制備柱色譜體系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了包含混合回路或混合室、氣泡捕捉器、濃度檢測器和一個或多個泵的色譜體系，其特征在于氣泡捕捉器具有在其最高點的固定開口。此外，描述了色譜體系，其特征在于它包含兩個濃度檢測器，其中第一個位于混合回路或混合室中，且第二個位于主泵下游。
【專利說明】制備柱色譜體系
[0001]本發(fā)明涉及制備柱色譜體系。該體系的一個元素是兩個NIR檢測器的使用，其中一個在色譜柱上游，且一個在色譜柱下游以設(shè)置和監(jiān)控洗脫梯度以及連續(xù)地檢查所用HPLC柱的質(zhì)量。另一元素是具有可變密封氣泡捕捉器的新設(shè)計混合回路，所述氣泡捕捉器與體系的混合回路分離并可分流體積流量。
技術(shù)背景
[0002]目前，對于某些尺寸單獨地建立常規(guī)制備HPLC體系，因為體系中的梯度形成不能確切轉(zhuǎn)換成不同的尺寸。另外，工藝條件轉(zhuǎn)移至分析或半制備體系幾乎是不可能的。這同樣適用于梯度向具有不同設(shè)計的體系的轉(zhuǎn)換。
[0003]色譜法中所用洗脫液的應(yīng)用相關(guān)高氮氣和氣體含量可產(chǎn)生梯度形成期間溶于洗脫液中的氣體的釋放，其一方面對色譜柱上游的NIR測量以及相應(yīng)地對梯度形成和它的再現(xiàn)性具有不利影響。另一方面，HPLC柱以及特別是柱填料也受這影響，因為氣體在柱填料內(nèi)也釋放，其可導(dǎo)致柱填料內(nèi)裂紋或不均勻性的形成。在常規(guī)HPLC體系中，安裝在體系中的氣泡捕捉器不能執(zhí)行完全除氣功能，因為如同整個混合回路，它們在壓力下。
[0004]US2011/073548報告了分離體系和方法。使液相色譜法中的洗出液帶寬最小化報告于EP0444441中。在US4，116，046中，報告了液相色譜體系。用于降低液體制備中的乙醇含量的裝置和方法報告于EP2 113 770中。
[0005]發(fā)明概沭
[0006]制備HPLC體系中的梯度通常通過借助泵的規(guī)定輸送體積控制，但不考慮實際梯度。也不考慮體積收縮影響。
[0007]在這種情況下，本文中描述并要求保護(hù)新多級HPLC體系，所述體系具有可任選置于色譜柱下游或者直接置于柱上游(但在任何情況下，在高壓泵下游)的另一多功能NIR測量和具有除氣功能的改進(jìn)梯度混合回路。
[0008]在本申請中，一方面描述了包含混合回路或混合室、氣泡捕捉器、濃度檢測器和一個或多個泵的色譜體系，其特征在于氣泡捕捉器具有在最高點的固定開口，其打開程度可調(diào)節(jié)。
[0009]可將從液體中逸出的氣體以及過量液體在任何時間以預(yù)定可調(diào)節(jié)體積流量通過固定開口從氣泡捕捉器中除去。此外，固定開口改進(jìn)液體的除氣。
[0010]在一個實施方案中，氣泡捕捉器位于混合回路或混合室外部或下游。在一個實施方案中，氣泡捕捉器的入流是可調(diào)節(jié)的。在一個實施方案中，它通過閥調(diào)節(jié)。
[0011]調(diào)節(jié)氣泡捕捉器的入流的能力能夠調(diào)節(jié)在離開混合回路以后通過色譜柱或者在其最高點通過氣泡捕捉器由體系中除去的液體的量。這可以例如改進(jìn)控制或促進(jìn)色譜柱上預(yù)定梯度的形成。所需流通體積可與在體系的主泵下游的第二濃度檢測器一起調(diào)節(jié)，使得可使通過氣泡捕捉器分離的體積量最小化或者甚至避免。這通過對比實際梯度與目標(biāo)梯度以及調(diào)節(jié)閥通向氣泡捕捉器的開口以及因此在其最高點的閥而實現(xiàn)。
[0012]在一個實施方案中，氣泡捕捉器位于混合回路或混合室之內(nèi)。[0013]在一個實施方案中，體積流速可通過固定開口調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，通過閥調(diào)節(jié)。
[0014]氣泡捕捉器中溢流量的調(diào)節(jié)一方面使得可調(diào)節(jié)除氣的量。另一方面，它容許調(diào)節(jié)廢液體積的量。
[0015]在一個實施方案中，第一體積流量測量裝置位于氣泡捕捉器的固定開口下游，且第二體積流量測量裝置位于柱的下游。
[0016]在一個實施方案中，色譜體系包含在主泵下游的第二濃度檢測器。
[0017]如本文所述另一方面為色譜體系，其特征在于它包含兩個濃度檢測器，其中第一個位于混合回路或混合室中，且第二個位于主泵下游。
[0018]由于兩個濃度檢測器的排列，即一個在混合回路或混合室中，第二個在主泵下游，可通過對比第二濃度檢測器的值與第一濃度檢測器的值而檢查色譜體系的效率。在兩個信號之間偏離的情況下(在容許通過第一濃度檢測器與通過第二濃度檢測器之間的時段的時間校準(zhǔn)以后)，可推斷存在體系效率的損失。
[0019]在一個實施方案中，色譜柱位于主泵與第二濃度檢測器之間。
[0020]另一方面是如本文所述色譜體系檢查整個色譜體系的效率的用途。
