM之間。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述藥劑是藥物。
[0117]本發(fā)明提供的方法中蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接測(cè)量完整的蛋白藥劑偶聯(lián)物的分子量。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的抗體藥劑偶聯(lián)化合物。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述鹽濃度在50和400mM之間。在一些此類實(shí)施方式中，所述藥劑是藥物。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。
[0118]在本文上述任何實(shí)施方式中，上述方法包括步驟:將偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；并直接測(cè)量完整抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。
[0119]本發(fā)明提供的方法中蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接測(cè)量完整的蛋白藥劑偶聯(lián)物的分子量。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的抗體藥劑偶聯(lián)化合物。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。在一些實(shí)施方式中，所述鹽濃度在50和400mM之間。在一些實(shí)施方式中，所述鹽濃度為200mM。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述藥劑是藥物。在其它實(shí)施方式中，所述緩沖液的PH在5.0和7.0之間。在任何此類實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述藥劑可以是藥物。
[0120]在本文中描述的所述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，其是未變性的且在甲酸銨中；鹽的濃度是200mM ;所述藥劑是藥物；且緩沖液的pH在5.0和7.0之間。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、或乙酸銨或甲
酸銨中。
[0121]在本發(fā)明的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，其是未變性的且在乙酸銨中。在一些實(shí)施方式中，鹽的濃度是200mM ;緩沖液pH在5.0和7.0之間；且所述藥劑是藥物。
[0122]在本文方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，其是未變性的；鹽的濃度是200mM ;所述藥劑是藥物；緩沖液pH是6.5。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、或乙酸銨或甲酸銨中。在一些實(shí)施方式中，所述藥劑包括藥物，其中所述藥物是本文中描述的藥物。
[0123]在本發(fā)明的一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)相分離。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物實(shí)質(zhì)上是未變性的，所述偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、或乙酸銨或甲酸銨中。
[0124]本發(fā)明提供的方法中一蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀。在進(jìn)一步的此類實(shí)施方式中，直接檢測(cè)完整的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在本文上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此上述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在甲酸銨中。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在碳酸銨中。在一些此類實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在乙酸銨中。在相關(guān)實(shí)施方式中，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述分離介質(zhì)是SEC。
[0125]在任何上述方法中，所述方法可以包括所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是非變性的，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨中。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在乙酸銨中。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在甲酸按中。
[0126]在任何上述方法中，所述方法可以包括所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是非變性的，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。在本文中描述的任何方法中，所述分離介質(zhì)可以包括SEC。
[0127]在上述方法的另一方面，上述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，是未變性的，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是SEC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0128]在所述方法的一方面，所述蛋白偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸按中。
[0129]在所述方法的一方面，所述蛋白偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述分離介質(zhì)是SEC，所述質(zhì)譜儀是ES1-MS。
[0130]在上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是SEC，所述偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，所述質(zhì)譜儀為ES1-MS，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸按中。
