用于檢測含核苷酸的核小體的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測和測量含特定核苷酸的單核小體和寡核小體及核小體的存在的方法以及所述測量用于檢測和診斷疾病的用途。本發(fā)明亦涉及鑒定核小體相關(guān)的核苷酸生物標(biāo)志物以用于檢測和診斷疾病的方法并涉及經(jīng)所述方法鑒定的生物標(biāo)志物?！緦＠f明】用于檢測含核苷酸的核小體的方法發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及用于檢測和測量含特定核苷酸的單核小體和寡核小體及核小體的存在的方法以及所述測量用于檢測和診斷疾病的用途。本發(fā)明亦涉及鑒定核小體相關(guān)的核苷酸生物標(biāo)志物以用于檢測和診斷疾病的方法并涉及經(jīng)所述方法鑒定的生物標(biāo)志物。[0002]發(fā)明背景人體包含數(shù)百種細(xì)胞類型。所有這些細(xì)胞類型含有相同的基因組，但具有廣泛不同的表型以及在體內(nèi)的不同功能。這樣的表型多樣性是因基因組在不同細(xì)胞類型中的差異表達(dá)所致。雖然不完全了解差異基因表達(dá)的調(diào)控，但是基本機(jī)制包括通過與所述基因有關(guān)的大量相互連接的表觀遺傳信號的基因調(diào)節(jié)，其包括將染色質(zhì)包裝為常染色質(zhì)或異染色質(zhì)的調(diào)控、核小體定位和核酸酶可接近位點的調(diào)控、DNA的甲基化、羥甲基化和其它修飾以及在其周圍纏繞有DNA的核小體的結(jié)構(gòu)上的變化。[0003]核小體為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單元以及由八個高度保守的核心組蛋白（包括各一對的組蛋白H2A、H2B、H3和H4)的蛋白質(zhì)復(fù)合物組成。在此復(fù)合物周圍纏繞有約146個堿基對的DNA。另一種組蛋白H1或H5充當(dāng)接頭并涉及染色質(zhì)致密化。DNA以常常被稱為類似于"繩珠"的結(jié)構(gòu)纏繞在連續(xù)的核小體周圍以及這形成開放或常染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)。在致密或異染色質(zhì)中，所述繩經(jīng)螺旋和超螺旋成閉合而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（Herranz和Esteller,2007)。[0004]核小體的結(jié)構(gòu)可通過組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM)和通過包含變體組蛋白來改變。組蛋白的PTM通常發(fā)生在核心組蛋白的尾部以及常見修飾包括賴氨酸殘基的乙?；⒓谆虮樵诘鞍谆约熬彼釟埢募谆徒z氨酸殘基的磷酸化及許多其它修飾。已知組蛋白修飾涉及基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)（Herranz和Esteller,2007)。核小體的結(jié)構(gòu)亦可通過包含備選的組蛋白同種型或變體來改變，所述同種型或變體為不同的基因產(chǎn)物或剪接產(chǎn)物并且具有不同的氨基酸序列。組蛋白變體可分為許多家族，其可再分成獨立的類型。大量組蛋白變體的核苷酸序列為已知的并且可公開得自例如國家人類基因組研究所NHGRI組蛋白數(shù)據(jù)庫（Marifio-Ramirez，L.,Levine,Κ.Μ.,Morales,Μ.,Zhang,S.,Moreland,R.Τ.,Baxevanis,A.D.,和Landsman,D.TheHistoneDatabase:anintegratedresourceforhistonesandhistonefold-containingproteins(組蛋白數(shù)據(jù)庫：含組蛋白和組蛋白折疊的蛋白質(zhì)的綜合資源）·第2011卷·（已提交）和http://genome.nhgri·nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank(NIH遺傳序列）數(shù)據(jù)庫、EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫和日本DNA數(shù)據(jù)庫（DDBJ)。[0005]成人中的正常細(xì)胞更新涉及每天通過細(xì)胞分裂產(chǎn)生約1011個細(xì)胞以及主要通過凋亡使類似數(shù)量的細(xì)胞死亡。在凋亡過程期間，染色質(zhì)分解成自細(xì)胞釋放的單核小體和寡核小體。據(jù)報道在正常情況下，在健康受試者中存在的循環(huán)核小體的水平低。在患有各種病況的受試者中發(fā)現(xiàn)水平升高，所述病況包括許多癌癥、自身免疫性疾病、炎性病況、中風(fēng)和心肌梗塞（Holdenreider&Stieber,2009)。[0006]單核小體和寡核小體可通過酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)和已報道的數(shù)種方法(Salgame等，1997;Holdenrieder等，2001;vanNieuwenhuijze等，2003)來檢測。這些測足法通常使用抗-組蛋白抗體（例如抗-H2B、抗-H3或抗-HI、H2A、H2B、H3和H4)作為捕獲抗體以及抗-DNA或抗-H2A-H2B-DNA復(fù)合物抗體作為檢測抗體。使用這些測定法，本領(lǐng)域的工作者報道，血清中的核小體水平要高于（高達(dá)一個數(shù)量級）取自相同患者的血漿樣品中的核小體水平。對于通過PCR進(jìn)行的DNA的血清和血漿測量而言，這亦為真實的(Holdenrieder等，2005)。對此的原因未知，但作者推測其可能是因凝血過程期間DNA的額外釋放所致。然而，我們已發(fā)現(xiàn)的是，現(xiàn)有技術(shù)的核小體ELISA測定法的結(jié)果并非彼此一致。此外，盡管據(jù)報道血清或血漿中的大部分循環(huán)DNA作為單核小體和寡核小體存在(Holdenrieder等，2001)，但血清或血漿中核小體和DNA的測量水平并未完全一致。已報道循環(huán)無細(xì)胞核小體水平的ELISA結(jié)果和如通過實時PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）所測量的循環(huán)DNA水平之間的相關(guān)系數(shù)，在血清中為r=0.531而在血楽中為r=0.350(Holdenrieder等，2005)。[0007]現(xiàn)行核小體ELISA法用于細(xì)胞培養(yǎng)，主要作為檢測凋亡的方法（Salgame等，1997;Holdenrieder等，2001;vanNieuwenhuijze等，2003)，以及亦用于測量血清和血楽中的循環(huán)無細(xì)胞核小體（Holdenrieder等，2001)。已在許多不同癌癥的研究中通過ELISA法測量通過使細(xì)胞死亡釋放到循環(huán)中的無細(xì)胞血清和血漿核小體水平，以評價其作為潛在生物標(biāo)志物的用途（Holdenrieder等，2001)。據(jù)報道在大部分但并非全部研究的癌癥中，平均循環(huán)核小體水平高。在肺癌受試者中觀察到最高的循環(huán)核小體水平。在前列腺癌中觀察到最低水平，其在健康受試者的正常范圍之內(nèi)。然而，據(jù)報道患有惡性腫瘤的患者具有顯著不同的血清核小體濃度并且發(fā)現(xiàn)患有晚期腫瘤疾病的某些患者具有低的循環(huán)核小體水平，其在對健康受試者測得的范圍之內(nèi)（Holdenrieder等，2001)。因此以及各種非癌原因引起的升高的核小體水平，在臨床上未將循環(huán)核小體水平用作癌癥的生物標(biāo)志物（Holdenrieder和Stieber，2009)。出人意料的是，我們已顯示通過現(xiàn)有技術(shù)的這些核小體ELISA法所測得其循環(huán)核小體水平低或不可檢出的許多癌癥受試者，事實上具有升高的循環(huán)無細(xì)胞核小體水平。我們已設(shè)計并證實用于核小體的新型ELISA法，其檢測出經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)的ELISA法未檢出的核小體。[0008]用于檢測組蛋白PTM的ELISA法亦為本領(lǐng)域已知。將用于游離組蛋白（未與核小體復(fù)合物中的其它組蛋白和DNA結(jié)合）中的PTM檢測的ELISA法用以檢測提取（通常通過酸提?。┳约?xì)胞裂解物的組蛋白中的PTM。已報道用于檢測循環(huán)無細(xì)胞核小體中的PTM的免疫測定法（Bawden等，2005)。最近已報道用于ELISA檢測直接包被至微量滴定孔的純化核小體中的組蛋白PTM的方法（Dai等，2011)。在此方法中，將通過消化來自培養(yǎng)細(xì)胞的染色質(zhì)提取物獲得的核小體直接包被至微量滴定孔并與抗-PTM抗體反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，此方法需要相對純的核小體樣品并且不適于在諸如血液、血漿或血清等復(fù)雜生物介質(zhì)中直接測量組蛋白PTM。[0009]已報道用于在血漿中檢測與特定DNA序列相關(guān)的無細(xì)胞核小體中的組蛋白PTM(H3K9Me，在賴氨酸殘基K9處單甲基化的組蛋白H3)的改良的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP)法。據(jù)報道序列特異性組蛋白甲基化的水平與循環(huán)核小體的濃度無關(guān)（Deligezer等，2008)。[0010]已知組蛋白變體（亦稱為組蛋白同種型）為基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)物（Herranz和Esteller，2007)。已使用多種技術(shù)在體內(nèi)和體外研究組蛋白變體，所述技術(shù)包括編碼特定變體的基因的敲減研究（例如使用RNAi敲減）、染色質(zhì)免疫沉淀、氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記和定星質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡（Whittle#,2008;Boulard#,2010;Sporn等，2009;Kapoor等，2010;Zee等，2010;Hua等，2008)。toon]已報道在手術(shù)中或通過活檢移取自診斷為肺癌、乳腺癌和黑素瘤的受試者的組織樣品中組蛋白變體表達(dá)的免疫組織化學(xué)研究。這些免疫組織化學(xué)研究報道，切除的癌組織樣品中的組蛋白巨H2A(mH2A)和H2AZ變體的染色在這些癌癥中可具有預(yù)后應(yīng)用（Sporn等，2009,Hua等，2008,Kapoor等，2010)。免疫組織化學(xué)法用于臨床用途的一個缺點為，組織樣品收集為侵入性的，其涉及手術(shù)或活檢。免疫組織化學(xué)法的另一個缺點為，其不適于早期診斷或篩查診斷，因為所述疾病的合理預(yù)期通常必須早已存在于進(jìn)行活檢或組織切除之前。微創(chuàng)性血液ELISA測試適于更大范圍的應(yīng)用并且將克服這些缺點和對患者而言為更優(yōu)選的，以及對醫(yī)療保健提供者而言為更快、更低成本和更高通量的。[0012]然而，未曾在血液或其它介質(zhì)中測量無細(xì)胞核小體中的無細(xì)胞組蛋白變體。未曾報道對血液的無細(xì)胞核小體中組蛋白變體存在或不存在的研究。目前沒有用于檢測或測量完整無細(xì)胞核小體中組蛋白變體的方法，并且沒有任何這類測量未被提出或考慮。[0013]除通過核小體位置和核小體結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的表觀遺傳信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（根據(jù)組成型組蛋白變體和PTM結(jié)構(gòu)二者）之外，細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控亦通過對DNA核苷酸的修飾來介導(dǎo)，其包括DNA的胞嘧啶甲基化狀態(tài)。本領(lǐng)域已知的是，在某些時候，DNA可在胞嘧啶核苷酸的5位處甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。據(jù)報道呈5-甲基胞嘧啶形式的甲基化DNA出現(xiàn)在DNA序列中這樣的位置，此處胞嘧啶核苷酸出現(xiàn)在鳥嘌呤核苷酸之后。這些位置簡稱為"CpG"。據(jù)報道在脊椎動物中有超過70%的CpG位置為甲基化的（Pennings等，2005)。含有高比例CpG位點的基因組區(qū)常常稱為"CpG島"，以及約60%的人基因啟動子序列與這樣的CpG島相關(guān)（Rodriguez-Paredes和Esteller,2011)。在活躍的基因中，這些CpG島一般為低甲基化的?；騿幼有蛄械募谆c穩(wěn)定基因失活相關(guān)。DNA甲基化亦通常出現(xiàn)在重復(fù)元件中，包括Alu重復(fù)元件和長的散在核苷酸元件（Herranz和Estellar,2007;Allen等，2004)。[0014]癌癥中涉及DNA甲基化早已在1983年報道（Feinberg和Vogelstein,1983)。在癌細(xì)胞中觀察到的DNA甲基化模式不同于健康細(xì)胞中的DNA甲基化模式。相對于健康細(xì)胞，重復(fù)元件（尤其在著絲粒區(qū)周圍）在癌細(xì)胞中報道為低甲基化的，而特定基因的啟動子在癌癥中報道為超甲基化的。據(jù)報道這兩個作用的平衡導(dǎo)致癌細(xì)胞中的總體DNA低甲基化(Rodriguez-Paredes;Esteller,2007)。[0015]某些特定基因的超甲基化可用作癌癥的診斷性生物標(biāo)志物。例如報道用于通過PCR擴(kuò)增提取自血漿的DNA來檢測S印tin9基因的超甲基化的方法，據(jù)報道檢出72%的結(jié)腸癌，假陽性率10%(Grutzmann等，2008)。特定基因或基因座的DNA甲基化狀態(tài)通常通過將除5-甲基胞嘧啶之外的胞嘧啶選擇性亞硫酸氫鹽脫氨基成尿嘧啶來檢測，其導(dǎo)致可通過測序或其它方式來檢測的一級DNA序列變化（Allen等，2004)。[0016]總體DNA低甲基化為癌細(xì)胞的標(biāo)志（Estellar2007和Hervouet等，2010)?？墒褂妹庖呓M織化學(xué)（IHC)技術(shù)在細(xì)胞中研究總體DNA甲基化。或者自細(xì)胞中提取DNA用于分析。已報道用于檢測提取自細(xì)胞或其它介質(zhì)的DNA中的總體甲基化的許多方法，包括限制酶消化和最近鄰位序列分析、使用氯乙醛的熒光測定法、通過使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶連同氚標(biāo)記的S-腺苷蛋氨酸將所有CpG位點甲基化以計算未甲基化CpG的量的反向測定法以及將DNA消化成單核苷酸用于通過高效液相色譜、薄層色譜或液相色譜接著質(zhì)譜法的分析。