[0021]一方面還有如本文所述色譜體系檢查色譜柱的完整性的用途。
[0022]兩個濃度檢測器的排列，即一個在混合回路或混合室中，第二個在色譜柱下游，容許通過對比第二濃度檢測器的值與第一濃度檢測器的值而檢查色譜體系的完整性。連同使用該排列檢查如本文所述色譜體系的效率，兩個檢測器信號之間的差可能是由于體系有關(guān)或柱有關(guān)的問題。在兩個信號之間偏離的情況下(在容許通過第一濃度檢測器與通過第二濃度檢測器之間的時段的時間校準(zhǔn)以后)，可推斷存在體系完整性的損失。
[0023]如本文所述另一方面是由第一濃度檢測器的信號與第二濃度檢測器的信號形成的比在控制色譜體系中的用途。
[0024]如果通過兩個濃度檢測器測定的信號彼此不同，則可調(diào)節(jié)色譜體系。它可在色譜分離以后或以前以及在正在進(jìn)行的分離期間，即在線調(diào)節(jié)。為調(diào)節(jié)，可使用混合回路或混合室中洗脫液的比、閥通向氣泡捕捉器的開口、氣泡捕捉器的永久性閥開口、由混合回路的排料速率或色譜柱的體積流量。
[0025]在一個實施方案中，濃度檢測器為UV檢測器、NIR檢測器、pH檢測器或?qū)щ娐蕶z測器，優(yōu)選為UV檢測器或NIR檢測器。
[0026]發(fā)明詳沭
[0027]本文報告了色譜體系，其特征在于在梯度形成期間容許/進(jìn)行連續(xù)除氣，由此在混合回路中形成梯度，由此體系包含氣泡捕捉器，所述氣泡捕捉器的特征在于包含在其最高點的可調(diào)節(jié)閥，由此連續(xù)除氣通過氣泡捕捉器的可調(diào)節(jié)閥的開口與主泵的泵送速度的相互作用而實現(xiàn)。氣泡捕捉器中閥的存在確保將可進(jìn)入氣泡捕捉器中的洗脫液的量用通過主泵操作，即應(yīng)用于柱，即從混合回路中除去的洗脫液的量校準(zhǔn)。
[0028]另外，可容許從混合回路中取出的剩余洗脫液借助氣泡捕捉器的閥離開氣泡捕捉器。在該操作模式中，色譜體系的多級應(yīng)用是可能的，即體系可以以具有不同直徑和尺寸的柱，即在色譜體系的計劃能力以下操作。這是重要的，因為通常設(shè)計和建立制備大規(guī)模色譜體系以用單個柱，即具有指定尺寸和直徑的單個柱操作。另外，也可以以不同的流速實現(xiàn)相同的梯度，其還容許與相同制備/大規(guī)模色譜體系一起使用具有不同尺寸/直徑的色譜柱。
[0029]在氣泡捕捉器的最高點和在離開氣泡捕捉器的管道中的可調(diào)節(jié)閥容許在氣泡捕捉器內(nèi)實現(xiàn)不同的壓力，其完全與混合回路中的壓力無關(guān)。
[0030]因此，本文所報告的氣泡捕捉器限定單獨的獨立體系，容許如本文所報告靈活地操作所涉及的大規(guī)模色譜體系。
[0031]大部分溶解氣體存在于HPLC體系的混合回路中的混合洗脫液中。由于必須的加壓，在那里僅輕微的氣體釋放是可能的。
[0032]在已知的HPLC體系中，使用加壓氣泡捕捉器，其中存在與混合回路中相當(dāng)?shù)膲毫ΑＲ虼?，該氣泡捕捉器中僅存在非常輕微的氣體釋放。另外，當(dāng)操作與低流速有關(guān)的小工藝尺寸時，氣泡捕捉器中的溶混性是差的，因為緩慢或低流入速率(參見圖17和19中的示意圖)。
[0033]借助可控關(guān)閉裝置如閥與混合回路分開的本文所述未加壓(可溢流)氣泡捕捉器容許溶于洗脫液中的氣體更強(qiáng)地釋放。此外，可排出過量梯度混合物。由于快速入流，還存在非常好的溶混性(參見圖18中的示意圖)。
[0034]借助本文所述HPLC體系，可檢查混合回路中形成的梯度到柱上的轉(zhuǎn)移性質(zhì)量。因此，可檢測例如由于HPLC體系中的干擾因素或不利條件而發(fā)生的程序化梯度變化(參見圖15、23、24、25 和 26)。
[0035]借助本文所述HPLC體系，還可測定在工藝步驟以前和期間所用HPLC柱的質(zhì)量，因為可省去板數(shù)目的測定，其后必須使柱經(jīng)受再生程序，所述再生程序是柱的最大應(yīng)力，使得它們可受損，并且不再可用于生產(chǎn)(參見圖6、7、8、9、10、27、28、29)。
[0036]本文描述了制備HPLC體系，其中體系的梯度形成混合回路用于操作最大尺寸以根據(jù)位于混合回路下游的氣泡捕捉器中的方法尺寸提供所需量的混合洗脫液。所需體積流量通過主泵應(yīng)用于柱，且其余通過不再結(jié)合到混合回路中的開放氣泡捕捉器從體系中排出(參見圖20、21和22)。
[0037]發(fā)現(xiàn)用該配置，梯度總是在相同條件下產(chǎn)生，并以相同質(zhì)量轉(zhuǎn)移至柱中。通過氣泡捕捉器從體系中排出的未用洗脫液的量根據(jù)柱的尺寸和洗脫液的體積流速變化。在最小工藝尺寸的情況下，排放量是最大的，在最大尺寸的情況下，排出最小的量。應(yīng)用于柱的梯度每種情況下是相同的，且不同的柱尺寸可在相同的工藝條件下操作。這產(chǎn)生工藝質(zhì)量和可靠性的增加(參見圖3、11、12、14、20、21和22)。