[0131]在上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是SEC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0132]在上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑軛合化合物，所述偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC，所述偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，所述質(zhì)譜儀為ES1-MS0在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0133]在本文中的任一方法中，所述方法可以包括直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量的步驟。在本文中的任一方法中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物可以存在于碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0134]在上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述質(zhì)譜儀為ES1-MS。在一些其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物持續(xù)引入質(zhì)譜儀。
[0135]在本文所述任一方法中，其中所述蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，所述偶聯(lián)物可以采用持續(xù)的方式引入質(zhì)譜儀。在本文所述任一方法中，其中所述蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，所述偶聯(lián)物可以持續(xù)引入。
[0136]在上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述質(zhì)譜儀為ES1-MS。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0137]在一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0138]在本文描述的任一方法中，所述質(zhì)譜儀可以包括ES1-MS。
[0139]在上述方法的另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，并且所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述質(zhì)譜儀是ES1-MS。
[0140]本發(fā)明提供的方法中，所述分離介質(zhì)是SEC，所述蛋白偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，所述質(zhì)譜儀是ES1-MS，直接檢測(cè)完整的抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量并定量測(cè)定所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述分離介質(zhì)是在非變性條件下的HIC。
[0141]在一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺(柱)，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。
[0142]在上述方法的一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述SEC柱是二氧化硅(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、乙酸銨或甲酸銨中。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述SEC包括聚苯乙烯-二乙烯基苯。
[0143]在本文中的任一方法中，所述抗體藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，所述方法可以進(jìn)一步地包括，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述SEC柱是聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0144]在本文中的任一方法中，所述抗體藥劑偶聯(lián)物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，所述方法可以進(jìn)一步地包括以下方面。在另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，其是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述SEC柱是聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0145]在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是任選去糖基化的，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨、甲酸銨或乙酸銨中。
[0146]在所述方法的另一方面，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，所述方法可以包括以下方面。在另一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是去糖基化的，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，其是未變性的。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨中，所述碳酸銨的濃度在50和400mM之間。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在乙酸銨中，所述乙酸銨的濃度在50和400mM之間。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在甲酸銨中，所述甲酸銨的濃度在50和400mM之間。
[0147]在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨中，所述碳酸銨的濃度在50和400mM之間。在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白藥劑偶聯(lián)物在乙酸銨中，所述乙酸銨的濃度在50和400mM之間。在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白藥劑偶聯(lián)物在甲酸銨中，所述甲酸銨的濃度在50和400mM之間。
[0148]在本文所述方法的另一方面，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，所述方法可以包括以下方面。在一方面，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在本文的任一方法中，所述方法提供的蛋白藥劑偶聯(lián)物在碳酸銨中，所述碳酸銨的濃度在50和400mM之間。在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白藥劑偶聯(lián)物在乙酸銨中，所述乙酸銨的濃度在50和400mM之間。在本文中的任一方法中，所述方法提供的所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在甲酸銨中，所述甲酸銨的濃度在50和400mM之間。