這些方法的缺點為，其為勞動密集型和/或需要大量優(yōu)質(zhì)的提取DNA(Allen等2004)。雖然涉及亞硫酸氫鹽脫氨基的基于PCR的方法克服了對于大量DNA的需要，但其必須擴(kuò)增特定的基因組區(qū)（通常為重復(fù)序列），作為5-甲基胞嘧啶的總基因組含量的指示（Allen等2004)。用于總體DNA甲基化測量的這些方法已用于研究提取自各種細(xì)胞和組織的DNA。一些工作者已研究自全血的白細(xì)胞提取的DNA，因為這更易于以微創(chuàng)方式得到（Moore等，2008;TingHsiung等，2007;Mansour等，2010)。液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法被視為用于總體DNA甲基化測量的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但其昂貴，并且必須在分析之前將DNA消化成單核苷酸水平（Vasser等，2009)。[0017]用于估計總體DNA甲基化的新近方法包括對提取自組織的水解DNA進(jìn)行超高壓液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法（Zhang等，2011)以及甲基化特異性數(shù)字測序（MSDS)法（Ogoshi等2011)。已闡述用于總體DNA甲基化的經(jīng)典競爭性免疫測定法（以及用于總體5-羥甲基胞嘧啶甲基化的類似測定法）。在此方法中，向包被有5-甲基化胞苷綴合物的微量滴定孔中加入提取自細(xì)胞或組織的DNA，加入抗-5-甲基胞苷抗體，并將抗體結(jié)合在包被的5-甲基胞苷綴合物和提取樣品中的甲基化DNA之間的分配與已知標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以估計樣品中存在的總體DNA甲基化水平（CellBiolabs，2011)。在另一個免疫測定樣的方法中，將提取自組織或者提取自血漿或血清樣品的DNA包被至微量滴定孔并使用抗-5-甲基胞嘧啶抗體檢測甲基化DNA(Vasser，等，2009;Epigentek，2009)。這些方法的缺點為，其需要提取DNA，這涉及將所有核小體和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變性并從DNA中去除。因此其不能測量核小體結(jié)合的核苷酸并且不適于例如，在無DNA提取步驟的情況下直接測量諸如組織裂解物、血液、血漿或血清等生物流體中的總體DNA甲基化。[0018]亦已報道DNA中胞嘧啶堿基的5-羥甲基修飾。5-羥甲基化的作用還不完全清楚，但其似乎涉及基因調(diào)節(jié)（Stroud等，2011)。[0019]用于檢測總體DNA甲基化的現(xiàn)行方法涉及DNA的提取或純化并且不適于快速、高通量、低成本、微創(chuàng)的診斷法。類似地，對其它修飾堿基或稀有堿基（例如尿嘧啶、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤）的DNA分析僅可通過基本上純DNA或提取DNA的分析來研究。這類分析不能在諸如組織裂解物、血液、血漿或血清等復(fù)雜生物介質(zhì)中直接進(jìn)行。[0020]未曾在血液或任何其它介質(zhì)中測量含5-甲基胞嘧啶或任何其它特定核苷酸或修飾核苷酸的無細(xì)胞核小體。未曾報道對于血液中含特定核苷酸的無細(xì)胞核小體的存在或不存在的研究。未曾提出或考慮用于含特定核苷酸的無細(xì)胞核小體的測定法。目前沒有用于檢測或測量無細(xì)胞核小體相關(guān)核苷酸的方法。[0021]我們在此報道用于在無需提取的情況下直接估計生物樣品中的核小體相關(guān)核苷酸包括例如5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的簡單免疫測定法。出人意料的是，我們已顯示可在血樣中檢測核小體相關(guān)的核苷酸，在所述血樣中核小體經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)的ELISA法未檢出。[0022]發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供包含DNA堿基、核苷酸或核苷的無細(xì)胞核小體，其用作診斷癌癥、心肌病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)腸炎、慢性阻塞性肺病、克羅恩病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物。[0023]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供用于檢測樣品中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的方法，所述方法包括步驟：(i)使所述樣品與結(jié)合劑接觸，所述結(jié)合劑與所述DNA堿基、核苷酸或核苷結(jié)合；(ii)檢測或定量所述結(jié)合劑與樣品中所述DNA堿基、核苷酸或核苷的結(jié)合；和(iii)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的量度。[0024]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供用于檢測樣品中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的方法，所述方法包括步驟：(i)使所述樣品與第一結(jié)合劑接觸，所述第一結(jié)合劑與核小體結(jié)合；(ii)使所述核小體或樣品與第二結(jié)合劑接觸，所述第二結(jié)合劑與所述DNA堿基、核苷酸或核苷結(jié)合；(iii)檢測或定量所述第二結(jié)合劑與樣品中所述DNA堿基、核苷酸或核苷的結(jié)合；和(iv)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的量度。[0025]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供用于檢測樣品中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的方法，所述方法包括步驟：(i)使所述樣品與第一結(jié)合劑接觸，所述第一結(jié)合劑與所述DNA堿基、核苷酸或核苷結(jié)合；(ii)使所述核小體或樣品與第二結(jié)合劑接觸，所述第二結(jié)合劑與所述核小體結(jié)合；(iii)檢測或定量所述第二結(jié)合劑與樣品中核小體的結(jié)合；和(iv)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的量度。[0026]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于檢測細(xì)胞中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的方法，所述方法包括步驟：(i)自細(xì)胞中分離染色質(zhì)；(ii)消化、超聲處理或以其它方式分解所述染色質(zhì)以形成單核小體和/或寡核小體；和(iii)依照本發(fā)明的方法檢測或測量所述核小體中所述DNA堿基、核苷酸或核苷的存在。[0027]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于檢測或診斷動物或人受試者中的疾病狀態(tài)的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(ii)使用測得的核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷水平鑒定所述受試者的疾病狀態(tài)。[0028]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于評估動物或人受試者對藥物治療的適應(yīng)性的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(ii)使用測得的核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷水平作為選擇用于受試者的合適治療的參數(shù)。[0029]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于監(jiān)測動物或人受試者的治療的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；(ii)在一個或多個時機(jī)重復(fù)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(iii)使用在測得的核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷水平上的任何變化作為在受試者病況上的任何變化的參數(shù)。[0030]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供鑒定DNA堿基、核苷酸或核苷生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物用于檢測或診斷動物或人受試者中的疾病狀態(tài)，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；(ii)檢測或測量健康受試者或?qū)φ帐茉囌唧w液中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(iii)使用在患病和對照受試者中測得的水平之間的差異來鑒定DNA堿基、核苷酸或核酸是否可用作所述疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物。[0031]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供經(jīng)本發(fā)明的所述方法鑒定的生物標(biāo)志物。[0032]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于檢測核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷的試劑盒，所述試劑盒包含對所述DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分；或者所述DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異的配體或結(jié)合物，連同試劑盒的使用說明書。[0033]附圖簡述圖1.用于檢測在自MCF7細(xì)胞提取的稀釋到小牛血清的交聯(lián)消化染色質(zhì)中的無細(xì)胞核小體中的5-甲基胞嘧啶甲基化DNA的ELISA劑量反應(yīng)曲線。[0034]圖2.用于檢測在自A375細(xì)胞提取的稀釋到小牛血清的交聯(lián)消化染色質(zhì)中的無細(xì)胞核小體中的5-羥甲基胞嘧啶甲基化DNA的ELISA劑量反應(yīng)曲線。[0035]圖3.使用現(xiàn)有技術(shù)的核小體ELISA法對取自20個健康志愿者的血清和EDTA血漿樣品測得的核小體水平。[0036]圖4.對取自20個健康志愿者的血清和EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的組蛋白變體mH2Al.1水平。[0037]圖5.對取自20個健康志愿者的血清和EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的組蛋白變體mH2A2水平。[0038]圖6.對取自20個健康志愿者的血清和EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的組蛋白變體H2AZ水平。[0039]圖7.對取自20個健康志愿者的血清和EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的組蛋白修飾P_H2AX(Serl39)水平。[0040]圖8.使用本發(fā)明的ELISA對取自20個健康志愿者的血清和EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶甲基化DNA水平。[0041]圖9.使用本發(fā)明的ELISA對取自20個健康志愿者的血清樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-羥甲基胞嘧啶甲基化DNA水平。[0042]圖10.對取自3個結(jié)腸癌受試者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平。[0043]圖11.對取自13個肺癌受試者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平。[0044]圖12.對取自2個胰腺癌受試者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平。[0045]圖13.對取自1個口腔癌受試者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平。[0046]圖14.對取自4種不同癌癥疾病的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平，將其標(biāo)準(zhǔn)化為使用本發(fā)明的ELISA法測得的核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶甲基化DNA水平的比例。顯示通過*Holdenrieder等2001的方法產(chǎn)生的來自健康志愿者的含核小體樣品的標(biāo)準(zhǔn)化水平用于比較（未對此樣品測量mH2A2和5-羥甲基胞嘧啶）。[0047]圖15.使用本發(fā)明的ELISA法在取自健康志愿者的EDTA血漿、檸檬酸鹽血漿和肝素血漿樣品中測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶（5mc)、mH2Al.1、H2AZ和P-H2AX(Serl39)水平。[0048]圖16.使用本發(fā)明的ELISA法檢測的對取自3個健康志愿者和10個結(jié)腸癌受試者的血清樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平。[0049]圖17.對取自13個健康志愿者和55個癌癥患者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平。顯示定義為健康樣品的平均值加上平均值的一倍或兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的截止點。[0050]圖18.