[0038]還發(fā)現(xiàn)使用在色譜柱下游的另外(第二)NIR測量，能夠使梯度轉(zhuǎn)移至任何柱尺寸和任何體系設(shè)計。柱下游的測量線中檢測到的NIR信號代表引導(dǎo)參數(shù)，根據(jù)所述引導(dǎo)參數(shù)，進(jìn)行體系程序化直至在管下游測量的結(jié)果與所需結(jié)果(目標(biāo)值)相同(參見圖15)。
[0039]洗脫液的密集除氣通過開放氣泡捕捉器實現(xiàn)?，F(xiàn)在在與混合回路分開的氣泡捕捉器中進(jìn)行的該密集除氣通過流入的液體的改進(jìn)溶混性補(bǔ)充。以這種方式，可將大量溶解氣體連續(xù)地從混合回路中除去。這降低了 NIR信號的干擾并導(dǎo)致色譜柱上改進(jìn)以及更可再現(xiàn)的梯度形成。從體系中排出的氣體的量不再向下游HPLC柱施加應(yīng)力，這實質(zhì)性地提高該工藝步驟的穩(wěn)固性(參見圖2、3、4和14)。
[0040]另一 NIR測量的執(zhí)行能夠連續(xù)地或者以所需頻率監(jiān)控應(yīng)用于柱上的梯度的質(zhì)量。立即檢測體系紊亂并可立即校正。[0041]所用柱的質(zhì)量可通過在色譜柱下游的NIR測量連續(xù)地監(jiān)控。這可例如通過對比柱上游與下游的梯度而進(jìn)行。不均勻或受損的柱填料或柱硬件歪曲遷移通過柱的梯度，因為液體總是尋求具有最小阻力的路徑，且這例如在柱裂紋內(nèi)。如果對比兩個梯度，則可測定是否存在任何差。在表明受損柱的彼此偏離的梯度的情況下，柱可立即從方法中除去或者經(jīng)受分開的試驗程序或修補(bǔ)措施，即甚至發(fā)生產(chǎn)物批次損失以前。在柱試驗以后進(jìn)行的柱再生期間也可使用該程序。因此，柱質(zhì)量可在分離以前直接評估，選擇如果需要的話以即時方式執(zhí)行合適措施(參見圖6、7、8、9、10、27、28、29)。
[0042]在再生以后以及直接在應(yīng)用產(chǎn)物以前，另一 NIR測量的使用(除連續(xù)監(jiān)控遷移通過柱的梯度)能使少量溶劑(優(yōu)選緩沖劑B)形式的短脈沖以平衡相應(yīng)用于柱上，評估在它離開柱以前形成的峰的形狀。這可在各產(chǎn)物應(yīng)用以前進(jìn)行，且其后不需要柱再生。柱質(zhì)量的多次連續(xù)監(jiān)控可借助在色譜柱下游的另一 NIR測量與在色譜柱上游的NIR測量組合進(jìn)行，因此可改進(jìn)HPLC步的質(zhì)量和穩(wěn)固性(參見圖9和10)。
[0043]在色譜柱下游的第二 NIR檢測器還使得可使用除氣和多級功能，因為要求所需體系設(shè)計(例如氣泡捕捉器的體積和設(shè)計)最佳化以及涉及的組件(例如混合回路泵和閥)的最佳調(diào)節(jié)。在最佳地調(diào)節(jié)體系以后，它常常執(zhí)行連續(xù)監(jiān)控功能，且如果需要的話容許立即校正(參見圖23、24、25和26)。
[0044]本文描述了 HPLC體系的新設(shè)計，其中氣泡捕捉器與混合回路分開。氣泡捕捉器借助可調(diào)節(jié)閥和氣泡捕捉器的開口構(gòu)型，即容許除去流入氣體和流入洗脫液，即能使氣泡捕捉器溢流的能力與混合回路的分開提供在它們達(dá)到柱以前將洗脫液除氣的改進(jìn)解決方法(參見圖18)。
[0045]使洗脫液不含它們的氣體內(nèi)容物產(chǎn)生兩個實質(zhì)性改進(jìn):
[0046]-色譜柱的質(zhì)量改進(jìn)，因為柱上的除氣降低或者甚至消除；
[0047]-混合回路中形成的梯度的質(zhì)量改進(jìn)，因為氣泡不能影響NIR信號。
[0048]這些優(yōu)點可通過在色譜柱下游的第二 NIR參比測量而進(jìn)一步改進(jìn)。
[0049]可溢流氣泡捕捉器改進(jìn)梯度形成和除氣功能。這可例如如下實現(xiàn):
[0050]-氣泡捕捉器中的可見除氣和氣泡從體系中的脫除；
[0051]-混合回路中改進(jìn)的梯度形成(第一NIR測量的信號)。
[0052]連同可溢流氣泡捕捉器，在色譜柱以后的第二 NIR測量可或者使得可:
[0053]-檢查混合回路中形成的梯度到柱上的轉(zhuǎn)移性；該功能與混合回路的操作模式或體系的設(shè)計無關(guān)；
[0054]-各尺寸中梯度的最佳調(diào)節(jié)。
[0055]NIR參比測量的其它功能，即體系和柱質(zhì)量的檢查(彼此獨立地)與可溢流氣泡捕捉器無關(guān)。
[0056]氣泡捕捉器與混合回路的分開能夠使比通過主泵進(jìn)入柱的更多的體積流通并通過氣泡捕捉器排出。在這種情況下，氣泡捕捉器溢流，不僅排出氣體，而且排出一部分混合洗脫液量。該操作模式例如在非常陡或復(fù)雜的梯度的情況下是需要的，其需要通過氣泡捕捉器的快速流通以尤其有效地排出形成的氣體量。這導(dǎo)致梯度的形成，因為它們已程序化和/或梯度的更穩(wěn)定和定性改進(jìn)過程。氣泡捕捉器的溢流可用于梯度的傳遞而不具有大的調(diào)節(jié)(1:1)，在體系的增規(guī)模或減規(guī)模的情況下，或者通常改進(jìn)梯度質(zhì)量。[0057]該技術(shù)方面原則上與在色譜柱下游的第二 NIR測量無關(guān)。體系調(diào)節(jié)和體系可靠性可通過第二 NIR參比測量進(jìn)一步改進(jìn)。