[0149]在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法中所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述抗體藥劑偶聯(lián)物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度在50和400mM之間的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度在50和400mM之間的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度在50和400mM之間的乙酸銨中，并且pH為6.5。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。
[0150]在本文中的任一方法中，本發(fā)明提供的方法可任選包括，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為50mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為50mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為50mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。
[0151 ] 在本文中的任一方法中，本發(fā)明提供的方法可任選包括，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為150mM的甲酸銨中，并且pH為6.5;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為150mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為150mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。
[0152]在本文中的任一方法中，本發(fā)明提供的方法可任選包括，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。
[0153]在本文中的任一方法中，本發(fā)明提供的方法可任選包括，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為400mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為400mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為400mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。
[0154]在本文方法的另一方面，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，并且所述質(zhì)譜儀是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，且是未變性的。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。
[0155]在本文方法的另一方面，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，并且所述質(zhì)譜儀是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物是未變性的，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此上述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，并且所述SEC柱是聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為 6.5。
[0156]在本文方法的另一方面，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，并且所述質(zhì)譜儀是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，且是未變性的，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此上述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，并且所述SEC柱是聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為6.5。[0157]在本文的一些方法中，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，并且所述SEC柱是聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為 6.5。
[0158]在本文方法的另一方面，所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)完整的所述抗體藥劑偶聯(lián)化合物的分子量，并且所述質(zhì)譜儀是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在本文方法的一方面，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是抗體藥劑偶聯(lián)化合物，所述藥劑為藥物，在基質(zhì)中的所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物非變性的條件下應(yīng)用分離介質(zhì)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此上述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的，所述分離介質(zhì)是SEC，并且所述SEC柱是聚羥乙基-天冬酰胺(柱)。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的甲酸銨中，并且pH為6.5 ;所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的碳酸銨中，并且pH為6.5 ;或，所述蛋白藥劑偶聯(lián)物在濃度為250mM的乙酸銨中，并且pH為
6.5o
[0159]在一些實(shí)施方式中，本文所述方法包括快速測(cè)定非共價(jià)結(jié)合的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的完整分子量。在一實(shí)施方式中，由重鏈(HC)和輕鏈(LC)組成的抗體藥劑偶聯(lián)化合物表現(xiàn)為復(fù)合體，該復(fù)合體通過還原抗體以及隨后將藥物偶聯(lián)在鏈間的半胱氨酸殘基獲得。本文中描述的方法可以包括采用天然脫鹽條件分析ADC的步驟，其中ADC的完整二價(jià)結(jié)構(gòu)得以維持。本發(fā)明的進(jìn)一步地實(shí)施方式包括隨后采用去溶劑化的和離子化的條件測(cè)定脫鹽ADC的分子量的步驟。在一些此類實(shí)施方式中，所述去溶劑化和離子化條件是標(biāo)準(zhǔn)的去溶劑化和離子化條件。