對取自10個健康志愿者和61個癌癥患者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平。顯示定義為健康樣品的平均值加上平均值的兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的截止點。[0051]圖19.對取自具有漸增的腫瘤大小、階段和疾病的結(jié)節(jié)形成的肺癌和結(jié)腸癌患者的EDTA血漿樣品測得的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平。[0052]圖20.使用本發(fā)明的ELISA法對取自10種不同癌癥疾病的EDTA血漿樣品測得的平均無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平，將其標(biāo)準(zhǔn)化為核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶（5mc)甲基化DNA水平的比例，并表示為相對于在11個健康受試者中發(fā)現(xiàn)的平均比例。[0053]圖21.使用本發(fā)明的ELISA法對取自2個心肌病患者、10個系統(tǒng)性紅斑狼瘡（狼瘡）患者、12個潰瘍性結(jié)腸炎患者、10個慢性阻塞性肺?。–0PD)患者、8個克羅恩病患者和10個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)患者測得的平均無細(xì)胞核小體相關(guān)的核苷酸和組蛋白類型的水平，將其標(biāo)準(zhǔn)化為核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶（5mc)甲基化DNA水平的比例，并表示為相對于在11個健康受試者中發(fā)現(xiàn)的平均比例。[0054]發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供包含DNA堿基、核苷酸或核苷的無細(xì)胞核小體，其用作診斷癌癥、心肌病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)腸炎、慢性阻塞性肺病、克羅恩病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物。[0055]在一個實施方案中，所述核小體為單核小體或寡核小體。[0056]根據(jù)可能提及的本發(fā)明的一個具體方面，提供DNA堿基、核苷酸或核苷作為診斷癌癥的生物標(biāo)志物的用途。[0057]在一個實施方案中，所述癌癥為膀胱、乳腺、結(jié)腸、宮頸、食道、腎、大腸、肺、口腔、卵巢、胰腺、前列腺、直腸、皮膚或胃的癌癥。在可能提及的一個具體實施方案中，所述癌癥為結(jié)腸、肺、口腔或胰腺的癌癥。[0058]我們已開發(fā)出用于檢測和測量含DNA堿基5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的核小體的ELISA試驗。我們使用抗-組蛋白抗體作為這些測定法的捕獲抗體，組合以適當(dāng)?shù)奶禺愋钥?核苷酸抗體。我們已使用所述測定法顯示，含特定核苷酸的核小體可在取自患癌受試者的血樣中測量并且對于用作無創(chuàng)或微創(chuàng)性生物標(biāo)志物而言為有辨別力的。在取自患病受試者的血清和血漿樣品中測得的核小體相關(guān)的DNA5-甲基胞嘧啶水平（相對于其它核小體表位的水平）不同于在來自健康受試者的樣品中測得的水平。此外，發(fā)現(xiàn)在取自患有不同疾病的受試者的樣品的核小體中測得的所述核苷酸水平的模式不同，由此疾病的差別診斷為可能的，尤其是在與對含不同組蛋白變體和組蛋白修飾的核小體測得的模式組合來檢測核小體相關(guān)的核苷酸模式的情況下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，將用于含不同或另外核苷酸的核小體的測試包含在內(nèi)應(yīng)有可能改進(jìn)使用這類模式差別診斷的辨別力。[0059]為了使用現(xiàn)有技術(shù)的方法研究在健康受試者中發(fā)現(xiàn)的核小體水平，我們測量了取自20個健康受試者的血清和血漿樣品中的核小體。現(xiàn)有技術(shù)的兩種方法均在取自健康受試者的血清樣品中得到高于血漿樣品中的信號。所述結(jié)果在圖3中顯示。這與血清中的核小體水平高于血楽的已公布數(shù)據(jù)相符合OHoldenrieder等，2001)。[0060]為了使用本發(fā)明的方法研究在健康受試者中發(fā)現(xiàn)的核小體水平，我們在20個健康受試者的血清和健康牛血清中測量了含修飾核苷酸5-甲基胞嘧啶的核小體。對于所有20個健康受試者，血清結(jié)果低或不可檢出。我們亦在取自20個健康受試者的E：DTA血楽樣品中測量了含修飾核苷酸5-甲基胞嘧啶的核小體，并且出人意料的是，觀察到較高的信號。通過本發(fā)明的方法在健康人EDTA血漿中測得高水平的含修飾核苷酸5-甲基胞嘧啶的無細(xì)胞核小體，而在健康人血清中測得較低水平，如圖8所示。圖4-9顯示對于其它核小體結(jié)構(gòu)獲得相似的結(jié)果。此研究結(jié)果為意想不到的并且與公布的結(jié)果（ffloldenrieder等，2001)和我們以現(xiàn)有技術(shù)的核小體ELISA法發(fā)現(xiàn)的結(jié)果不同。因此出人意料的是，對于存在于血清和EDTA血漿樣品中的核小體的相對水平，本發(fā)明的方法得到與現(xiàn)有技術(shù)的方法相反的結(jié)果。[0061]我們研究了核小體結(jié)構(gòu)在可收集的所有不同的常見類型的血漿中是否均為可檢測的。我們發(fā)現(xiàn)，在取自健康受試者的EDTA血漿中，通過本發(fā)明的方法可檢出高水平的無細(xì)胞核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶，其次是在取自健康受試者的檸檬酸鹽血漿中，但是在取自健康受試者的大部分（3/5)肝素血漿樣品中，在緩沖液或馬血清背景信號下核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶低或不可檢出。所述結(jié)果在圖15中顯示。概括地說，使用本發(fā)明的方法在取自健康受試者的大部分或全部EDTA血漿和檸檬酸鹽血漿樣品中發(fā)現(xiàn)相對高濃度的無細(xì)胞核小體，但其在取自健康受試者的大部分肝素血漿或血清樣品中低或不存在。因此清楚的是，樣品類型的正確選擇對不同應(yīng)用而言極其重要。[0062]我們已顯示，用于檢測含特定核苷酸結(jié)構(gòu)的無細(xì)胞核小體的樣品選擇涉及數(shù)個參數(shù)。這些參數(shù)包括在取自健康受試者的血清和肝素血漿樣品中通常存在的無細(xì)胞核小體的低水平、在取自健康受試者的EDTA和檸檬酸鹽血漿樣品中通常存在的較高水平、應(yīng)在自凝塊中分尚血清Z后通過添加EDΤΑ使含無細(xì)胞核小體的血清樣品穩(wěn)足的建議OHoldenreider等，2001)以及血清取樣方案。亦可使用其它穩(wěn)定劑（例如蛋白酶抑制劑）。在可能的情況下我們使用這樣的血清樣品，將其在靜脈穿刺（其后加入lOmMEDTA)的1小時內(nèi)離心并將所述樣品冷凍。[0063]對于臨床樣品的血樣類型的選擇應(yīng)基于對具體試驗而言最佳的臨床辨別力來進(jìn)行。根據(jù)我們通過本發(fā)明的方法在健康受試者的血清中始終低的核小體水平的發(fā)現(xiàn)結(jié)果，我們在取自患有癌癥的受試者的血清樣品中測量了含核苷酸5-甲基胞嘧啶的核小體。對于結(jié)腸癌樣品，如圖16所示觀察到高達(dá)100%的臨床靈敏性。[0064]我們亦在取自患有各種疾病的受試者的EDTA血漿樣品中測量了含核苷酸5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的無細(xì)胞核小體和其它核小體結(jié)構(gòu)的相對水平。無細(xì)胞核小體的水平在取自健康受試者和患病受試者二者的EDTA血漿樣品中均高并因此EDTA血漿樣品似乎不可能為用于患病和健康受試者的靈敏辨別物的最佳樣品選擇。然而，我們已顯示，就含不同核苷酸的核小體（以及其它核小體結(jié)構(gòu)）的相對水平而言，循環(huán)無細(xì)胞核小體的水平和組成在患病和健康個體中不同并且在不同疾病之間亦不同。因此我們首先同時報道(i)高水平的循環(huán)核小體存在于取自健康或患病受試者二者的全部或大部分EDTA血漿樣品中，但并非全部血樣類型均如此；和亦報道（ii)出人意料的是，仍然可通過基于存在于患病和健康受試者血漿中的核小體結(jié)構(gòu)的一種或多種相對類型的水平和結(jié)構(gòu)特征分析這些EDTA血漿核小體，來進(jìn)行疾病的檢測和疾病類型的辨別。[0065]我們在分別由55和62個癌癥受試者組成的兩個實驗中測量了取自健康受試者和患有各種癌癥類型的117個受試者的EDTA血漿中的無細(xì)胞核小體。使用針對核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶的本發(fā)明的方法，使用對于健康受試者的平均結(jié)果+平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差的截止水平，總計78%(91/117)的癌癥樣品正確鑒定為癌癥陽性。[0066]在這2個實驗的第1個中，我們測量了取自13個健康受試者和患有胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌（小細(xì)胞肺癌和各種非小細(xì)胞肺癌）、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和各種口腔癌（口腔、腭、咽和喉）的55個受試者的EDTA血漿中的無細(xì)胞核小體。來自健康受試者的全部13個樣品和癌癥患者均為核小體陽性的。然而，在取自癌癥受試者的樣品測得的水平要高于在來自健康受試者的樣品中發(fā)現(xiàn)的水平，并且所述結(jié)果顯示健康受試者和癌癥受試者為可辨別的。例如對于核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶，以0D方式計算為平均值土平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差的正常范圍為0-1.41。使用此截止值，所有13個健康樣品均為陰性的，而55個癌癥樣品中的30個為陽性的（55%的總體臨床靈敏性），包括38%(3/8)的胃癌樣品、60%(3/5)的大腸癌樣品、33%(1/3)的直腸癌樣品、33%(2/6)的小細(xì)胞肺癌樣品、64%(9/14)的非小細(xì)胞肺癌樣品、33%(2/6)的乳腺癌樣品、100%(1/1)的卵巢癌樣品、100%(1/1)的胰腺癌樣品、33%(2/6)的前列腺癌樣品、100%(1/1)的腎癌樣品和60%(3/5)的口腔癌樣品。所述結(jié)果在圖17中顯示。[0067]類似地，對于核小體相關(guān)的H2AZ測定的正常范圍為0-0.95。使用該0.95的截止水平，所有13個健康受試者對于升高的核小體H2AZ水平均為陰性的。相比之下，84%(46/55)的癌癥樣品發(fā)現(xiàn)對于升高的核小體H2AZ水平為陽性結(jié)果（84%的總體臨床靈敏性），包括100%(8/8)的胃癌樣品、100%(5/5)的大腸癌樣品、67%(2/3)的直腸癌樣品、83%(5/6)的小細(xì)胞肺癌樣品、79%(11/14)的非小細(xì)胞肺癌樣品、50%(3/6)的乳腺癌樣品、100%(1/1)的卵巢癌樣品、100%(1/1)的胰腺癌樣品、80%(4/5)的前列腺癌樣品、100%(1/1)的腎癌樣品和100%(5/5)的口腔癌樣品。[0068]在本發(fā)明的一個實施方案中，提供對照樣品并相對于所述對照樣品的結(jié)果確定所述測定法區(qū)分陽性或陰性結(jié)果的截止水平。這可以是等于或高于或低于對照樣品結(jié)果的水平的任何比例。低于此水平的患者結(jié)果視為陰性而高于此水平的患者結(jié)果視為陽性。亦可能存在非常接近截止水平的"灰區(qū)"范圍的患者結(jié)果，對其而言結(jié)論視為不確定的和/或應(yīng)重復(fù)所述測試。[0069]類似地，對于核小體相關(guān)的mH2Al.1測定，所述正常范圍為0-0.91。使用此截止值，所有13個健康樣品均為陰性的而64%(35/55)的癌癥樣品為陽性的。對于核小體相關(guān)的P-H2AX(Serl39)測定，所述正常范圍為0-1.08。使用此截止值，所有13個健康樣品均為陰性的而60%(33/55)的癌癥樣品為陽性的。因此某些核小體測定表現(xiàn)出比其它核小體測定更佳的臨床靈敏性。[0070]此外，有可能使用核小體結(jié)構(gòu)的模式來改進(jìn)本發(fā)明的臨床效用。這可例如通過將所述核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶測定的截止點降至平均值+1倍標(biāo)準(zhǔn)差來完成，其得到高達(dá)1.01的范圍。在此情況下假陰性的數(shù)量降為4,得到改善的93%(51/55)的臨床靈敏性，代價是使取自健康受試者的樣品在假陽性結(jié)果上從〇%增至23%(3/13)。所述結(jié)果在圖17中顯示。[0071]可審查5-甲基胞嘧啶相關(guān)的核小體或任何核小體發(fā)現(xiàn)為陽性的樣品的核小體結(jié)構(gòu)特征。所述核小體特征可用于區(qū)分健康和患病受試者，如圖20和21所述，其中患病受試者中各種核小體結(jié)構(gòu)的相對比例，相對于在健康受試者和患有其它非癌疾病的受試者中發(fā)現(xiàn)的相對比例表示。這顯示測試組中多種核小體結(jié)構(gòu)的研究可利于更好的臨床辨別。[0072]類似地，可通過組合來自多于一個測試的比率形式的數(shù)據(jù)來增加本發(fā)明的診斷特異性和/或靈敏性。例如，在2倍標(biāo)準(zhǔn)差截止水平下，使用核小體相關(guān)的P-H2AX:5-甲基胞嘧啶比率，將真陽性癌癥病例的檢出從僅使用核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶的55%(30/55)增加到67%(37/55)，同時對取自健康受試者的樣品保持100%(13/13)的陰性結(jié)果。[0073]我們測量了取自3個結(jié)腸癌患者、13個肺癌患者、2個胰腺癌患者和1個口腔癌患者的EDTA血漿樣品中含兩種不同核苷酸的循環(huán)無細(xì)胞核小體的水平，并將這些水平與來自20個健康受試者的血樣中存在的水平進(jìn)行比較，以及與如文獻(xiàn)（*Holdenreider等，2001)所述制備的自健康受試者的人工生產(chǎn)的血清核小體制品進(jìn)行比較。我們亦將觀察到的水平以標(biāo)準(zhǔn)化形式表示為含一種特定核苷酸的核小體水平的比率，并顯示所述比率或比率模式對一般癌癥的診斷和特殊癌癥類型的差別診斷二者而言均為有用的。