[0058]IOcm直徑色譜柱的色譜圖顯示于圖1中，其中看出有缺點的分離梯度的過程。這產(chǎn)生工藝過程的偏離。該信號使用混合回路中的NIR測量產(chǎn)生。
[0059]在圖13中15cm直徑HPLC柱的三個梯度時程顯示于左邊，且IOcm直徑HPLC柱的三個梯度時程顯示于右邊，其在常規(guī)體系中得到。不可再現(xiàn)和可變梯度時程和乙腈的打開程度在兩個尺寸中是明顯的。這些信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0060]IOcm直徑色譜柱的色譜圖顯示于圖2中，其上顯示出在氣泡捕捉器打開和容許它溢流以后分離梯度的時程。該時程是良好且可再現(xiàn)的。該信號以混合回路中的NIR測量產(chǎn)生。
[0061]圖5顯示IOcm直徑色譜柱的色譜圖，其上看出有缺陷再生梯度峰的時程。梯度峰不是尖銳執(zhí)行的。該信號以混合回路中的NIR測量產(chǎn)生。
[0062]IOcm直徑色譜柱的色譜圖顯示于圖4中，其上顯示出在氣泡捕捉器打開和容許它溢流以后再生梯度的時程。該梯度峰確切且可再現(xiàn)性地執(zhí)行。該信號僅以混合回路中的NIR測量產(chǎn)生。
[0063]此外，非常有效的除氣效果通過由急劇地壓降而產(chǎn)生的氣泡捕捉器打開而實現(xiàn)。
[0064]提供以下實施例和圖以闡述本發(fā)明的主題，保護(hù)性范圍由所附專利申請書限定。顯然可不偏離本發(fā)明的主題而做出對所公開方法的主題的改進(jìn)。
[0065]圖1顯示IOcm HPLC色譜柱的色譜圖，其中顯示有缺陷分離梯度的時程。這導(dǎo)致工藝過程由于變化而偏離。該信號以混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0066]圖2顯示IOcm直徑HPLC-色譜柱的色譜圖，其上顯示出在打開氣泡捕捉器并容許它溢流以后分離梯度的時程。該時程是可再現(xiàn)的且不含變化。該信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0067]圖3顯示在混合回路中的氣泡捕捉器打開并使其溢流以后IOcm和15cm直徑HPLC-色譜柱的疊加梯度。兩個時程是相當(dāng)?shù)摹⒖稍佻F(xiàn)的且具有少許波動(或者至少部分地不含波動)。該信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0068]圖4顯示10直徑HPLC-色譜柱的色譜圖，其上顯示出如本發(fā)明所述在打開氣泡捕捉器并使它溢流以后再生梯度的時程。梯度峰可再現(xiàn)性地執(zhí)行。該信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0069]IOcm直徑色譜柱的色譜圖顯示于圖5中，其上顯示出有缺陷再生梯度的時程。梯度峰不是良好執(zhí)行的。該色譜圖在非根據(jù)本發(fā)明操作的HPLC體系上產(chǎn)生。信號以即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0070]完整15cm直徑HPLC柱的再生色譜圖顯示于圖6中。所有三個梯度峰不顯示出扭曲，且是非常相當(dāng)?shù)?，這表明完整的柱填料。這隨后通過常規(guī)方法證明。該信號以位于主泵下游且在柱下游的NIR測量產(chǎn)生。
[0071]圖7顯示有缺陷15cm直徑HPLC柱的再生色譜圖。清楚地顯現(xiàn)出由于柱填料中的裂紋而導(dǎo)致的第一梯度峰的上行側(cè)翼扭曲。在第二梯度峰的NIR信號中也看出扭曲。因此可見的柱缺陷隨后通過填充質(zhì)量的常規(guī)測定通過板數(shù)目測定和柱基體的檢查而證明。該信號以位于主泵下游且在柱下游的NIR測量產(chǎn)生。[0072]圖8顯示有缺陷30cm直徑HPLC柱的再生色譜圖。在這種情況下，看出梯度峰的扭曲，這表明柱缺陷。柱缺陷通過常規(guī)方法和柱基體的檢查而證明。該信號以位于主泵下游且在柱下游的NIR測量產(chǎn)生。
[0073]圖9顯示在注入HPLC柱上以前的溶劑脈沖的NIR信號。該峰的陡且非變形側(cè)翼是明顯的。該信號以位于主泵下游且在柱下游的NIR測量產(chǎn)生。
[0074]溶劑峰(參見圖9中的理想峰)在它通過受損柱填料以后顯示于圖10中。清楚地看出由于柱填料中的缺陷而導(dǎo)致的峰的兩個側(cè)翼扭曲。有缺陷填充質(zhì)量通過常規(guī)方法證明。該信號以位于主泵下游且在柱下游的NIR測量產(chǎn)生。