[0160]本文中描述的方法可以包括通過基于半-天然尺寸-尺寸排阻色譜(SEC)的脫鹽和分子量檢測(cè)方法分析半胱氨酸-連接的ADC。所述方法還可包括測(cè)量鏈間半胱氨酸-連接的ADC的完整分子量,并通過去卷積離子強(qiáng)度(deconvoluted ion intensity)定量測(cè)定藥物-連接種類的相對(duì)分布。本文描述的方法可以適用于ADC的高通量分子量檢測(cè)。
[0161]本文描述的方法可以包括ADC去糖基化的任選步驟。所述去糖基化步驟可以包括利用PNGase F或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它化合物。本文描述的方法可以包括消除聚糖異質(zhì)性(glycan heterogeneity)的步驟。在某些實(shí)施方式中,所述方法為各藥物負(fù)載的種類提供改進(jìn)的或提高的或更大的信號(hào)強(qiáng)度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法包括定量測(cè)定的步驟。因?yàn)镸S信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，本發(fā)明提供的方法中去糖基化能夠得到更好的分子量準(zhǔn)確性。
[0162]除了任選的去糖基化，本文描述的方法可以包括介質(zhì)分離步驟。所述介質(zhì)分離步驟包括不同的色譜技術(shù)，例如SEC或HIC。在該步驟中，ADC從緩沖體系交換至揮發(fā)性鹽，該揮發(fā)性鹽能夠使堿性氨基酸帶正電以供分子量檢測(cè)。在一些此類實(shí)施方式中，從ADC中去除非-揮發(fā)性鹽、表面活性劑和緩沖液。在另一些實(shí)施方式中，在非變性條件下采用SEC進(jìn)行所述色譜步驟，同時(shí)允許ADC的緩沖液交換成揮發(fā)性鹽。
[0163]本文上述方法可以包括質(zhì)譜分析步驟。在某些方面，MS步驟可以緊跟介質(zhì)分離步驟。在其它方面，在介質(zhì)分離步驟和MS步驟之間可以有間插步驟。然而在其它方面，介質(zhì)分離步驟后MS步驟可以連續(xù)進(jìn)行。在MS步驟中，測(cè)量ADC的分子量。此外，本文上述方法可以提供通過MS離子豐度檢測(cè)定量性藥物負(fù)載。在一方面，所述MS是利用TOF-MS、Q-TQF、FTICR、Orbitrap或高分辨率離子阱MS進(jìn)行。在該步驟中，使用高分辨率質(zhì)譜儀測(cè)量分子量且將多荷電(m/z)的數(shù)據(jù)去卷積成零電荷質(zhì)譜。依據(jù)去卷積譜的離子強(qiáng)度定量測(cè)定負(fù)載各藥物的種類，該去卷積譜是未處理原始數(shù)據(jù)的強(qiáng)度的積。通常將源于蛋白的ES1-MS原始數(shù)據(jù)可視化處理成一系列荷電離子，其中給定的一種分子種類可以具有數(shù)個(gè)與其相關(guān)的離子，且每個(gè)相關(guān)的離子在正電荷數(shù)目上有差異。原始數(shù)據(jù)的去卷積是指測(cè)定每個(gè)離子所攜帶的電荷數(shù)，并且將所有相關(guān)離子轉(zhuǎn)化為零電荷質(zhì)譜的過程，所述零電荷質(zhì)譜表示所分析種類的分子量。在原始數(shù)據(jù)中與去卷積質(zhì)譜中特定種類相關(guān)的各離子具有與其相關(guān)的強(qiáng)度或豐度測(cè)量值，因此，與特定種類相關(guān)的所有離子的豐度構(gòu)成了該種類在所分析樣品中的近似豐度。定量測(cè)定諸種類時(shí)，將樣品中特定種類的豐度與樣品中所有相關(guān)種類的豐度總和進(jìn)行比較，從而給出該特定種類的相對(duì)摩爾豐度的測(cè)量值。在某些實(shí)例中，以這種方式作定量測(cè)定假設(shè)所有種類具有大致相等的離子化效率。
[0164]III藥物代謝動(dòng)力學(xué)
[0165]為確立安全/毒性范圍和適宜的給藥方案，需要在哺乳動(dòng)物中監(jiān)測(cè)治療劑循環(huán)水平以供藥代動(dòng)力學(xué)(P)檢測(cè)，包括半衰期、清除率、曲線下面積(AUG)和分布體積(Welling, P.(1997)《藥代動(dòng)力學(xué)方法、數(shù)學(xué)與應(yīng)用》(PharmacokineticsProcesses, Mathematics, and Applications),第二版，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)(American ChemicalSociety),華盛頓，哥倫比亞特區(qū))。生物利用度是指所給予的藥物從所給予的劑型到達(dá)常規(guī)循環(huán)的程度，通常以給予劑量的百分比表示。化合物的半衰期是指通過排泄或生物轉(zhuǎn)化(代謝)除去該化合物峰值血漿濃度的50%所需要的時(shí)間。療效指數(shù)表示化合物在所需治療活性和不需要的毒副作用之間的選擇度。本發(fā)明方法得到的藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)值闡明了抗體和抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)的吸收、分布、代謝和清除(ADME)。
[0166]IV.藥物負(fù)載
[0167]可以通過本發(fā)明方法表征從偶聯(lián)反應(yīng)制備ADC中每個(gè)抗體的藥物平均數(shù)量。本發(fā)明的方法能夠測(cè)定ADC中每個(gè)抗體結(jié)合的藥物數(shù)量(負(fù)載)以及藥物部分在片段，例如重鏈和輕鏈上的分布。
[0168]V.抗體藥物偶聯(lián)物的施用
[0169]可以通過與待治療病癥相適合的任何途徑將ADC與生物源接觸或施用于生物源。通常經(jīng)胃腸外方式，例如輸注、皮下、肌肉、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外方式將ADC施用于動(dòng)物。
[0170]V1.適用于本文所述方法的藥物
[0171]用于偶聯(lián)到抗體上的示范性藥物包括細(xì)胞毒性藥物或藥劑，特別是那些用于癌癥治療的。此類藥物通常包括DNA破壞性的藥劑，抗-代謝物，天然產(chǎn)物和它們的類似物。細(xì)胞毒藥劑的示范性類別包括酶抑制劑，例如二氫葉酸還原酶抑制劑、胸苷酸(thymidylate)合成酶抑制劑、DNA嵌入劑、DNA裂開劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蒽環(huán)類藥物、長(zhǎng)春花藥物、絲裂霉素、博來霉素、細(xì)胞毒核苷類似物、蝶啶類藥物、二炔類(diynenes)、足葉草毒素、海兔毒素、美登木素生物堿、變異誘導(dǎo)劑和紫杉酚。示范性藥物部分包括但不限于:奧利司他汀(例如MMAF和MMAE)、甲氨喋呤(methotrexate)、甲喋呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、美法侖、環(huán)氧長(zhǎng)春堿、異長(zhǎng)春堿(leurosideine)、放線菌素、道諾霉素、阿霉素、絲裂霉素C、絲裂霉素A、美登木素生物堿、洋紅霉素、氨喋呤、他利霉素(tallysomycin)、足葉草毒素和足葉草毒素衍生物,例如依托泊苷或依托泊苷磷酸鹽、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、紫杉酚、泰素帝、維甲酸、酪酸、喜樹堿、卡里奇霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、烯二炔類(enediynes)和它們的衍生物及類似物。