我們亦研究了核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平是否隨疾病進(jìn)展而改變。我們觀察到的是，含5-甲基胞嘧啶的無細(xì)胞核小體的平均水平隨疾病的嚴(yán)重性而增加并且隨疾病逐漸擴(kuò)散至淋巴結(jié)而升高。這為測得的核小體為腫瘤相關(guān)提供了證據(jù)。[0074]我們亦使用現(xiàn)有技術(shù)的兩種核小體ELISA法測量了存在于這19個癌癥樣品中的核小體。如通過現(xiàn)有技術(shù)的核小體ELISA1和2所測定，發(fā)現(xiàn)研究的19個癌癥受試者的大部分具有低的EDTA血漿核小體水平。此結(jié)果說明了現(xiàn)有技術(shù)的測定法未用于常規(guī)臨床目的的一個原因。[0075]我們使用本發(fā)明的ELISA法在相同的19個樣品中測量含5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的核小體。出人意料的是，在全部19個樣品中均可檢出高水平的含5-甲基胞嘧啶的核小體。因此在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種新型的核小體ELISA法，其能夠檢測經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)的核小體測定法未檢出的核小體。[0076]我們還在相同的取自癌癥受試者的19個樣品以及通過文獻(xiàn)（*Holdenrieder等，2001)所述方法產(chǎn)生自健康受試者的核小體樣品中測量了含3種不同的組蛋白變體和組蛋白PTM的核小體水平。我們使用這些測定結(jié)果連同本文所述的核小體相關(guān)的核苷酸測定結(jié)果，作為存在于取自患有4種不同類型癌癥的受試者的生物流體和具有產(chǎn)生自健康受試者的核小體的生物流體中的一組不同的無細(xì)胞核小體。出人意料的是，在研究的4種類型的癌癥（肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和口腔癌）中發(fā)現(xiàn)的核小體模式均可區(qū)別于在產(chǎn)生自健康受試者的核小體樣品中發(fā)現(xiàn)的模式。此外，基于在受試者血液中可檢測的無細(xì)胞核小體的模式，不同的癌癥類型亦彼此區(qū)別。因此在本發(fā)明的一個實施方案中，提供用于通過對樣品測試一組不同的核小體表位來檢測或診斷疾病的存在、類型、復(fù)發(fā)或嚴(yán)重性或者評價最佳藥物或其它治療選項的方法，其由含不同DNA堿基或者一種或多種DNA堿基的組合以及一種或多種組蛋白變體和/或一種或多種組蛋白修飾的核小體的兩個或更多個測量和/或核小體自身的測量或者任何這些測量的任何組合或比率組成，作為受試者的健康或疾病狀態(tài)的指示物。[0077]類似地，我們使用本發(fā)明的ELISA法檢測各種癌癥和非癌疾病中在循環(huán)無細(xì)胞核小體的核苷酸和組蛋白結(jié)構(gòu)上的可變性，并將此與健康受試者中發(fā)現(xiàn)的核小體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)核小體存在于研究的所有癌癥和非癌疾病中并且發(fā)現(xiàn)其具有不同于健康受試者的特征。[0078]我們研究了取自2個心肌病患者、10個系統(tǒng)性紅斑狼瘡（狼瘡）患者、12個潰瘍性結(jié)腸炎患者、10個慢性阻塞性肺?。–0PD)患者、8個克羅恩病患者和10個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)患者的EDTA血漿樣品，并將測得的各種核小體結(jié)構(gòu)的水平標(biāo)準(zhǔn)化為平均核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平的比例，并將結(jié)果表示為相對于在11個健康受試者中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)所述疾病與核小體結(jié)構(gòu)特征相關(guān)，所述核小體結(jié)構(gòu)特征不同于健康或癌癥受試者中的結(jié)構(gòu)特征。因此核小體結(jié)構(gòu)特征可在多種非癌疾病中用作檢測、預(yù)后預(yù)測、監(jiān)測和治療效果預(yù)測的診斷性工具。所述結(jié)果在圖21中顯示。[0079]就檢測的核苷酸和組蛋白類型而言，我們亦使用本發(fā)明的ELISA法，對取自患有10種不同癌癥疾病的55個患者的EDTA血漿樣品研究了在無細(xì)胞核小體結(jié)構(gòu)上的可變性。將檢測的多種核小體結(jié)構(gòu)的水平標(biāo)準(zhǔn)化為核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶（5mc)甲基化DNA水平的比例，并相對于在11個健康受試者中發(fā)現(xiàn)的平均比例表示。我們發(fā)現(xiàn)了存在于全部受試者中的核小體以及在癌癥疾病、非癌疾病和健康受試者之間不同的核小體結(jié)構(gòu)特征。因此，核小體結(jié)構(gòu)特征可在癌癥和其它疾病中用作檢測、預(yù)后預(yù)測、監(jiān)測和治療效果預(yù)測的診斷性工具。所述結(jié)果在圖20和21中顯示。[0080]鑒于血清或血漿中的大部分循環(huán)DNA報道為作為單核小體和寡核小體存在(Holdenrieder等，2001)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本發(fā)明的方法亦可用于在包括血液、血清和血漿在內(nèi)的生物流體中直接檢測或測量無細(xì)胞甲基化DNA本身（作為核小體相關(guān)的DNA，包含例如5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶）。因此所用的本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)用于測量甲基化DNA的方法相比具有簡便性和快速的優(yōu)點，特別是因為不涉及或不需要DNA的提取。[0081]另外應(yīng)清楚的是，本發(fā)明可用于檢測或測量核小體中的任何核酸或DNA堿基或核酸類似物或衍生物。這類堿基包括但不限于腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、7,8-二氫-8氧代鳥嘌呤及其任何衍生物或類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，常見核苷酸（例如但不限于鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或腺嘌呤）將存在于全部或大部分核小體中以及使用針對常見核苷酸的抗體的本發(fā)明的方法將提供結(jié)合并檢測樣品中幾乎所有核小體的方法。因此一個實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測核小體本身的新方法，其中以確保檢出全部或大部分核小體的方式測量含常見核苷酸的核小體。[0082]在又一個實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測全部核小體相關(guān)的DNA的新方法，其中以確保檢出全部或大部分核小體結(jié)合DNA的方式測量含常見核苷酸的核小體。此外，兩個或更多個DNA堿基的測量將為測量所述DNA堿基的相對DNA含量的比率提供基礎(chǔ)。我們在圖10-14中闡述了對于樣品中5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的相對水平的所述比率。我們的數(shù)據(jù)顯示，可檢測的5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的相對水平在不同類型的癌癥中不同并且可用于區(qū)分所述癌癥。其它類似的比率在本領(lǐng)域中亦為有用的。例如，通過使用本發(fā)明測量作為總核小體結(jié)合DNA的度量的適當(dāng)DNA堿基并確定另一種堿基（例如5_甲基胞嘧啶）的相對水平，清楚的是本發(fā)明的方法可用于檢測包含任何特定堿基的DNA的比例（例如樣品中甲基化的DNA的百分比）。因此本發(fā)明的方法提供用于測量樣品中任何堿基的DNA含量百分比的簡便而快速的方法。所述方法可快速而簡便地用于多重樣品，例如血樣。本發(fā)明的方法可用于檢測和測量任何樣品中的核小體的DNA堿基，其中所述核小體存在于包括例如通過消化提取自細(xì)胞的染色質(zhì)而獲得的樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本文的術(shù)語核苷酸意圖包括但不限于嘌呤、嘧啶或任何其它核酸堿基及類似分子，含或不含相關(guān)的糖，磷酸化或未磷酸化，并包括其任何類似物、衍生物或模擬物。[0083]我們推斷，本發(fā)明的方法為用于檢測和測量含特定核苷酸的核小體相關(guān)DNA的成功方法，此方法亦可成功地用作檢測核小體本身的方法，與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比其為用于檢測核小體本身的更優(yōu)方法，此方法亦可成功用作直接檢測無細(xì)胞DNA本身和無細(xì)胞DNA本身的核苷酸組成的方法，與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比其為用于檢測核小體相關(guān)DNA及其核苷酸組成的更佳方法。所述方法為快速、低成本的并適用于復(fù)雜的生物介質(zhì)和流體。我們已證實本發(fā)明的方法可用于在血液中檢測核小體和含甲基化DNA的核小體，以及這可用作癌癥的生物標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，對于與升高的循環(huán)核小體相關(guān)的癌癥和其它疾病而言，出于大范圍診斷和疾病篩查的目的，存在于取自癌癥患者的血樣中的生物標(biāo)志物具有價值（Holdenrieder等，2001)。[0084]為了確證使用本發(fā)明的方法不會在健康受試者中發(fā)現(xiàn)升高水平的核小體，我們在20個健康受試者的血清和健康牛血清中測量了含核苷酸5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶的核小體。對于全部20個健康受試者，本發(fā)明的兩個ELISA測試的血清循環(huán)核小體結(jié)果均低或不可檢出。我們亦在取自相同的20個健康受試者的血漿樣品中進(jìn)行了類似測試并出人意料地觀察到較高的信號。此研究結(jié)果為意想不到的，并且與我們以現(xiàn)有技術(shù)的核小體ELISA法發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相當(dāng)不同。[0085]本發(fā)明已對許多癌癥和非癌疾病進(jìn)行測試，并發(fā)現(xiàn)其在測試的所有疾病的檢測中均為有效的。這包括通過現(xiàn)有技術(shù)的核小體ELISA測試不可檢出（Holdenrieder,2001)的前列腺癌病例的檢測。清楚的是，本發(fā)明對于全部或大部分癌癥的檢測而言為有效的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，可通過包含另外的核小體結(jié)構(gòu)測試和通過檢測存在的不同核小體結(jié)構(gòu)的比率來進(jìn)一步改進(jìn)本發(fā)明的臨床性能。[0086]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于檢測和測量樣品中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的雙抗體免疫計量或夾心免疫測定法。這方面的一個實施方案為包括以下步驟的免疫測定法：(i)使可能包含核小體的樣品與結(jié)合核小體的第一抗體或其它結(jié)合物接觸；(ii)使所述核小體或樣品與結(jié)合核苷酸的第二抗體或其它結(jié)合物接觸；(iii)檢測和/或定量所述第二抗體或其它結(jié)合物與樣品中核苷酸的結(jié)合；和(iv)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中核小體相關(guān)核苷酸的存在的量度。[0087]根據(jù)第二個實施方案，提供用于通過免疫計量免疫測定法檢測和測量樣品中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的方法，所述方法包括步驟：(i)使可能包含核小體的樣品與結(jié)合核苷酸的第一抗體或其它結(jié)合物接觸；(ii)使所述核小體或樣品與結(jié)合核小體的第二抗體或其它結(jié)合物接觸；(iii)檢測和/或定量所述第二抗體或其它結(jié)合物與樣品中核小體的結(jié)合；和(iv)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中核小體相關(guān)核苷酸的存在的量度。[0088]在本發(fā)明中可使用各種抗體或其它結(jié)合物作為與核小體結(jié)合的結(jié)合物。這些包括定向與存在于完整核小體中且不存在于游離組蛋白中的表位（例如在核小體的兩個組蛋白之間的連接處存在的表位）結(jié)合的結(jié)合物，以及亦包括定向于包括常見核小體蛋白、組蛋白或核酸表位在內(nèi)的任何核小體組分的結(jié)合物。[0089]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本發(fā)明所述的方法包括多種實施方案，其包括生物傳感器型測定法和例如由美國ForteBioIncorporated銷售的無標(biāo)記測定法類型。免疫計量免疫測定法使用抗體（或其它結(jié)合物）與分析物結(jié)合。檢測以此結(jié)合的分析物作為其在原始試樣中的水平或濃度的直接量度。相比之下，"競爭性"免疫測定法常常使用遠(yuǎn)更少量的抗體（或其它結(jié)合物）與一部分分析物結(jié)合，并將標(biāo)記的分析物（或分析物類似物）制品用于在結(jié)合和游離的分析物流分（使用樣品分析物）之間分配。測量結(jié)合的標(biāo)記分析物的量作為原始樣品中分析物濃度的間接量度。在改變的"競爭性"免疫測定設(shè)計中，使用標(biāo)記抗體，連同固相分析物（或分析物類似物）制品。使標(biāo)記抗體的結(jié)合在樣品分析物和固相分析物（或分析物類似物）之間分配。使用與固相分析物（或分析物類似物）制品結(jié)合的抗體的量作為所述樣品的分析物濃度的間接量度。[0090]根據(jù)本發(fā)明的第三個實施方案，提供用于通過無標(biāo)記免疫計量免疫測定法檢測和測量樣品中的核苷酸包括核小體相關(guān)核苷酸的方法，所述方法包括步驟：(i)使所述樣品與結(jié)合核苷酸的抗體或其它結(jié)合物接觸；(ii)檢測和/或定量所述抗體或其它結(jié)合物與樣品中核苷酸的結(jié)合；和(iii)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中核苷酸的存在的量度。