[0075]在圖11中，IOcm直徑HPLC柱的三個梯度時程顯示于左邊，其在非根據(jù)本發(fā)明改性的體系中得到?？汕宄乜闯鲆译骈y的打開程度波動，其在一些情況下是相當(dāng)?shù)?，因此還有梯度的那些。右邊的兩個時程在本發(fā)明意義上重配置，即具有分開且溢流氣泡捕捉器的體系中得到。清楚地看出非常可再現(xiàn)的梯度時程和乙腈閥的打開程度而不具有明顯的波動。這些信號僅以混合回路中的NIR測量產(chǎn)生。
[0076]在圖12中，15cm直徑HPLC柱的三個梯度時程顯示于左邊，其以常規(guī)體系得到。在這種情況下，看出乙腈閥打開程度的波動，其在一些情況下是相當(dāng)?shù)?，因此還具有梯度，其比IOcm尺寸的那些更小。右邊的兩個時程在根據(jù)本發(fā)明重配置，即具有分開和溢流氣泡捕捉器的體系中得到。清楚地看出非?？稍佻F(xiàn)的梯度時程和乙腈閥的打開程度而不具有波動。這些信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0077]在圖13中，15cm直徑HPLC柱的三個梯度時程顯示于左邊，IOcm直徑HPLC柱的三個梯度時程顯示于右邊，其在常規(guī)體系中得到。以兩個尺寸，清楚地看出不可再現(xiàn)且變化的梯度時程和乙腈閥的打開程度。這些信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0078]在圖14中，15cm直徑HPLC柱的兩個梯度時程顯示于左邊，IOcm直徑HPLC柱的兩個梯度時程顯示于右邊，其在根據(jù)本發(fā)明，即具有與混合回路分開且溢流的氣泡捕捉器的體系中得到。以兩個尺寸，看出可再現(xiàn)且?guī)缀跸嗤奶荻葧r程和乙腈閥的打開程度。這些信號以在混合回路中，即在柱上游的NIR測量產(chǎn)生。
[0079]在圖15中看出記錄于Akta HPLC體系上的兩個不同梯度時程。信號AKTA由用于使體系程序化的梯度泵的性能數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)移而形成。在設(shè)計和尺寸方面相當(dāng)?shù)夭煌贏kta-HPLC體系的制備HPLC體系的NIR程序化值用作使不能用NIR值程序化的
iikta-HPLC體系程序化的基礎(chǔ)。將又kta-HPLC體系上兩個梯度的時程，在一種情
況下梯度泵的性能數(shù)據(jù)，在一種情況下混合室以后實際測量的NlR值考慮共同起點繪圖并顯示于圖中?？闯鰞蓚€梯度的時程中相當(dāng)?shù)牟?，但根?jù)程序化應(yīng)產(chǎn)生相同的時程。該圖顯示具有不同設(shè)計和尺寸的體系之間梯度的轉(zhuǎn)移不是直接可能的，而不具有偏離，如果技術(shù)人員不使用或考錄混合回路或混合室下游的另外NIR信號。
[0080]以人kta-HPLC體系產(chǎn)生的疊加色譜圖顯示于圖16中。清楚地看出具有不同的寬度和形狀的兩個峰。這些峰在考慮在體系的混合室下游的實際NIR測量以前和以后以兩個不同程序化的梯度形成。在人kta梯度的校正(適于生產(chǎn)體系)以后實現(xiàn)操作體系和又kta-HPlC體系的分離時程的更好地一致和轉(zhuǎn)移性。[0081]裝配有加壓氣泡捕捉器的常規(guī)制備HPLC體系的示意圖顯示于圖17中。在氣泡捕捉器與混合回路之間不存在關(guān)閉裝置(閥)。不能將氣泡捕捉器中的料流分流或者將洗脫液除氣。也不能同樣地執(zhí)行不同尺寸中運行的梯度。混合回路中的循環(huán)速率是恒定的。該體系僅具有位于混合回路中的一個NIR測量。因此，不能在線檢查柱和梯度質(zhì)量。
[0082] 圖18顯示根據(jù)本發(fā)明改進(jìn)的制備HPLC體系的示意圖，其裝配有與混合回路分開且不在壓力下或者可在比混合回路中存在的低得多的壓力下操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)可任選安裝在氣泡捕捉器的上部出口處。可將料流在氣泡捕捉器中分流并在那里進(jìn)行洗脫液的除氣。也可運行在不同柱尺寸中行進(jìn)的相同梯度。可變化地調(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，一個在混合回路中，且一個在主泵下游。在柱旁通模式中可在線檢查柱質(zhì)量以及梯度質(zhì)量。
[0083]常規(guī)制備HPLC體系的示意圖顯示于圖19中，其具有在壓力下且結(jié)合到混合回路中的氣泡捕捉器。氣泡捕捉器與混合回路之間不存在關(guān)閉裝置。既不能分流氣泡捕捉器中的料流，也不能將洗脫液除氣，也不能同樣地運行在不同尺寸中行進(jìn)的梯度?；旌匣芈分械难h(huán)速率是恒定的。體系僅具有位于混合回路中的一個NIR測量點。不能在線檢查柱和梯度質(zhì)里!。