[0172]ADC的藥物部分也能夠包括海兔毒素和它們的肽類似物和衍生物，奧利司他汀(美國(guó)專利號(hào)5，635，483、5，780，588)。海兔毒素和奧利司他汀已經(jīng)表現(xiàn)出能夠干擾微管動(dòng)力性質(zhì)、GTP水解以及核和細(xì)胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45 (12): 3580-3584)，并具有抗癌(美國(guó)專利號(hào)5，663，149)和抗真菌活性(Pettit 等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。在一些實(shí)施方式中，所述藥物是奧利司他汀，一種抗-微管蛋白藥劑。所述海兔毒素或奧利司他汀藥物部分可以通過肽藥物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端連接于抗體(W002/088172)。美國(guó)專利5，767，237和美國(guó)專利6，124，431公開了奧利司他汀E的變體。
[0173]MMAE和MMAF免疫偶聯(lián)物，它們的合成和結(jié)構(gòu)公布在美國(guó)專利號(hào)7，851，437、7，829，531,7, 659，241,7, 498，298,7, 994，135,7, 964，567，它們中每一個(gè)均出于所有目的全文引用在此目的。奧利司他汀包括，但不限于奧利司他汀E和其衍生物。AFP、AEB、AEVB、MMAF和MMAE是能用于本文中的奧利司他汀的實(shí)例。
[0174]VI1.藥物制劑
[0175]通常用藥學(xué)上可接受的胃腸外載體將治療用ADC的藥物制劑制成適合于胃腸外施用，例如，大丸劑、靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)注射，并制成單位劑量可注射形式。具有所需純度的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)任選與藥學(xué)上可接受的填充劑、運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(《雷明頓藥學(xué)科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences) (1980)第 16 版，0sol，A.編)混合成凍干的制劑或水性溶液。
[0176]可接受的填充劑、運(yùn)載體、賦形劑和穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度上對(duì)生物受體是無毒的，包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(如，十Λ烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁基或苯基乙醇、烷基苯甲酸酯類例如甲基或乙基苯甲酸酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚)；低分子量(少于10個(gè)殘基)的多肽；蛋白，如血清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸鹽、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括瓜爾豆膠和糊精；糖類如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；螯合劑如EDTA ;成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(如，Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑例如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇(PEG)。
[0177]VII1.去糖基化
[0178]采用任選的去糖基化步驟來降低N-聚糖的末端唾液酸和半乳糖殘基的不同程度所致的異質(zhì)性。通過外切糖苷酶酶處理(如，分別用唾液酸酶和β_半乳糖苷酶)或通過內(nèi)切糖苷酶處理，使用將被占用的Asn殘基上的N-聚糖移除的酶(如，PNGase-F)或在N-聚糖的第I和第2乙酰氨基葡萄糖殘基之間切割的酶(如，Endo-Fl、F2或F3)能夠降低N-聚糖末端異質(zhì)性。
[0179]在一方面，降低N-聚糖所致異質(zhì)性的最簡(jiǎn)單和最有效的方法是使用PNGase-F進(jìn)行消化。該去糖基化步驟是任選的，因?yàn)樵诰厶峭暾Ａ舻那闆r下所述測(cè)量仍然是可行的。只是會(huì)不必要地將MS譜搞復(fù)雜，且需要高端質(zhì)譜儀來進(jìn)行可重復(fù)的測(cè)量。
[0180]IX.色譜分析
[0181]在測(cè)量分子量前先移除蛋白樣品中的非揮發(fā)性鹽以及離子和非-離子表面活性齊U。在一個(gè)實(shí)施方式中，將ADC引入質(zhì)譜儀,該ADC不含非揮發(fā)性鹽。在另一實(shí)施方式中，將ADC弓丨入質(zhì)譜儀，該ADC實(shí)質(zhì)上不含非揮發(fā)性鹽。在還有另一實(shí)施方式中，將ADC弓丨入質(zhì)譜儀，該ADC不含除了，例如表面活性劑之外的非揮發(fā)性鹽。半胱氨酸連接的ADC脫鹽技術(shù)必須保持天然蛋白結(jié)構(gòu)的完整同時(shí)去除非離子性鹽和表面活性劑。能夠在MS相容緩沖體系中進(jìn)行脫鹽和保護(hù)天然結(jié)構(gòu)的色譜柱類型包括尺寸-排阻(SE)和HIC柱?？梢灶A(yù)期的是，也能使用SEC-類似型號(hào)的沒有標(biāo)明是SEC柱的那些色譜柱，例如HIC色譜。該柱將運(yùn)行在，例如，等度乙酸銨緩沖液中。該柱的作用方式是，阻止蛋白進(jìn)入色譜介質(zhì)的小孔同時(shí)允許非揮發(fā)性鹽進(jìn)入該色譜介質(zhì)的小孔，因此導(dǎo)致在流動(dòng)條件下蛋白被先洗脫而鹽被后洗脫。相對(duì)于蛋白移動(dòng)，非揮發(fā)性鹽的移動(dòng)得到延遲。
[0182]SEC色譜柱使用的色譜介質(zhì)通常由顆粒形式的二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺固定相構(gòu)成，顆粒尺寸在1.7至20微米，孔徑在60至2000埃，在一方面，孔徑為 60、80、100、120、150、200、300、500、1000、2000 或 4000A。在一方面，任何 SEC色譜柱填充材料均可使用，柱的尺寸可以是0.1至7.8mm內(nèi)徑和50至600_長(zhǎng)度。所述柱尺寸可以是 0.1,0.15、0.3、0.5、1、2.0、2.1、3.0、4.0、4.6 或 7.8mm。所述柱長(zhǎng)度可以是 50、100、150、200、250 或 300mm。