[0091]根據(jù)本發(fā)明的第四個實施方案，提供用于通過競爭性免疫測定法檢測和測量樣品中的核苷酸包括核小體相關(guān)核苷酸的方法，所述方法包括步驟：(i)使所述樣品與結(jié)合核苷酸的抗體或其它結(jié)合物接觸；(ii)檢測和/或定量所述抗體或其它結(jié)合物與樣品中核苷酸的結(jié)合；和(iii)使用所述結(jié)合的存在或程度作為樣品中核苷酸的存在的量度。[0092]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本發(fā)明的這些免疫測定法直接測量核苷酸和核小體相關(guān)的核苷酸而沒有對DNA提取的任何需要。相比之下，現(xiàn)有技術(shù)的核苷酸免疫測定法在自樣品中提取DNA之后檢測（非核小體相關(guān)的）核苷酸。本發(fā)明的方法具有快速、簡便且適于在包括血液或其衍生物在內(nèi)的復(fù)雜生物樣品中直接測量的優(yōu)勢。[0093]根據(jù)本發(fā)明的第五個實施方案，提供用于檢測樣品中包含特定核苷酸的無細(xì)胞DNA的比例的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量樣品中無細(xì)胞DNA的水平；(ii)依照本發(fā)明的方法檢測或測量核小體相關(guān)核苷酸的水平；和(iii)使用所述兩個測量結(jié)果確定包含所述核苷酸的DNA的比例。[0094]根據(jù)本發(fā)明該方面的一個實施方案，使用本發(fā)明的方法測量樣品中的無細(xì)胞DNA水平和目標(biāo)核苷酸二者。在另一個實施方案中，目標(biāo)核苷酸為甲基化胞嘧啶核苷酸，并且包含所述核苷酸的DNA的比例提供總體DNA甲基化的量度。[0095]我們已顯示，取自受試者的血液中含核苷酸的核小體的檢測和測量可用作鑒定患有癌癥的受試者和區(qū)分其與健康受試者的診斷方法。此外我們已顯示，含一組不同核苷酸、組蛋白變體和組蛋白PTM的核小體的模式可用于區(qū)分不同的癌癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，這提供了癌癥血液測試，其將在受試者中檢測癌癥并可用于區(qū)分癌癥陽性受試者中的癌癥類型。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于通過測量或檢測體液中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的存在和/或水平或濃度，并使用所述檢出水平作為受試者的疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物來檢測或診斷疾病存在的方法，所述受試者的疾病狀態(tài)包括但不限于疾病的臨床診斷、疾病類型或亞型的差別診斷、或疾病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)、或者受試者對治療方案的易感性的診斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，用于診斷測試的體液包括但不限于血液、血清、血漿、尿、腦脊液和其它流體。在優(yōu)選的實施方案中，選為樣品的體液為血液、血清或血漿。體液中核小體相關(guān)核苷酸的測定反應(yīng)、水平、濃度或量可用絕對術(shù)語或相對術(shù)語表示，例如但不限于作為存在的總核小體水平的比例或者作為對含另一種核苷酸或組蛋白變體或組蛋白PTM的核小體水平的比率或者對總DNA水平的比率。[0096]在本發(fā)明的一個實施方案中，使用核小體相關(guān)的核苷酸測量作為用于檢測或診斷受試者的疾病狀態(tài)的一組診斷性測試或測量的成員，所述受試者的疾病狀態(tài)包括但不限于疾病的臨床診斷、疾病類型或亞型的差異診斷、或疾病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)、或者受試者對治療方案的易感性的診斷。[0097]鑒于全部或大部分循環(huán)無細(xì)胞DNA報道為作為核小體相關(guān)的DNA存在，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，可通過使用不含生物流體中的DNA提取步驟的本發(fā)明的直接核苷酸免疫測定法而非用于核小體相關(guān)核苷酸的免疫測定法（或除此之外），檢測或測量核苷酸本身來實現(xiàn)疾病狀態(tài)的診斷或檢測。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于通過測量或檢測體液中核苷酸的存在和/或水平或濃度，并使用所述測出水平作為受試者的疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物(或者單獨作為一組測試的成員）來檢測或診斷疾病存在的無提取核苷酸免疫測定法，所述受試者的疾病狀態(tài)包括但不限于疾病的臨床診斷、疾病類型或亞型的差別診斷、或疾病預(yù)后、或疾病復(fù)發(fā)、或者受試者對治療方案的易感性的診斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用于診斷測試的體液包括但不限于血液、血清、血漿、尿、腦脊液和其它流體。在優(yōu)選的實施方案中，選為樣品的體液為血液、血清或血漿。體液中的核苷酸的測定反應(yīng)、水平、濃度或量可用絕對術(shù)語或相對術(shù)語表示，例如但不限于作為存在的總核小體水平的比例或者作為對另一種核苷酸或組蛋白變體或組蛋白PTM水平的比率或者對總DNA水平的比率。[0098]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于檢測或測量細(xì)胞中含核苷酸的核小體的存在和/或水平的方法，所述方法包括步驟：(i)自細(xì)胞中分離染色質(zhì)；(ii)使所述染色質(zhì)分解以形成單核小體和/或寡核小體；和(iii)借助于本發(fā)明的免疫測定法檢測或測量所述單核小體和/或寡核小體中核苷酸的存在。[0099]用于自染色質(zhì)產(chǎn)生單核小體和/或寡核小體的方法為本領(lǐng)域所熟知并且包括酶消化和超聲處理（Dai等，2011)。在一個實施方案中，選擇用于通過所述方法檢測的核苷酸為存在于全部或大部分完整核小體中的常見核苷酸，提供用于檢測或測量核小體本身的方法。在另一個實施方案中，選擇用于通過所述方法檢測的核苷酸為存在于全部或大部分完整核小體中的常見核苷酸，提供用于檢測或測量核小體結(jié)合DNA的方法。[0100]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，所述檢測細(xì)胞或組織中的核小體相關(guān)核苷酸的方法具有優(yōu)于目前所用方法的優(yōu)點，所述目前使用的方法包括IHC，或者通過限制酶消化和最近鄰位序列分析、或通過使用氯乙醛的熒光測定法、或通過使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶連同氚標(biāo)記的S-腺苷蛋氨酸將所有CpG位點甲基化以計算未甲基化CpG的量的反相測定法、或通過將DNA消化成單核苷酸用于經(jīng)高效液相色譜法、薄層色譜法或液相色譜法接著質(zhì)譜法的分析來檢測提取自細(xì)胞的DNA中的核苷酸。特定的核小體相關(guān)核苷酸的水平、濃度或量可用絕對術(shù)語或相對術(shù)語表示，例如作為存在的總核小體的比例、或者作為對總核小體水平或者對含另一種核苷酸或組蛋白變體或組蛋白PTM的核小體水平的比率、或者對總DNA水平的比率。[0101]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，關(guān)于本發(fā)明的任何方面的術(shù)語抗體、結(jié)合物或配體，不限于但意圖其包括能夠與特定分子或?qū)嶓w結(jié)合的任何結(jié)合物，并且任何合適的結(jié)合物均可用于本發(fā)明的方法。亦應(yīng)清楚的是，術(shù)語核小體意圖包括單核小體和寡核小體以及可在流體介質(zhì)中分析的任何這類染色質(zhì)片段。[0102]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于檢測或測量核小體的試劑盒，所述試劑盒包含對所述核苷酸或其組成部分、或者所述核小體或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異的配體或結(jié)合物，連同依照本文所定義的任何方法的試劑盒使用說明書。[0103]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于檢測或測量含核苷酸核小體的試劑盒，所述試劑盒包含對所述核苷酸或其組成部分、或者所述核苷酸或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異的配體或結(jié)合物，連同依照本文所定義的任何方法的試劑盒使用說明書。[0104]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于鑒定核小體相關(guān)的核苷酸生物標(biāo)志物或者核苷酸生物標(biāo)志物以檢測或診斷動物或人中的疾病狀態(tài)的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量患病受試者體液中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的水平；(ii)檢測或測量對照受試者體液中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的水平；(iii)使用在患病和對照受試者中檢出的水平之間的差異鑒定核苷酸是否可用作所述疾病的生物標(biāo)志物。[0105]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，可在多個基礎(chǔ)上選擇對照受試者，其可包括例如已知未患疾病的受試者或者可以是患有不同疾病的受試者（例如用于差別診斷的研究）。[0106]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于鑒定核小體相關(guān)的核苷酸生物標(biāo)志物或者核苷酸生物標(biāo)志物以評價患病動物或人受試者的預(yù)后的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量患病受試者體液中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的水平；和(ii)將在患病受試者體液中測得的含核苷酸無細(xì)胞核小體的水平與受試者的疾病結(jié)果相關(guān)聯(lián)。[0107]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于鑒定核苷酸生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物用于為需要治療的患病動物或人受試者選擇治療方案，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量患病受試者體液中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的水平；和(ii)將在患病受試者體液中測得的含核苷酸無細(xì)胞核小體的水平與在所述受試者中觀察到的治療方案的功效相關(guān)聯(lián)。[0108]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于鑒定核小體相關(guān)的核苷酸生物標(biāo)志物或核苷酸生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物用于監(jiān)測患病動物或人受試者的治療，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量患病受試者體液中含核苷酸的無細(xì)胞核小體的水平；(ii)在所述受試者的疾病進(jìn)展期間在一個或多個時機(jī)下重復(fù)所述檢測或測量；和(iii)將在患病受試者體液中測得的含核苷酸無細(xì)胞核小體的水平與所述受試者中的疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。[0109]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供通過如本文所定義的方法鑒定的生物標(biāo)志物。[0110]本領(lǐng)域已知的是，可通過免疫測定法檢測作為一部分包含在含其它部分的復(fù)合物之內(nèi)的部分的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，可通過涉及在流體中核苷酸本身的直接免疫測定的程序，在包括血液、血漿、血清和尿在內(nèi)的生物流體中檢測含核苷酸的無細(xì)胞核小體。在此程序中，將利用指向存在于核苷酸上的表位的抗體的單抗體免疫測定法，或者利用指向存在于核苷酸上的兩個表位的兩個抗體的2-位點免疫測定法用以檢測核小體內(nèi)核苷酸的存在。因此在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過使用針對核苷酸的免疫測定法，在包括血液、血漿、血清和尿在內(nèi)的生物流體中直接檢測包含在核小體內(nèi)的核苷酸。[0111]因此在本發(fā)明的一個實施方案中，使用針對核苷酸的免疫測定法在包括血液、血漿、血清和尿在內(nèi)的生物流體中直接檢測核小體相關(guān)的核苷酸而無需預(yù)先提取。[0112]本發(fā)明的又一方面提供能夠與所述生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的配體或結(jié)合物，例如天然存在或化學(xué)合成的化合物。依照本發(fā)明的配體或結(jié)合物可包括能夠與所述生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的肽、抗體或其片段、或諸如人造抗體（plasticantibody)等合成配體、或者適體或寡核苷酸。所述抗體可以是能夠與所述生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段。依照本發(fā)明的配體可使用諸如發(fā)光標(biāo)志物、熒光標(biāo)志物、酶標(biāo)志物或放射性標(biāo)志物等可檢測標(biāo)志物標(biāo)記；備選地或者另外地，依照本發(fā)明的配體可使用例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素等親和標(biāo)簽或His(例如六-His)標(biāo)簽標(biāo)記?；蛘?，可使用例如ForteBioInc的無標(biāo)記技術(shù)來確定配體結(jié)合。