[0084]在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系的實例顯示于圖20中，其具有與混合回路分開且可不加壓而操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間。該實施例為設(shè)計體系的最大尺寸。因此，僅洗脫液的除氣在氣泡捕捉器中進(jìn)行。不需要將料流分流，但它任選是可能的?；旌匣芈分械难h(huán)速率可以以靈活的方式調(diào)節(jié)。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。
[0085]在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系的實例顯示于圖21中，其具有與混合回路分開且可不加壓而操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間。在這種情況下，它是中間工藝變化方案，這意指洗脫液的除氣以及料流分流在氣泡捕捉器中進(jìn)行。料流分流確保也用于最大尺寸中的梯度(參見圖21)以相同的方式進(jìn)行。通向柱且通過氣泡捕捉器離開體系的料流之和與最大尺寸的工藝料流相同?？勺兓卣{(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。
[0086]在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系的實例顯示于圖22中，其具有與混合回路分開且可不加壓而操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間。在這種情況下，它是最小工藝變化方案，這意指洗脫液的除氣以及料流分流在氣泡捕捉器中進(jìn)行。料流分流確保也用于最大和中間尺寸中的梯度可以相同地進(jìn)行。通向柱且經(jīng)由氣泡捕捉器離開體系的料流之和等于最大尺寸的工藝料流?？勺兓卣{(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。
[0087]圖23顯示使用在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系設(shè)置最佳梯度時程的程序的實例，所述體系具有與混合回路分開并可不在壓力下操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間?？梢砸造`活的方式調(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。該圖闡述設(shè)置最佳梯度中的第一步驟是調(diào)節(jié)校正混合回路和緩沖劑供應(yīng)區(qū)域中所有所需參數(shù)。當(dāng)混合回路中進(jìn)行的NIR測量反映出該位置上梯度的最佳目標(biāo)狀態(tài)時，成功地調(diào)節(jié)參數(shù)。在這種情況下，調(diào)節(jié)參數(shù)尤其是如下:緩沖容器的壓力疊加和混合回路中最佳循環(huán)速率的調(diào)節(jié)。
[0088]圖24顯示使用在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系設(shè)置最佳梯度時程的程序的實例，所述體系具有與混合回路分離并可不在壓力下操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間?？梢砸钥勺兊姆绞秸{(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。該圖闡述調(diào)節(jié)最佳梯度中的第二步驟是在將校正料流尺寸從體系的主泵中取出以后用第二下游NIR測量校準(zhǔn)。在這種情況下，兩個梯度之間相當(dāng)?shù)牟钍敲黠@的，其必須通過調(diào)節(jié)措施消除。
[0089]圖25顯示使用在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系設(shè)置最佳梯度時程的程序的實例，所述體系具有與混合回路分離并可不在壓力下操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間?？梢砸钥勺兊姆绞秸{(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。該圖闡述調(diào)節(jié)最佳梯度中的下一步驟包括以下措施:例如借助位于氣泡捕捉器與混合回路之間的可調(diào)節(jié)閥最佳地調(diào)節(jié)從混合回路中取出的量，經(jīng)由在其最高點的氣泡捕捉器最佳地調(diào)節(jié)離開體系的流量，和一般性地檢查所有體系組件。