[0183]此類色譜柱能夠基于彼此在尺寸方面的巨大差異而從蛋白中移除非揮發(fā)性鹽和表面活性劑。具體地，小分子鹽和表面活性劑與色譜顆粒中的孔相互作用(如，進(jìn)入內(nèi)部)，導(dǎo)致這些粒子延遲通過色譜柱，而具有足夠尺寸的蛋白不與顆粒的孔結(jié)構(gòu)相互作用從而在非揮發(fā)性鹽和表面活性劑之前就很好地洗脫下來。脫鹽系統(tǒng)的另一方面是要選擇MS相容性SEC緩沖鹽和pH以及鹽濃度。緩沖鹽應(yīng)當(dāng)是揮發(fā)性的，以防止在MS入口的結(jié)晶和腐蝕。常規(guī)使用的揮發(fā)性MS緩沖鹽是甲酸銨/甲酸和乙酸銨/乙酸(如，酸/堿對(duì))。例如，可以使用PH7的乙酸銨沖洗色譜柱，并用乙酸下調(diào)pH至6.5。在一方面，所述鹽是乙酸銨。
[0184]鹽濃度在50和400mM之間。在另一方面，鹽濃度是200mM。在另一方面，鹽濃度是250mM。緩沖液的pH在5.0和7.0之間。在一方面，pH為從5.5至7.0。在另一方面，pH是6.5。然而在另一方面，pH是7.0。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能夠產(chǎn)生有用分子量數(shù)據(jù)的PH是可以預(yù)期的(例如，可以在pH7.5或8下獲得有用的分子量數(shù)據(jù))。
[0185]如果在不含有機(jī)溶劑和酸性離子配對(duì)試劑的情況下進(jìn)行分析，可以防止ADC的變性以及隨后的斷裂。在一方面，pH6.5下的200mM乙酸銨與聚羥乙基-A(polyhydroxyethyl-A)色譜柱聯(lián)用最去糖基IgGlmAb進(jìn)行脫鹽。
[0186]X.質(zhì)譜
[0187]在MS步驟中，將樣品加載到MS設(shè)備中。所述樣品包含蛋白藥劑偶聯(lián)化合物。使用酸或堿將所述樣品離子化，以分別用于正或負(fù)離子化MS。樣品以液滴的微小噴霧形式進(jìn)入源。使用熱干燥氣體將包含液滴的樣品去溶劑化(蒸發(fā))。液滴的尺寸減小到某一點(diǎn)，在該點(diǎn)由于靜電排斥作用，帶正電的蛋白分子引起液滴爆炸成更小的液滴。在一瞬間該過程重復(fù)很多次，直到具有真正氣相蛋白離子，該氣相蛋白離子隨后進(jìn)入質(zhì)譜儀來測(cè)定分子量。該過程通常稱為電噴射-離子化(ESI)。測(cè)量出分子離子的質(zhì)荷比(m/z)，并且通過供應(yīng)商的特定軟件進(jìn)一步處理(去卷積)該原始數(shù)據(jù)，得到感興趣的目標(biāo)物的零電荷分子量。使用MS研究藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，鑒別未知的蛋白或小分子以及鑒別發(fā)生在蛋白上的翻譯后修飾和降解。典型地 ESI 儀器包括 water Xevo Q-TOF、Agilent6510Q_T0F。
[0188]質(zhì)譜數(shù)據(jù)用來確定蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的蛋白分子量和從預(yù)期氨基酸序列確定的理論分子量的匹配在誤差范圍內(nèi)時(shí)，就能確定一級(jí)結(jié)構(gòu)。使用大多數(shù)市售可得的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀可以測(cè)定重組mAb的完整分子量。使用變性的溶劑系統(tǒng)的典型脫鹽過程經(jīng)常產(chǎn)生在理論值的50ppm(大約7.0Ta)以內(nèi)的實(shí)驗(yàn)性mAb分子量數(shù)據(jù)。在其它方面，該分子量數(shù)據(jù)在大約25Da以內(nèi)。在乙酸銨緩沖體系中使用SEC-MS進(jìn)行mAbs和ADC的天然脫鹽，會(huì)導(dǎo)致離子化效率較低，因?yàn)樵谥行跃彌_液PH下較少的堿性殘基會(huì)帶正電荷。較低強(qiáng)度的原始數(shù)據(jù)能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)測(cè)得的分子量和理論分子量間有較大偏離。然而，采用本文所述SEC-MS對(duì)脫鹽ADC獲得的分子量數(shù)據(jù)常產(chǎn)生在理論值的50ppm(約7.5Da)以內(nèi)的分子量數(shù)據(jù)，并且經(jīng)常小于lOOppm。分子量的高精度表明ADC是完全脫鹽的，因?yàn)榭赡芘c蛋白結(jié)合的所有普通鹽加合物都會(huì)將分子量增加至少18Da(銨離子的分子量)。測(cè)量具有非共價(jià)結(jié)合亞基的ADC分子量的常規(guī)方法包括通過離線技術(shù)進(jìn)行脫鹽，例如離心過濾、單用凝膠滲透盒和透析，然后對(duì)脫鹽ADC作納米噴霧MS。使用該方法，樣品的不完全去加合是非常普遍的，能夠?qū)е聹y(cè)得的分子量數(shù)據(jù)偏離理論值最多5000ppm。
[0189]在將揮發(fā)性鹽(例如乙酸銨)中的蛋白，例如ADC從SEC色譜柱上洗脫后，將蛋白引入質(zhì)譜儀，該質(zhì)譜儀使用市售可得的分析型ESI源，能夠?qū)?-1000微升/分鐘流動(dòng)的緩沖液中的蛋白去溶劑化和離子化。流速可以由操作者決定，并且可以取決于柱直徑。例如，0.1mm柱可以在I微升/分鐘的流速下操作，7.8mm柱可以在1000微升/分鐘的流速下操作。該流速能更快地測(cè)定分子量。毛細(xì)管電壓、氣體流速(去溶劑化和保護(hù))以及錐電壓(cone voltages)應(yīng)當(dāng)設(shè)在足以使ADC去溶劑化(如，蒸發(fā)溶劑)的數(shù)值，但是應(yīng)該足夠溫和以最大程度降低ADC源內(nèi)斷裂(in-source fragmentation)成連接藥物的重和輕鏈。當(dāng)ADC的天然-折疊結(jié)構(gòu)能維持，原始數(shù)據(jù)顯示的電荷分布(charge envelope)在4800和7000m/z之間。如果沒有維持天然結(jié)構(gòu)，則表現(xiàn)為電荷分布在2000和4000m/z之間的顯著的ADC群體。使用市售可得的去卷積軟件(如，安捷倫的MassHunter maximum entropydeconvolution)將ADC的MS測(cè)量值原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為零電荷質(zhì)譜，通過將特定連接藥物種類的離子豐度除以總離子豐度(所有連接藥物種類的豐度之和)來定量測(cè)定各連接藥物種類的豐度。通常利用飛行時(shí)間和四極桿飛行時(shí)間(分別為TOF和QT0F)儀器進(jìn)行完整蛋白的分子量測(cè)量，但是也可以利用傅立葉轉(zhuǎn)換離子回旋共振(FT-1CR)和軌道阱質(zhì)譜儀。在一方面，可以利用基質(zhì)輔助激光解析電離(MALDI)質(zhì)譜儀和高分辨率離子阱質(zhì)譜儀進(jìn)行該項(xiàng)工作。
[0190]與本發(fā)明相反，以往將色譜步驟收集的各組分分別引入MS。通過分析構(gòu)成每個(gè)組分的化合物和偶聯(lián)物的分子量，計(jì)算出所有收集峰的總分子量來決定整體分子量。如前所述，本發(fā)明提供了通過MS直接分析完整ADC的分子量的方法。
[0191]X1.電噴霧電離質(zhì)譜(ESI)