[0113]依照本發(fā)明的生物傳感器可包含生物標(biāo)志物或者能夠與針對所述生物標(biāo)志物的抗體特異性結(jié)合的其結(jié)構(gòu)/形狀模擬物。亦提供包含如本文所述的配體或模擬物的陣列。[0114]本發(fā)明亦提供如本文所述的一種或多種配體、或本發(fā)明的生物傳感器、或本發(fā)明的陣列或本發(fā)明的試劑盒檢測和/或定量所述生物標(biāo)志物的用途，所述配體可以是天然存在或化學(xué)合成的，并且適當(dāng)?shù)貫殡?、抗體或其片段、適體或寡核苷酸。在這些用途中，可對如本文所定義的生物樣品進(jìn)行檢測和/或定量。[0115]提供用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的診斷或監(jiān)測試劑盒。這類試劑盒適當(dāng)?shù)匕糜跈z測和/或定量所述生物標(biāo)志物的依照本發(fā)明的配體、和/或如本文所述的生物傳感器和/或芯片、任選連同試劑盒的使用說明書。[0116]本發(fā)明的又一方面為用于檢測疾病狀態(tài)存在的試劑盒，所述試劑盒包含能夠檢測和/或定量一種或多種如本文所定義的生物標(biāo)志物的生物傳感器。[0117]用于檢測疾病存在的生物標(biāo)志物為用于發(fā)現(xiàn)延緩或停止所述病癥進(jìn)展的新靶標(biāo)和藥物分子的重要靶標(biāo)。鑒于生物標(biāo)志物的水平指示病癥和藥物反應(yīng)，所述生物標(biāo)志物對于在體外和/或體內(nèi)測定中鑒定新治療化合物而言為有用的。可在用于篩選調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物活性的化合物的方法中使用本發(fā)明的生物標(biāo)志物。[0118]因此，在本發(fā)明的又一方面，提供所述結(jié)合物或配體，根據(jù)本發(fā)明其可以是肽、抗體或其片段或者適體或寡核苷酸；或者依照本發(fā)明的生物傳感器；或依照本發(fā)明的陣列；或者依照本發(fā)明的試劑盒在鑒定能夠促進(jìn)和/或抑制所述生物標(biāo)志物生成的物質(zhì)中的用途。[0119]亦提供在受試者中鑒定能夠促進(jìn)或抑制所述生物標(biāo)志物生成的物質(zhì)的方法，所述方法包括向受試動物給予測試物質(zhì)，并檢測和/或定量存在于來自所述受試者的試樣中的生物標(biāo)志物水平。[0120]術(shù)語"生物標(biāo)志物"意指過程、事件或病況的特征性生物指示物或生物來源的指示物。生物標(biāo)志物可用于例如臨床篩查和預(yù)后評價等診斷方法以及用于監(jiān)測治療的結(jié)果，鑒定最可能響應(yīng)特定的治療性療法的患者，用于藥物篩選和開發(fā)。生物標(biāo)志物及其用途對鑒定新的藥物治療和發(fā)現(xiàn)藥物治療的新靶標(biāo)而言為有價值的。[0121]本文使用的術(shù)語"檢測"和"診斷"包括疾病狀態(tài)的鑒定、確認(rèn)和/或表征。依照本發(fā)明的檢測、監(jiān)測和診斷的方法對確認(rèn)疾病的存在、通過評價發(fā)作和進(jìn)展來監(jiān)測疾病的發(fā)展或者評價疾病的改善或消退而言為有用的。檢測、監(jiān)測和診斷的方法在用于評價臨床篩查、預(yù)后、療法選擇、治療益處評價（即用于藥物篩選和藥物開發(fā)）的方法中亦為有用的。[0122]通過建立正確的診斷、允許快速鑒定最適當(dāng)?shù)闹委煟ㄒ蚨鴾p少對有害藥物副作用的不必要暴露）并降低復(fù)發(fā)率，有效的診斷和監(jiān)測方法提供非常有力的"患者解決方案"，其具有改善預(yù)后的潛能。[0123]在一個實施方案中，所述生物標(biāo)志物自腫瘤的細(xì)胞中釋放。因此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于檢測腫瘤生長的方法，所述方法包括步驟（i)在生物樣品中測定與腫瘤的細(xì)胞相關(guān)或自其釋放的生物標(biāo)志物和（ii)證實所述標(biāo)志物的水平與所述腫瘤的大小、階段、侵占性或擴(kuò)散相關(guān)。[0124]已知的是，增加的細(xì)胞更新、細(xì)胞死亡和凋亡導(dǎo)致增加的無細(xì)胞核小體循環(huán)水平(Holdenrieder等，2001)。循環(huán)無細(xì)胞核小體水平為非特異性指示物并且存在于各種病況中，包括炎性疾病、大量的良性和惡性病況、自身免疫性疾病以及隨后的創(chuàng)傷或局部缺血(Holdenrieder等2001)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本發(fā)明應(yīng)具有在各種疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用，其中在受試者中發(fā)現(xiàn)循環(huán)核小體。這些包括但不限于創(chuàng)傷（例如重度傷或外科手術(shù)）、極限運動（例如跑馬拉松）、中風(fēng)和心臟病發(fā)作、膿毒癥或其它嚴(yán)重感染和子宮內(nèi)膜異位癥。我們已使用本發(fā)明的免疫測定法在各種所述疾?。òㄐ募〔　⑾到y(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性阻塞性肺病、克羅恩病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）中測量了核小體水平并研究其核苷酸和組蛋白結(jié)構(gòu)可變性，并將其與健康受試者的結(jié)果進(jìn)行比較。我們可在所有的這些疾病中檢測核小體并確定其相對結(jié)構(gòu)（以組蛋白和核苷酸組成的方式）。鑒于與現(xiàn)行核小體ELISA法相比，本發(fā)明的方法能夠檢測更大范圍的核小體，本發(fā)明的方法具有在大范圍的癌癥和非癌疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用。[0125]本發(fā)明的免疫測定法包括使用酶檢測法的免疫計量測定法（例如ELISA)、熒光標(biāo)記的免疫計量測定法、時間分辨熒光標(biāo)記的免疫計量測定法、化學(xué)發(fā)光免疫計量測定法、免疫比濁測定法、顆粒標(biāo)記的免疫計量測定法和免疫放射測定法及競爭性免疫測定法，所述競爭性免疫測定法包括使用各種標(biāo)記類型的標(biāo)記抗原和標(biāo)記抗體的競爭性免疫測定法，所述標(biāo)記類型包括放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、時間分辨熒光標(biāo)記和顆粒標(biāo)記。所有的所述免疫測定法均為本領(lǐng)域所熟知，參見例如Salgame等，1997和vanNieuwenhuijze等，2003。[0126]在一個實施方案中，所述生物樣品包括體液。例如，可用本發(fā)明的方法測試的生物樣品包括腦脊液（CSF)、全血、血清、血漿、月經(jīng)血、子宮內(nèi)膜液、尿、唾液或其它體液（糞便、淚液、滑液、痰）、呼吸氣體例如作為冷凝的呼吸氣體或自其的提取物或純化物、或其稀釋物。生物樣品亦包括來自活受試者或死后取得的樣品?？梢岳邕m當(dāng)稀釋或濃縮來制備樣品并以常規(guī)方式儲存。[0127]在一個實施方案中，在多個時機(jī)重復(fù)本發(fā)明的方法。此實施方案提供這樣的優(yōu)點，其允許在一段時間內(nèi)監(jiān)測檢測結(jié)果。這樣的安排提供監(jiān)測或評價疾病狀態(tài)的治療功效的益處。本發(fā)明的這類監(jiān)測方法可用于監(jiān)測發(fā)作、進(jìn)展、穩(wěn)定、改善、復(fù)發(fā)和/或緩解。[0128]因此，本發(fā)明亦提供在疑似患有疾病的受試者中監(jiān)測對疾病狀態(tài)的治療功效的方法，所述方法包括檢測和/或定量存在于來自所述受試者的生物樣品中的生物標(biāo)志物。在監(jiān)測方法中，可在兩個或更多個時機(jī)下取得試樣。所述方法可進(jìn)一步包括將存在于所述試樣中的一種或多種生物標(biāo)志物水平與一個或多個對照和/或與在更早（例如在治療開始之前）取自同一測試受試者和/或在治療的更早階段取自同一測試受試者的一個或多個先前試樣進(jìn)行比較。所述方法可包括在不同時機(jī)下獲得的試樣中檢測在一種或多種生物標(biāo)志物的性質(zhì)或量上的變化。[0129]因此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供用于監(jiān)測對人或動物受試者中的疾病狀態(tài)的治療功效的方法，所述方法包括(i)定量如本文所定義的生物標(biāo)志物的量；和(ii)將試樣中所述生物標(biāo)志物的量與存在于一個或多個對照和/或在更早時間取自同一測試受試者的一個或多個先前試樣中的量進(jìn)行比較。[0130]試樣中生物標(biāo)志物的水平相對于在更早取自同一測試受試者的先前試樣中的水平的變化，可指示所述療法對所述病癥或疑似病癥的有益效果，例如穩(wěn)定或改善。此外，一旦完成治療，可定期重復(fù)本發(fā)明的方法以監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)。[0131]用于監(jiān)測治療功效的方法可用于監(jiān)測現(xiàn)有療法和新療法在人受試者和在非人動物（例如動物模型）中的治療效果。這些監(jiān)測方法可并入用于新藥物和藥物組合的篩選中。[0132]在又一個實施方案中，對于因快速起效療法所致的更快速變化的監(jiān)測，可以數(shù)小時和數(shù)天的更短間隔進(jìn)行。[0133]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供鑒定用于檢測疾病狀態(tài)存在的生物標(biāo)志物的方法。本文所用的術(shù)語"鑒定"意指確認(rèn)存在于生物樣品中的生物標(biāo)志物的存在。對存在于樣品中的生物標(biāo)志物的量的定量，可包括確定存在于所述樣品中的生物標(biāo)志物的濃度。鑒定和/或定量可在樣品上直接進(jìn)行，或者在自其的提取物或其稀釋物上間接進(jìn)行。[0134]在本發(fā)明的備選方面，所述生物標(biāo)志物的存在通過檢測和/或定量能夠與所述生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體或其片段來評價，所述抗體或其片段通過受試者身體對所述生物標(biāo)志物反應(yīng)而生成，并因此存在于來自具有疾病狀態(tài)的受試者的生物樣品中。[0135]可通過適于在來自患者的生物樣品或者生物樣品的純化物或提取物或其稀釋物中鑒定特定蛋白的存在和/或量的任何方法來進(jìn)行鑒定和/或定量。在本發(fā)明的方法中，可通過測定一個或多個樣品中生物標(biāo)志物的濃度來進(jìn)行定量?？捎帽景l(fā)明的方法測試的生物樣品包括如上文所定義的生物樣品?？梢岳邕m當(dāng)稀釋或濃縮來制備樣品并以常規(guī)方式儲存。[0136]生物標(biāo)志物的鑒定和/或定量可通過檢測所述生物標(biāo)志物或其片段，例如C端截短的片段或N端截短的片段來進(jìn)行。片段在長度上適宜大于4個氨基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸。特別注意的是，與組蛋白尾部相同序列或相關(guān)序列的肽為組蛋白的特別有用的片段。[0137]生物標(biāo)志物可例如通過SELDI或MALDI-T0F直接檢測。或者，可經(jīng)由與能夠特異性結(jié)合生物標(biāo)志物的一種或多種配體例如抗體或其生物標(biāo)志物結(jié)合片段或其它肽、或例如適體或寡核苷酸等配體的相互作用來直接或間接檢測生物標(biāo)志物。所述配體或結(jié)合物可具有可檢測標(biāo)記，例如發(fā)光、熒光或放射性標(biāo)記和/或親和標(biāo)簽。[0138]例如，檢測和/或定量可通過選自以下的一種或多種方法進(jìn)行：SELDI(-T0F)、MALDI(-T0F)、基于1-D凝膠的分析、基于2-D凝膠的分析、基于質(zhì)譜（MS)、反相（RP)IX、大小滲透（凝膠過濾）、離子交換、親和、HPLC、UPLC和其它LC或LCMS的技術(shù)。適當(dāng)?shù)腖CMS技術(shù)包括ICAT?(AppliedBiosystems,CA,USA)或iTRAQ?(AppliedBiosystems,CA,USA)。亦可使用液相色譜法（例如高壓液相色譜法（HPLC)或低壓液相色譜法（LPLC))、薄層色譜法、NMR(核磁共振）光譜法。[0139]依照本發(fā)明的診斷或監(jiān)測的方法可包括通過SELDIT0F或MALDIT0F分析樣品以檢測生物標(biāo)志物的存在或水平。這些方法亦適于臨床篩查、預(yù)后、監(jiān)測治療結(jié)果、鑒定最可能響應(yīng)特定的治療性療法的患者，適于藥物篩選和開發(fā)，以及鑒定藥物治療的新靶標(biāo)。[0140]鑒定和/或定量分析物生物標(biāo)志物可使用免疫學(xué)方法進(jìn)行，其涉及能夠與所述生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體或其片段。合適的免疫學(xué)方法包括夾心免疫測定法，例如夾心ELISA，其中使用識別分析物生物標(biāo)志物上的不同表位的兩個抗體進(jìn)行所述分析物生物標(biāo)志物的檢測；放射免疫測定法（RIA);直接、間接或競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA);酶免疫測定法（EIA);熒光免疫測定法（FIA);蛋白質(zhì)印跡；免疫沉淀和任何基于顆粒的免疫測定法（例如使用金、銀或乳膠顆粒、磁性顆?；騋-點）。免疫學(xué)方法可以例如微量滴定板或試紙條形式進(jìn)行。[0141]在一個實施方案中，可將一種或多種生物標(biāo)志物替換成生物途徑中在所述生物標(biāo)志物的上游或下游存在的分子或所述分子的可測定片段。[0142]鑒定對疾病特異的關(guān)鍵生物標(biāo)志物對診斷程序和治療方案的整合而言極為重要。使用預(yù)測性生物標(biāo)志物，可開發(fā)適當(dāng)?shù)脑\斷工具，例如生物傳感器；因此，在本發(fā)明的方法和用途中，可使用生物傳感器、微量分析系統(tǒng)、微量工程化系統(tǒng)、微量分離系統(tǒng)、免疫層析系統(tǒng)或其它合適的分析裝置進(jìn)行鑒定和定量。所述生物傳感器可并入用于檢測一種或多種生物標(biāo)志物的免疫學(xué)方法、電、熱、磁、光（例如全息圖）或聲學(xué)技術(shù)。使用所述生物傳感器，有可能檢出以預(yù)期的濃度存在于生物樣品中的一種或多種靶生物標(biāo)志物。[0143]本文所用的術(shù)語"生物傳感器"意指能夠檢測所述生物標(biāo)志物存在的任何事物。生物傳感器的實例在本文中描述。[0144]依照本發(fā)明的生物傳感器可包含配體結(jié)合物或配體，如本文所述，其能夠與生物標(biāo)志物特異性結(jié)合。