[0090]圖26顯示使用在本發(fā)明意義上改進(jìn)的制備HPLC體系設(shè)置和連續(xù)監(jiān)控最佳梯度時程的程序的實例，所述體系具有與混合回路分離并可不在壓力下操作的氣泡捕捉器?？烧{(diào)節(jié)關(guān)閉裝置(例如閥)位于氣泡捕捉器與混合回路之間。可以以可變的方式調(diào)節(jié)混合回路中的循環(huán)速率。體系具有兩個NIR測量位置，其中一個位于混合回路中，另一個位于主泵下游。因此，可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。該圖闡述在成功地設(shè)置所有體系參數(shù)以后，在混合回路中和在主泵下游檢測到的兩個梯度是相同的。當(dāng)達(dá)到該狀態(tài)時，調(diào)節(jié)方法完成且測定的值可用于固定地使體系程序化。從此時向前，通過另一 NIR測量以柱旁通模式連續(xù)地監(jiān)控梯度的質(zhì)量。為此，試驗每隔一定時間進(jìn)行不具有柱或以柱旁通模式進(jìn)行。這確保體系對所用HPLC柱無不利影響。同樣快速檢測到偏離并可消除。
[0091]圖27顯示使用具有在主泵下游的第二 NIR測量的HPLC體系檢查所用HPLC柱的質(zhì)量的程序的實例。該另一 NIR測量可通過在柱上游或柱下游的合適旁路進(jìn)行。第一 NIR測量在主泵上游進(jìn)行。因此可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。該圖闡述檢測柱質(zhì)量中的第一步驟是檢測影響柱下游的柱質(zhì)量的梯度時程。柱的梯度或可控時程的重要性本身可例如表現(xiàn)在柱上梯度期間發(fā)生的特壓波動中。其它影響因素為由于柱基體中的緩沖劑組合物以及溫度變化而可發(fā)生的氣體排放。另外，發(fā)現(xiàn)具有特別陡的斜坡段的梯度最適于評估HPLC柱的填充質(zhì)量。通常，在產(chǎn)物分離以前的柱再生為該關(guān)鍵步驟。同時存在這一風(fēng)險:再生期間形成的可能柱缺陷在分離以前保持未檢測到，這可對分離過程具有非常負(fù)面的結(jié)果。
[0092]圖28顯示使用具有在主泵下游的第二 NIR測量的HPLC體系檢查所用HPLC柱的質(zhì)量的程序的實例。該另一 NIR測量可通過在柱上游或柱下游的合適旁路進(jìn)行。第一 NIR測量在主泵上游進(jìn)行。因此可在線檢查柱和梯度質(zhì)量。該圖闡述如何在匹配兩個梯度(在柱上游和在柱下游)的方法中如何可得到有缺陷柱的指示。兩個梯度時程的差得到該指示。推斷出該結(jié)論的前提條件如下:
[0093].柱上游的梯度時程是不顯著的，即梯度體系極好地作用且極好的梯度轉(zhuǎn)移至柱上。用于識別和實現(xiàn)該狀態(tài)的程序描述于上文中(參見圖23-26)。
[0094].在懷疑的情況下，必須首先進(jìn)行體系檢查。
[0095].如果體系影響不造成柱下游的梯度時程的異常，則技術(shù)人員必須尋求有缺陷填充的原因。對HPLC柱的多數(shù)損害是由于裂縫形成，其是由方法中常見的高壓導(dǎo)致的。柱填料上的應(yīng)變是巨大的，因為將材料連續(xù)地壓縮和松弛。在柱壁領(lǐng)域中優(yōu)先發(fā)生的裂紋形成以后，發(fā)生柱填料的不均勻分布和至柱上的不均勻料流。該行為是由于液體總是選擇最小阻力的路徑這一事實。在其中形成裂紋的柱中，優(yōu)選灌注柱填料的受損面積，因為以這種方式，液體可在最短的路線上離開柱并可釋放張力。該行為通過柱上游的NIR檢測器可見，在緩沖劑組合物快速交換的情況下特別如此。如果在柱上游的緩沖劑組合物變化的情況下，柱下游的信號變化可比柱的所謂死體積導(dǎo)致的延遲更快地檢測到，這是有缺陷柱填料的指示。此外，在損害柱以后記錄的梯度時程通常是不可再現(xiàn)且不規(guī)則的，因為受損HPLC柱填料中的條件是非常不穩(wěn)定的，且損害快速地擴(kuò)散。
[0096]圖29顯示所用HPLC柱的質(zhì)量的程序的實例。該檢查通過進(jìn)行所謂的板數(shù)測定(HETP)而進(jìn)行。在該試驗中，產(chǎn)生和評估一個或多個UV峰。必須確保用于進(jìn)行試驗的UV活性物質(zhì)在下一產(chǎn)物應(yīng)用以前完全除去以不削弱產(chǎn)物質(zhì)量。因此，在該試驗以后通常必須進(jìn)行再生，如關(guān)于圖27和28已描述的，其代表柱的特定應(yīng)變。試驗方法本身還向柱施加聞應(yīng)力是常見的。不能進(jìn)行產(chǎn)物施用和后續(xù)分離直至柱再生。
實施例
[0097]實施例1
[0098]具有不同設(shè)計和尺寸的HPLC體系中的梯度時程差
[0099]iikta-HPLC:體系的梯度僅通過泵的規(guī)定輸送體積控制，但不考慮實際梯度時程。也不考慮體積收縮效應(yīng)。
[0100]較大生產(chǎn)尺寸中的工藝涉及借助NIR檢測器調(diào)節(jié)緩沖劑組合物，因此測量并調(diào)節(jié)實際緩沖劑組合物(梯度)。
[0101]緩沖劑直接在混合室下游經(jīng)由導(dǎo)電率測量池傳至NIR檢測器中，同時繞過常用環(huán)形閥。因為大的管道橫截面，必須將流速提高至60ml/min以具有相當(dāng)?shù)牧鲃訔l件。緩沖劑A和B的組成在兩個色譜法中是相同的。
[0102]運行先前所用分離程序的梯度，同時通過NIR檢測器記錄數(shù)據(jù)。來自人kta色譜法