[0192]較高分子量化合物(如，抗體)的分子量可根據(jù)利用大多數(shù)質(zhì)譜儀不難確定的質(zhì)荷比(m/z)測(cè)得(典型的m/z范圍最高2000，最高3000，最高8000)。具體地說，電噴霧電離質(zhì)譜ES1-MS適用于荷電的、極性的或堿性化合物，并適用于分析多荷電化合物，具有非常優(yōu)異的檢測(cè)限。因此，可以使用ESI檢測(cè)和表征大的生物分子，例如分子量(MW)在150，OOO或更高的抗體-藥物偶聯(lián)物。
[0193]XI1.系統(tǒng)
[0194]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供設(shè)置成執(zhí)行本文所述方法的系統(tǒng)。在一些此類實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包括質(zhì)譜儀。
[0195]在某些實(shí)施方式中，所述質(zhì)譜儀設(shè)置成執(zhí)行本文所述的方法，包括檢測(cè)非共價(jià)結(jié)合的蛋白藥劑偶聯(lián)物分子量的器件。在某些實(shí)施方式中，所述器件包括質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步地包括用于在揮發(fā)性鹽中以及不含非揮發(fā)性鹽的情況下提供未變性蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的器件。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包括用于將蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀的器件。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包括用于通過質(zhì)譜儀直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物分子量的器件。
[0196]XII1.實(shí)施例
[0197]以下實(shí)施例用于解釋本發(fā)明而不造成對(duì)本發(fā)明的限制。
[0198]材料
[0199]抗體-藥物偶聯(lián)物-在CHO細(xì)胞中表達(dá)重組單克隆抗體并通過Shukia, A等((2007) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci848, 28-39)所述的標(biāo)準(zhǔn)程序純化。根據(jù) Sun, M.等((2005) Bioconjug Cheml6，1282-1290)所述的已有方法，將 mAb 的半胱氨酸殘基偶聯(lián)于Val-Cit單甲基奧利司他汀E(vcMMAE)或馬來酰亞胺己?；鶈渭谆鶌W利司他汀F (mcMMAF)。每IOOg抗體或ADC添加I μ I PNGase F (新英格蘭實(shí)驗(yàn)室,伊普斯維奇，馬薩諸塞州(New England Biolabs, Ipswich, MA)),并在37°C下孵育至少4小時(shí)來使抗體去糖基化。
[0200]實(shí)施例1
[0201]SEC-MS色譜-用聚羥乙基-A色譜柱(PolyLC，哥倫比亞市，馬里蘭州)分離mAb和ADC，該色譜柱維度為2.1 X 200mm并含有川(I \微孔的5微米顆粒。該色譜柱在用于非變性分子量分析的200mM乙酸銨、pH6.5-7.0或者在用于變性分子量分析(對(duì)照)的30%乙腈、0.2%甲酸中進(jìn)行平衡。運(yùn)行中的流速維持在0.lmL/min,mAb或ADC在3.5和4.5min之間洗脫出。mAb或ADC洗脫后，維持流速和緩沖液組成，總循環(huán)時(shí)間是IOmin每次運(yùn)行。
[0202]質(zhì)譜分析-在1000-8000m/z范圍內(nèi)的正離子ESI模式下，通過安捷倫6510QT0F(安捷倫公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)獲得mAb和ADC的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。干燥氣體的溫度是350°C，干燥氣體和噴灑氣體的流速和壓力分別是12L/hr和35psi。毛細(xì)管、碎裂器(fragmentor)和八極 RF (octupole RF)電壓分別是 5000、450 和 350。使用 MassHimter工作站軟件版本B.03.01中的最高熵去卷積算法將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為零電荷質(zhì)譜。
[0203]疏水相互作用色譜(HIC)-根據(jù)McDonagh, C.F.等((2006)Protein Eng DesSel 19，299-307)描述的方法，通過HIC分離vcMMAE和mcMMAF ADC。通過280nm的UV積分定量測(cè)定負(fù)載藥物種類。在圖6中，HIC數(shù)據(jù)用作從本文所述方法的完整分子量數(shù)據(jù)測(cè)得的ADC MR0-8相關(guān)百分比的比較。
[0204]除圖6外，表I顯示了各負(fù)載藥物種類的MR的離子豐度面積和HIC UV面積值。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)蛋白藥劑偶聯(lián)化合物分子量的方法，包括: (a)在揮發(fā)性鹽中且不含非揮發(fā)性鹽中提供非共價(jià)結(jié)合的且未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物； (b)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物引入質(zhì)譜儀；和 (C)通過質(zhì)譜直接確立所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括，在所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的非變性條件下應(yīng)用分離介質(zhì)以實(shí)現(xiàn)將所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物與基質(zhì)分離，由此所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物是實(shí)質(zhì)上未變性的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括，從所述分離介質(zhì)上洗脫所述未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述非變性條件包括質(zhì)譜相容的揮發(fā)性SEC緩沖液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述揮發(fā)性鹽包括甲酸銨、乙酸銨或碳酸銨。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)包括非揮發(fā)性的鹽、表面活性劑或緩沖液。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括，通過去卷積離子強(qiáng)度定量測(cè)定蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的相對(duì)分布。