這類生物傳感器在檢測和/或定量本發(fā)明的生物標(biāo)志物中是有用的。[0145]本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物可使用生物傳感器檢測，所述生物傳感器結(jié)合有基于"智能（smart)"全息圖或高頻聲學(xué)系統(tǒng)的技術(shù)，所述系統(tǒng)特別易于進(jìn)行"條形碼"或陣列配置。[0146]在智能全息圖傳感器（SmartHologramsLtd,Cambridge,UK)中，全息圖像儲存在經(jīng)敏化處理以與生物標(biāo)志物特異性反應(yīng)的薄聚合物膜中。暴露之后，生物標(biāo)志物與聚合物反應(yīng)，導(dǎo)致經(jīng)全息圖顯示的圖像上的變化。讀出的測試結(jié)果可以是在光學(xué)亮度、圖像、顏色和/或圖像位置上的變化。對于定性和半定量應(yīng)用，傳感器全息圖可通過肉眼讀取，從而去除對于檢測設(shè)備的需要。在需要定量測定時，可使用簡單的顏色傳感器讀取信號。樣品的混濁度或顏色不會干擾所述傳感器的運作。傳感器的形式允許用于同時檢測數(shù)種物質(zhì)的多路傳輸。可設(shè)計可逆和不可逆的傳感器以滿足不同的需求，并且特定的目標(biāo)生物標(biāo)志物的連續(xù)監(jiān)測是可行的。[0147]適當(dāng)?shù)兀糜跈z測本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物的生物傳感器將生物分子識別與適當(dāng)?shù)墓ぞ呓M合，以將樣品中生物標(biāo)志物的存在的檢測或定量轉(zhuǎn)換成信號。生物傳感器可適于"可變位點"診斷測試，例如在病房、門診部、手術(shù)室、家中、野外和工作場所。[0148]檢測本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物的生物傳感器包括聲學(xué)、等離子體共振、全息、Bio-Layer干涉測定法（BLI)和微量工程化的傳感器。可在用于檢測本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物的生物傳感器中使用印記的識別元件、薄膜晶體管技術(shù)、磁聲諧振器裝置和其它新型聲-電系統(tǒng)。[0149]涉及鑒定和/或定量本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物的方法可在臺式儀器上進(jìn)行，或者可并入一次性診斷或監(jiān)測平臺，其可用于非實驗室環(huán)境，例如用于醫(yī)師辦公室或患者病床邊。用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的合適生物傳感器包括具有光學(xué)或聲學(xué)讀數(shù)器的"信用"卡?？蓪⑸飩鞲衅髋渲贸稍试S將收集的數(shù)據(jù)電子傳輸給醫(yī)師以進(jìn)行解讀并因此可形成電子醫(yī)療的基礎(chǔ)。[0150]本文描述了用于診斷和監(jiān)測疾病狀態(tài)的存在的診斷試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒另外包含能夠鑒定和/或定量生物標(biāo)志物的生物傳感器。依照本發(fā)明的試劑盒可適當(dāng)?shù)匕x自以下的一個或多個組分：配體結(jié)合物、或者對生物標(biāo)志物或所述生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異的配體、一種或多種對照、一種或多種試劑和一種或多種耗材；任選連同依照本文所定義的任何方法的試劑jSl使用說明書。[0151]鑒定疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物允許將診斷程序和治療方案整合。本發(fā)明的生物標(biāo)志物的檢測可用于在其參與臨床試驗之前篩選受試者。生物標(biāo)志物提供指示治療反應(yīng)、不能反應(yīng)、不利副作用特征、藥物依從性的程度和到達(dá)足夠血清藥物水平的工具。生物標(biāo)志物可用于提供不良藥物反應(yīng)的警告。生物標(biāo)志物在開發(fā)個性化療法中有用，因為反應(yīng)的評價可用于微調(diào)劑量，使處方藥的數(shù)量降至最低，減少在獲得有效治療上的延遲并避免不良藥物反應(yīng)。因此通過監(jiān)測本發(fā)明的生物標(biāo)志物，可將患者護(hù)理定制為恰好滿足通過患者的病癥和藥物基因組學(xué)特征而定的需要，從而可將所述生物標(biāo)志物用于滴定最佳劑量、預(yù)測陽性治療反應(yīng)和鑒定處于嚴(yán)重副作用的高風(fēng)險下的患者。[0152]基于生物標(biāo)志物的測試提供"新"患者的一線判定，并向精確而快速的診斷提供客觀測量，這是使用現(xiàn)有測量不能實現(xiàn)的。[0153]此外，診斷性生物標(biāo)志物測試對于鑒定患有輕度或無癥狀疾病或者可能處于形成有癥狀疾病的高風(fēng)險下的家庭成員或患者而言是有用的。這允許開始適當(dāng)治療或預(yù)防性措施，例如管理風(fēng)險因素。認(rèn)為這些方法改善結(jié)果并可預(yù)防病癥的明顯發(fā)作。[0154]生物標(biāo)志物監(jiān)測法、生物傳感器和試劑盒作為患者監(jiān)測工具亦為至關(guān)重要的，其使醫(yī)師能夠確定復(fù)發(fā)是否因病癥的惡化所致。如果藥物治療經(jīng)評價為不足的，則隨后可恢復(fù)或增加治療；適當(dāng)時可給予療法上的改變。鑒于所述生物標(biāo)志物對病癥狀態(tài)為敏感的，其提供對藥物治療的影響的指示。[0155]現(xiàn)在將參考以下非限制性實施例來闡述本發(fā)明。[0156]實施例1使用用于核小體相關(guān)核苷酸5-甲基胞嘧啶的ELISA法，用結(jié)合完整核小體的固相抗-組蛋白捕獲抗體和生物素化的單克隆抗-5-甲基胞嘧啶檢測抗體，測定通過消化提取自MCF7細(xì)胞的染色質(zhì)產(chǎn)生的市購可得的核小體制品的甲基化DNA，其中核小體中的DNA和蛋白質(zhì)經(jīng)交聯(lián)以穩(wěn)定（確保存在于所述制品中的所有組蛋白均摻入到完整核小體中）。用胎牛血清將所述核小體樣品連續(xù)稀釋并用ELISA-式兩份測定。亦在ELISA中測定純胎牛血清作為不含無細(xì)胞核小體的對照樣品。測定方法如下：向微量滴定孔中加入含抗-組蛋白抗體的〇.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4的溶液（100μ?7孔）并在4°C孵育過夜以用捕獲抗體包被所述孔。傾去過量的抗-組蛋白抗體。向孔中加入牛血清白蛋白的溶液（20g/L)(200μ?ν孔）并于室溫孵育30分鐘以封閉孔上過量的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。傾去過量的牛血清白蛋白溶液并用洗滌緩沖液（200μ?ν孔，含1%Tween20的0.05ΜTRIS/HC1緩沖液pH7.5)將孔洗滌3次。向孔中加入樣品（10μ?7孔）和測定緩沖液（50μ?7孔，含0.9%NaCl、0.05%去氧膽酸鈉和1%NonidetP40取代物的0.05MTRIS/HC1pH7.5)，于室溫在溫和搖動下孵育90分鐘。傾去所述樣品和測定緩沖液混合物并用洗滌緩沖液（200μ?7孔）將孔洗滌3次。加入生物素化的抗-5-甲基胞嘧啶檢測抗體的溶液（50μ?7孔）并于室溫在溫和搖動下孵育90分鐘。傾去過量的檢測抗體并再次用洗滌緩沖液（200μ?7孔）將孔洗滌3次。加入含有鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶綴合物的溶液（50μ?7孔）并于室溫在溫和搖動下孵育30分鐘。傾去過量的綴合物并再次用洗滌緩沖液（200μ?7孔）將孔洗滌3次。加入有色底物溶液（100μ?ν孔，2,2'-Azinobis[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽）并于室溫在溫和搖動下孵育20分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板讀數(shù)器在405nm波長處測量孔的光密度（0D)。觀察到顏色隨核小體相關(guān)的抗-5-甲基胞嘧啶濃度增加而增加的劑量反應(yīng)曲線，在不含5-甲基胞嘧啶（胎牛血清）的情況下觀察到低的背景信號。陽性ELISA信號表明，經(jīng)ELISA檢出的5-甲基胞嘧啶摻入在包含組蛋白和DNA二者的完整核小體內(nèi)，因為（i)所述捕獲抗體與樣品中的組蛋白結(jié)合和（ii)檢測抗體與DNA的5-甲基胞嘧啶組分結(jié)合。所述結(jié)果在圖1中顯示。[0157]實施例2使用用于核小體相關(guān)核苷酸5-羥甲基胞嘧啶的ELISA法，用結(jié)合完整核小體的固相抗-組蛋白捕獲抗體和生物素化的單克隆抗-5-羥甲基胞嘧啶檢測抗體，測定通過消化提取自A375細(xì)胞的染色質(zhì)產(chǎn)生的市購可得的核小體制品的5-羥甲基化DNA，其中核小體中的DNA和蛋白質(zhì)經(jīng)交聯(lián)以穩(wěn)定（確保存在于所述制品中的所有組蛋白均摻入到完整核小體中）。用胎牛血清將所述核小體樣品連續(xù)稀釋并用ELISA-式兩份測定。亦在ELISA中測定純胎牛血清作為不含無細(xì)胞核小體的對照樣品。測定方法如下：向微量滴定孔中加入含抗-組蛋白抗體的〇.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4的溶液（100μ?7孔）并在4°C孵育過夜以用捕獲抗體包被所述孔。傾去過量的抗-組蛋白抗體。向孔中加入牛血清白蛋白的溶液（20g/L)(200μ?7孔）并于室溫孵育30分鐘以封閉孔上過量的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。傾去過量的牛血清白蛋白溶液并用洗滌緩沖液（200μ?7孔，含1%Tween20的0.05ΜTRIS/HC1緩沖液pH7.5)將孔洗滌3次。向孔中加入樣品（10μ?7孔）和測定緩沖液（50μ?7孔，含0.9%NaCl、0.05%去氧膽酸鈉和1%NonidetP40取代物的0.05MTRIS/HC1pH7.5)，于室溫在溫和搖動下孵育90分鐘。傾去所述樣品和測定緩沖液混合物并用洗滌緩沖液（200μ?7孔）將孔洗滌3次。加入生物素化的抗-5-羥甲基胞嘧啶檢測抗體的溶液（50μ?7孔）并于室溫在溫和搖動下孵育90分鐘。傾去過量的檢測抗體并再次用洗滌緩沖液（200μ?7孔）將孔洗滌3次。加入含有鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶綴合物的溶液（50μ?7孔）并于室溫在溫和搖動下孵育30分鐘。傾去過量的綴合物并再次用洗滌緩沖液（200μ?7孔）將孔洗滌3次。加入有色底物溶液（100μ?ν孔，2,2'-Azinobis[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽）并于室溫在溫和搖動下孵育20分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板讀數(shù)器在405nm波長處測量孔的光密度（0D)。觀察到顏色隨核小體相關(guān)的抗-5-羥甲基胞嘧啶濃度增加而增加的劑量反應(yīng)曲線，在不含5-羥甲基胞嘧啶（胎牛血清）的情況下觀察到低的背景信號。陽性ELISA信號表明，經(jīng)ELISA檢出的5-羥甲基胞嘧啶摻入在包含組蛋白和DNA二者的完整核小體內(nèi)，因為（i)所述捕獲抗體與樣品中的組蛋白結(jié)合和（ii)檢測抗體與DNA的5-羥甲基胞嘧啶組分結(jié)合。所述結(jié)果在圖2中顯示。[0158]實施例3我們使用現(xiàn)有技術(shù)的兩種核小體ELISA法測量取自20個健康受試者的血清和血漿血樣的循環(huán)無細(xì)胞核小體含量。第一種現(xiàn)行ELISA法（ELISA1)為RocheCellDeathELISA而另一種（ELISA2)為使用抗-組蛋白捕獲抗體和抗-組蛋白-DNA復(fù)合物檢測抗體的ELISA。經(jīng)兩種現(xiàn)行核小體ELISA法在正常血漿中檢出的核小體水平均低于正常血清中的水平。核小體的血清水平的正常范圍（以光密度單位表示）（20個健康受試者血清結(jié)果的平均值土平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差），對于ELISA1計算為0-4.3個0D單位，而對于ELISA2計算為0-1.4個0D單位。對于血漿的各范圍為0-0.95和0-0.96。所述結(jié)果在圖3中顯示。[0159]我們亦在取自健康受試者的相同的20個樣品中測量了含兩種核小體相關(guān)的核苷fe以及3種核小體相關(guān)的組蛋白變體和組蛋白PTM的核小體的水平。結(jié)果顯不，健康血清樣品具有一致低水平的含組蛋白變體或PTM或核苷酸的核小體。含組蛋白變體、PTM或核苷酸的核小體的血清水平的正常范圍（以光密度表示），（a)對于mH2Al.1為0-0.36,（b)對于mH2A2為0·05-0.78,（c)對于H2AZ為0·11-0.58,（d)對于P-H2AX(Serl39)為0·06-0.61，(e)對于5-甲基胞嘧啶為0·06-0.36和（f)對于5-羥甲基胞嘧啶為0·03-0.36。對于全部20個健康受試者，測得的EDTA血漿結(jié)果均較高。所述結(jié)果在圖4、5、6、7、8和9中顯示。[0160]實施例4我們在取自13個健康受試者和患有胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌（小細(xì)胞肺癌和各種非小細(xì)胞肺癌）、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和各種口腔癌（口腔、腭、咽和喉）的55個受試者的EDTA血漿中測定了含5-甲基胞嘧啶的無細(xì)胞核小體。對于一種或多種無細(xì)胞核小體類型，來自健康受試者的全部13個樣品均為陽性的。對于測定的全部無細(xì)胞核小體類型，來自癌癥患者的全部55個樣品均為陽性的。然而，在取自癌癥受試者的樣品中測得的水平高于在來自健康受試者的樣品中發(fā)現(xiàn)的水平，并且結(jié)果顯示健康受試者和癌癥受試者為可辨別的。例如對于核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶，以0D方式計算的正常范圍（按平均值土平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差）為0-1.41。使用此截止值，全部13個健康樣品均為陰性的，而55個癌癥樣品中的30個為陽性的（55%的總體臨床靈敏性），包括38%(3/8)的胃癌樣品、60%(3/5)的大腸癌樣品、33%(1/3)的直腸癌樣品、33%(2/6)的小細(xì)胞肺癌樣品、64%(9/14)的非小細(xì)胞肺癌樣品、33%(2/6)的乳腺癌樣品、100%(1/1)的卵巢癌樣品、100%(1/1)的胰腺癌樣品、33%(2/6)的前列腺癌樣品、100%(1/1)的腎癌樣品和60%(3/5)的口腔癌樣品。