的兩個梯度值(梯度泵的輸送速率)，并將在；ikta體系的混合室下游試劑測量的NIR信號
繪于Excel圖(圖15)中，同時考慮共同的起點。測定兩個梯度之間的差，并通過該量來校正程序(圖16)(還參見附圖描述)。
[0103]Akta體系上的老梯度在第一步驟中，即在已進(jìn)行洗脫的一部分中更陡。因此，峰寬度與新梯度相比更小。又kta運程中的收率比制備運程中更高，這表明分離的不同過程以及因此不同的分離結(jié)果。
[0104]借助第二下游NIR測量最佳化的梯度現(xiàn)在于生產(chǎn)體系與人kta之間的梯度轉(zhuǎn)移
中產(chǎn)生更好的一致性(也參見附圖15和16的描述)。
[0105]實施例2
[0106]通過與混合回路分開的氣泡捕捉器排出的洗脫液量
[0107]可溢流氣泡捕捉器的使用容許除排出的氣體外，將過量洗脫液從體系中除去。由于體系的尺寸根據(jù)最大柱尺寸操作，排出的過量取決于所用流速以及因此所用柱直徑。
[0108]當(dāng)使用具有30cm直徑的柱時，流速為162升/小時。完全填充可溢流氣泡捕捉器。必須將氣體以及僅少量過量洗脫液從體系中除去(圖20)。
[0109]當(dāng)使用具有15cm直徑的柱時，流速為40.5升/小時。完全填充可溢流氣泡捕捉器。必須將氣體以及121.5L過量洗脫液從體系中除去(圖21)。
[0110]當(dāng)使用具有IOcm直徑的柱時，流速為18升/小時。完全填充可溢流氣泡捕捉器。必須將氣體以及154L過量洗脫液從體系中除去(圖22)。
[0111]在混合回路中的氣泡捕捉器打開和溢流以后，IOcm和15cm直徑色譜柱的疊加梯度顯示于圖3中。兩個曲線是絕對相當(dāng)?shù)摹?br> 【權(quán)利要求】
1.包含混合回路或混合室、氣泡捕捉器、濃度檢測器和一個或多個泵的色譜體系，其特征在于氣泡捕捉器具有在最高點的固定開口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的色譜體系，其特征在于氣泡捕捉器位于混合回路或混合室外部或下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的色譜體系，其特征在于氣泡捕捉器的入流是可調(diào)節(jié)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的色譜體系，其特征在于調(diào)節(jié)借助閥進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的色譜體系，其特征在于氣泡捕捉器位于混合回路或混合室之內(nèi)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的色譜體系，其特征在于可以調(diào)節(jié)通過固定開口的體積流量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的色譜體系，其特征在于調(diào)節(jié)通過閥進(jìn)行。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的色譜體系，其特征在于第一體積流量測量裝置位于固定開口下游且第二體積流量測量裝置位于柱之后。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的色譜體系，其特征在于它包含在主泵下游的第二濃度檢測器。
10.色譜體系，其特征在于它包含兩個濃度檢測器，其中第一個位于混合回路或混合室中，且第二個位于主泵下游。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的色譜體系，其特征在于色譜柱位于主泵與第二濃度檢測器之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的色譜體系，其特征在于第二濃度檢測器位于主泵之后且位于色譜柱之后。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的色譜體系在檢查整個色譜體系效率中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的色譜體系在檢查色譜柱完整性中的用途。
15.第一濃度檢測器的信號與第二濃度檢測器的信號之比在控制色譜體系中的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的色譜體系，其特征在于混合回路中的體積流量可以變化地調(diào)節(jié)。
【文檔編號】G01N30/32GK103946705SQ201280055088
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月10日
【發(fā)明者】A·布拉什克, D·德韋卡, C·施馬爾茲 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司