8.如權(quán)利要求1所述的方`法，其特征在于，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物包括抗體藥物偶聯(lián)物。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)包括制劑。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述分離介質(zhì)包括尺寸排阻色譜(SEC)。
11.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述藥劑包括藥物、毒素、或標(biāo)記物。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述SEC包括二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羥乙基-天冬酰胺柱。
13.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述非變性條件包括不高于50°C的溫度。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜在ES1-MS上操作。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述揮發(fā)性鹽的濃度為50至400mM。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述揮發(fā)性鹽的濃度為50mM至1M。
17.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脫的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物立即引入質(zhì)譜儀。
18.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脫的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物連續(xù)引入質(zhì)譜儀。
19.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述分離介質(zhì)包括在非變性條件下運(yùn)行的HIC 柱。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述SEC包括聚羥乙基-A柱。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述SEC柱尺寸為0.1至7.8mm內(nèi)徑且100至300mm長(zhǎng)度。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括使用去糖基化試劑處理所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的步驟。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述去糖基化試劑包括PNG酶F。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述去糖基化試劑包括外切糖苷酶的酶處理、內(nèi)切糖苷酶處理或能夠在N-聚糖的第I和第2N-乙酰葡糖胺殘基之間切割的酶處理。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述外切糖苷酶的酶處理包括唾液酸酶或β -半乳糖苷酶。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述在N-聚糖的第I和第2Ν-乙酰葡糖胺殘基之間切割的酶處理包括Endo-Fl、F2或F3處理。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述揮發(fā)性鹽的pH為5.5-7.0。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括，通過質(zhì)譜對(duì)未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物進(jìn)行定量測(cè)定。
29.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述未變性的蛋白藥劑偶聯(lián)化合物包括重鏈或輕鏈抗體片段。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述重鏈或輕鏈抗體片段還包含一個(gè)或多個(gè)藥物。
31.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體藥物偶聯(lián)物的抗體包括抗體片段。`
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述抗體片段選自Fab、Fab’、F(ab’)2、FV片段、雙特異抗體、線形抗體或單鏈抗體分子。
33.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體選自抗-CD30、抗-CD40、抗-⑶19、抗-⑶33或抗-⑶70抗體。
34.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體藥物偶聯(lián)物的抗體是人源化的抗體。
35.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述藥物為美登醇。
36.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述藥物為奧利司他汀。
37.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述藥物是MMAE。
38.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述藥物是MMAF。
39.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在7.0Ta以內(nèi)。
40.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在25Da以內(nèi)。
41.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白藥劑偶聯(lián)化合物的分子量經(jīng)測(cè)量在理論值的IOOppm以內(nèi)。
42.一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)被設(shè)置為執(zhí)行權(quán)利要求1所述的方法。
43.如權(quán)利要求42所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括質(zhì)譜儀。
【文檔編號(hào)】G01N24/00GK103858003SQ201280047453
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】J·F·瓦利耶爾-道格拉斯, O·薩拉斯 申請(qǐng)人:西雅圖基因公司