所述結(jié)果在圖17中顯示。[0161]我們亦使用本發(fā)明的方法在相同的樣品中測量多種其它的核小體相關(guān)的結(jié)構(gòu)。匯集這些免疫測定的結(jié)果以得到取自癌癥患者的樣品中核小體結(jié)構(gòu)的特征，將其相對于含5_甲基胞嘧啶核小體的檢出水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。我們將所得特征與取自健康受試者的樣品的核小體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞核小體的核小體結(jié)構(gòu)特征不同于健康受試者的核小體結(jié)構(gòu)特征。所述結(jié)果在圖20中顯示。我們類似地對取自各種非癌疾病的樣品匯集了核小體結(jié)構(gòu)特征，并將其與取自癌癥患者和取自健康受試者的樣品中的核小體特征進(jìn)行比較。所述結(jié)果在圖21中顯示。[0162]我們隨后進(jìn)行了另一個類似的實驗，其包含來自10個健康受試者和患有各種類型癌癥的另外62個患者的樣品。所述結(jié)果類似于第一個實驗。例如使用核小體相關(guān)的5_甲基胞嘧啶的結(jié)果以及健康受試者結(jié)果的平均值土平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差的截止值，對于全部10個健康受試者均獲得陰性結(jié)果而對于95%￠1/62)的癌癥患者獲得陽性結(jié)果，其包括9/9前列腺癌患者、5/5皮膚癌患者、8/8食道癌患者、12/13膀胱癌患者、2/2宮頸癌患者和1/1結(jié)腸癌患者、4/4乳腺癌患者、7/7卵巢癌患者、7/7喉癌患者、3/3肺癌患者和3/3腎癌患者。所述結(jié)果在圖18中顯示。此結(jié)果表明，血清核苷酸水平和核小體相關(guān)的核苷酸水平，特別地包括5-甲基胞嘧啶，為用于癌癥的臨床上靈敏的生物標(biāo)志物。[0163]實施例5我們使用現(xiàn)有技術(shù)的兩種核小體ELISA法測量取自患有結(jié)腸癌的3個受試者、患有肺癌的13個受試者、患有胰腺癌的2個受試者、患有口腔癌的1個受試者的樣品以及依照HoldenriederOHoldenrieder等，2001)的方法自健康受試者產(chǎn)生的核小體樣品的循環(huán)無細(xì)胞核小體含量。第一種現(xiàn)彳丁ELISA法（ELISA1)為RocheCellDeathELISA而另一種(ELISA2)為使用抗-組蛋白捕獲抗體和抗-組蛋白-DNA復(fù)合物檢測抗體的ELISA。[0164]我們亦在取自癌癥受試者的相同的19個樣品中測量了含核苷酸5-甲基胞嘧啶和5_羥甲基胞嘧啶以及3種變體組蛋白和組蛋白PTM的核小體的水平。結(jié)果顯示，盡管對于大多數(shù)受試者，特別是胰腺癌和口腔癌患者，以現(xiàn)有技術(shù)的ELISA法檢出低的核小體結(jié)果，但是這些樣品的大多數(shù)具有較高可檢測水平的含一種或多種核小體相關(guān)的核苷酸或變體組蛋白的核小體。取自患有結(jié)腸癌的3個受試者、患有肺癌的13個受試者、患有胰腺癌的2個受試者和患有口腔癌的1個受試者的樣品的結(jié)果分別在圖10、11、12和13中顯示。在19個癌癥樣品的16個（除3個肺癌樣品之外）中檢出顯著的核小體相關(guān)組蛋白變體水平和組蛋白PTM水平。此外，在19個癌癥樣品的12個中檢出顯著的核小體相關(guān)5-羥甲基胞嘧啶水平。此外，在全部19個癌癥樣品中均檢出顯著的核小體相關(guān)5-甲基胞嘧啶水平。[0165]此外，對于所有受試者而言，含不同核苷酸、組蛋白變體和組蛋白PTM水平的核小體水平的模式并非一致，而對測試的不同癌癥顯示不同的模式。為了利于在患有相同或不同癌癥的受試者的結(jié)果之間進(jìn)行比較，將核小體測試（對于含巨H2A1.1、巨H2A2、H2AZ、P-H2AX(Serl39)、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶的核小體）的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為對含5-甲基胞嘧啶的核小體觀察到的0D信號的比例。對于各癌癥的標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果（誤差線顯示其中測試了來自多于一個受試者的樣品的結(jié)果中的標(biāo)準(zhǔn)差）以及對于自健康受試者產(chǎn)生的核小體樣品的相同結(jié)果（對此樣品未測量mH2A2和5-羥甲基胞嘧啶）在圖14中顯示。圖14顯示，含不同標(biāo)準(zhǔn)化核苷酸、組蛋白變體或PTM的核小體在研究的全部四種癌癥中的分布模式相當(dāng)顯著地不同于制備自健康受試者的樣品中的核小體分布。例如，健康核小體樣品中含巨H2A1.1的核小體的相對水平不同于在任何癌癥類型的樣品中檢出的水平。因此，本發(fā)明可用作用于在簡單的基于血液的篩查測試中檢測癌癥的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本發(fā)明包括測試含有其它另外的核苷酸和/或組蛋白變體和/或組蛋白修飾的核小體，以進(jìn)一步或更好地區(qū)分腫瘤或其它疾病來源的循環(huán)無細(xì)胞核小體。[0166]此外，對不同的癌癥類型觀察到的核小體類型的模式不同。例如，可通過不同標(biāo)準(zhǔn)化水平的核小體相關(guān)的H2AZ和5-羥甲基胞嘧啶區(qū)分取自患有結(jié)腸癌、胰腺癌和口腔癌的受試者的樣品。類似地，與任何其它三種癌癥類型相比，口腔癌具有不同標(biāo)準(zhǔn)化水平的含mH2A2或P-H2AX(Serl39)的兩種核小體，并且基于含變體巨H2A1.1的核小體的不同相對水平，來自患有胰腺癌的受試者的樣品可與來自患有結(jié)腸癌的受試者的樣品相區(qū)別。因此，本發(fā)明可用作一般診斷癌癥以及區(qū)分具體癌癥類型的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，本發(fā)明包括測試含其它另外的組蛋白變體和/或組蛋白修飾和/或核苷酸的核小體，以進(jìn)一步或更好地區(qū)分不同具體腫瘤來源或其它疾病來源的循環(huán)無細(xì)胞核小體。[0167]實施例6我們在取自3個健康受試者和取自10個結(jié)腸癌患者的血清樣品中測試了本發(fā)明的方法。我們在這些樣品中測量了含5-甲基胞嘧啶的核小體，并且相對于健康受試者獲得的結(jié)果，癌癥結(jié)果一致升高，如在圖16中顯示。[0168]實施例7我們測量了取自肺癌和結(jié)腸癌患者的人EDTA血漿樣品的核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平。將檢出水平與所述患者的疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。在圖19中顯示的結(jié)果表明，核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平隨疾病的嚴(yán)重性（就大小、階段、結(jié)節(jié)擴(kuò)散而言）而增加，并且核小體相關(guān)的5-甲基胞嘧啶水平可單獨或作為診斷組的部分用作疾病進(jìn)展的指示物。[0169]參考文獻(xiàn)Allen等，AsimplemethodforestimatingglobalDNAmethylationusingbisulfitePCRofrepetitiveDNAelements(用于使用重復(fù)DNA元件的亞硫酸氫鹽PCR估計總體DNA甲基化的簡便方法）·NucleicAcidsResearch:32(3)e38D0I:10.1093/nar/gnh032Bawden等，Detectionofhistonemodificationincell-freenucleosomes(無細(xì)胞核小體中組蛋白修飾的檢測）.WO2005/019826,2005Boulard等，HistonevariantmacroH2Aldeletioninmicecausesfemale-specificsteatosis(小鼠中的組蛋白變體巨H2A1缺失導(dǎo)致雌性-特異性皮脂腺?。?Epigenetics&Chromatin:3(8)，1-13，2010CellBiolabs，Inc.ProductManualfor"GlobalDNAMethylationELISAKit(5,-methyl-2,-deoxycytidineQuantitation"（"總體DNA甲基化ELISA試劑盒5'-甲基-2'-脫氧胞苷定量"的產(chǎn)品手冊），2011Dai等，DetectionofPost-translationalModificationsonNativeIntactNucleosomesbyELISA(通過ELISA檢測對天然的完整核小體的翻譯后修飾）.http://www.jove.com/details.php?id=2593doi:10.3791/2593.JVisExp.50(2011).Deligezer等，Sequence-SpecificHistoneMethylationIsDetectableonCirculatingNucleosomesinPlasma(對血菜中的循環(huán)核小體可檢測序列特異性組蛋白甲基化）·ClinicalChemistry54(7)，1125-1131，2008EpigentekGroupInc,Methylamp?GlobalDNAMethylationQuantificationKit(Methylamp?總體DNA甲基化定量試劑盒），UserGuide(用戶指南），第2版.0802,2009Esteller，Cancerepigenomics:DNAmethylomesandhistone-modificationmaps(癌癥表觀基因組：DNA甲基化譜和組蛋白修飾圖譜）NatureReviewsGenetics:8，286-298，2007Feinberg和Vogelstein，Hypomethylationdistinguishesgenesofsomehumancancersfromtheirnormalcounterparts(低甲基化區(qū)分某些人類癌癥的基因與其正常對應(yīng)物）·Nature:301，89-92，1983Grutz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NA堿基為存在于全部或大部分核小體中以測試無細(xì)胞DNA本身的常見堿基。11.如權(quán)利要求1-10中任一項所定義的用途或方法，其中所述DNA堿基為胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。12.如權(quán)利要求6-11中任一項所定義的方法，其中所述結(jié)合劑為抗體。13.依照權(quán)利要求6-12中任一項的方法，其中所述樣品為生物流體。14.依照權(quán)利要求6-13中任一項的方法，其中所述樣品為血液或血清或血漿。15.-種如權(quán)利要求6-14中任一項所足義的用于在細(xì)胞中檢測含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體的存在的方法，所述方法包括步驟：(i)自細(xì)胞中分離染色質(zhì)；(ii)消化、超聲處理或以其它方式分解所述染色質(zhì)以形成單核小體和/或寡核小體；和(iii)依照權(quán)利要求6-14中任一項的方法檢測或測量所述核小體中DNA堿基、核苷酸或核苷的存在。16.-種用于檢測或診斷動物或人受試者中的疾病狀態(tài)的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(ii)使用測得的核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷水平鑒定所述受試者的疾病狀態(tài)。17.-種用于評估動物或人受試者對藥物治療的適應(yīng)性的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(ii)使用測得的核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷水平作為選擇用于受試者的合適治療的參數(shù)。18.-種用于監(jiān)測動物或人受試者的治療的方法，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；(ii)在一個或多個時機(jī)下重復(fù)檢測或測量受試者體液中含DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(iii)使用在測得的核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷水平上的任何變化作為在受試者病況上的任何變化的參數(shù)。19.依照權(quán)利要求16-18中任一項的方法，其中將所述核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷作為一組測量中的一種來檢測或測量。20.依照權(quán)利要求16-19中任一項的方法，其用于實際或疑似患有癌癥、良性腫瘤、炎性疾病、自身免疫性疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、傳染病、膿毒癥、中風(fēng)或心肌梗塞的受試者。21.-種用于鑒定DNA堿基、核苷酸或核苷生物標(biāo)志物的方法，所述生物標(biāo)志物用于檢測或診斷動物或人受試者中的疾病狀態(tài)，所述方法包括步驟：(i)檢測或測量受試者體液中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；(ii)檢測或測量健康受試者或?qū)φ帐茉囌唧w液中含所述DNA堿基、核苷酸或核苷的核小體；和(iii)使用在患病和對照受試者中測得的水平之間的差異來鑒定DNA堿基、核苷酸或核酸是否可用作所述疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物。22.-種生物標(biāo)志物，其通過權(quán)利要求21中所定義的方法鑒定。23.-種用于檢測核小體相關(guān)的DNA堿基、核苷酸或核苷的試劑盒，所述試劑盒包含對所述DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分；或者所述DNA堿基、核苷酸或核苷或其組成部分的結(jié)構(gòu)/形狀模擬物特異的配體或結(jié)合物，連同依照權(quán)利要求6-21中所定義的任一種方法的試劑盒使用說明書。【文檔編號】G01N33/574GK104067124SQ201280053555【公開日】2014年9月24日申請日期:2012年8月31日優(yōu)先權(quán)日:2011年9月1日【發(fā)明者】J.V.米卡萊夫申請人:新加坡意志私人有限公司