制備視網膜組織和視網膜相關細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供[1]制備視網膜組織的方法，所述方法包括以下步驟(1)至(3)：(1)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體，(2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將在第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，和(3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將在第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)；[2]制備視杯樣結構的方法，所述方法包括以下步驟：在各自含有作用于Sonic?hedgehog信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，對在以上步驟(3)中培養(yǎng)的含有視網膜組織的聚集體進行漂浮培養(yǎng)；[3]制備視網膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步驟：在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中所述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic?hedgehog信號途徑的物質)，將在以上步驟(3)中培養(yǎng)的含有視網膜組織的聚集體進行漂浮培養(yǎng)；以及[4]制備視網膜層特異性神經細胞的方法，所述方法包括使包含在來源于靈長類多能干細胞的視網膜組織中的視網膜先祖細胞接觸抑制Notch信號途徑的物質。
【專利說明】制備視網膜組織和視網膜相關細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及制備視網膜組織以及視網膜相關細胞如視網膜層特異性神經細胞、視網膜色素上皮等的方法。
【背景技術】
[0002]中樞神經系統(tǒng)組織如腦和視網膜具有低的再生能力并且損傷的組織幾乎不會自然地恢復。因此，預期移植治療用的分化自多能干細胞的細胞的再生醫(yī)學是戰(zhàn)勝難治性疾病的最后一張牌。此外，通過自多能干細胞的分化獲得的人源細胞被認為能夠精確地評估化學物質對人的作用，并且朝向應用于化合物的毒性評估和藥物發(fā)現(xiàn)的研究和開發(fā)正在進行中。 [0003]視網膜是重要的感覺組織，其接收光，將其轉化為電信號并且，在信息處理后，經由軸突將所述信息傳遞至大腦的視覺中樞。視網膜主要由在彼此之上疊加的兩種內部和外部上皮組織構成。內部是神經視網膜，其接收光并處理信息，并且包含超過一種類型的細胞如光感受器。外部是視網膜色素上皮，其是支持光感受器的存活和功能的單層細胞片。
[0004]已有已知的從多能干細胞制備構成神經視網膜的視網膜層特異性神經細胞(光感受器，水平細胞，無長突細胞，神經節(jié)細胞等)的報道(專利文獻I)。此外，作為由多能干細胞制備三維視網膜組織的方法，描述的是，視網膜先祖組織、視杯樣結構和多層神經視網膜組織可以在體外通過以下方式制備:在無血清培養(yǎng)基中形成均質的多能干細胞聚集體并且在基膜制備物存在下將其進行漂浮培養(yǎng)(非專利文獻I和專利文獻2)。
[0005]另一方面，關于通過使用多能干細胞制備視網膜色素上皮的報道也是已知的(非專利文獻2)。然而，沒有關于高效地制備視網膜色素上皮的報道。
[0006][文獻列表]
[0007][專利文獻]
[0008]專利文獻1:W02008/087917
[0009]專利文獻2:W02011/055855
[0010][非專利文獻]
[0011]非專利文獻1:Mototsugu Eiraku, Nozomu Takata, Hiroki Ishibashi, MasakoKawadaj Eriko SakakurajSatoru Okudaj Kiyotoshi Sekiguchij Taiji Adachi & YoshikiSasai (2011)Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensionalculture (三維培養(yǎng)中的自組織視杯形態(tài)發(fā)生).Nature，卷:472，頁碼:51-56
[0012]非專利文獻2:Maria Idelson，Ruslana Alper，Alexey Obolensky，EttiBen-Shushanj Itzhak Hemo，Nurit Yachimovich-CohenjHanita Khanerj Yoav Smith, OferWiser, Michal Gropp，Malkiel A.Cohen, Sharona Even-Ramj Yael Berman-Zakenj LimorMatzrafi，Gideon Rechavij Eyal Banin 和 Benjamin Reubinoff(2009)DirectedDifferentiation of HumanEmbryonic Stem Cells into Functional Retinal PigmentEpithelium Cells(人胚胎干細胞直接分化為功能性視網膜色素上皮細胞).Cell StemCell5, 396-408
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明要解決的問題
[0015]需要高效地制備視網膜組織、視杯樣結構和視網膜層特異性神經細胞以及視網膜色素上皮的的方法。
[0016]解決問題的手段
[0017]在此種情況下本發(fā)明的發(fā)明人進行了大量研究并且獲得了本發(fā)明。
[0018]因此,本發(fā)明如下。
[0019][1]制備視網膜組織的方法，包括以下步驟(1)至(3):
[0020](1)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體，
[0021](2)第二步,在含有基膜制備物(basement membrane preparation)的無血清培養(yǎng)基中將第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，和
[0022](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
[0023][2]制備視杯樣結構的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Sonichedgehog (下文中，有時也稱作“Shh” )信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，將通過前述[I]的方法獲得的視網膜組織進行漂浮培養(yǎng)。
[0024][3]制備視網膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中前述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic hedgehog(下文中，有時也稱作“Shh”)信號途徑的物質)，將通過前述[I]的方法獲得的視網膜組織進行漂浮培養(yǎng)。
[0025][4]前述[3]的方法，其中前述含有作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基還包含作用于激活蛋白(Activin)信號途徑的物質。
[0026][5]前述[I]至[4]中任一項的方法，其中前述多能干細胞是靈長類多能干細胞。
[0027][6]前述[I]至[4]中任一項的方法，其中前述多能干細胞是人多能干細胞。
[0028][7]前述[I]至[6]中任一項的方法，其中前述基膜制備物是至少一種選自由以下組成的組的細胞外基質分子:層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。
[0029][8]前述[I]至[7]中任一項的方法，其中前述第一步至第三步在敲除血清置換物(Knockout serum replacement)(下文中，有時也稱作“KSR”)存在下進行。
[0030][9]制備視網膜層特異性神經細胞的方法，所述方法包括使包含在來源于靈長類多能干細胞的視網膜組織中的視網膜先祖細胞接觸抑制Notch信號途徑的物質。
[0031][10]前述[9]的方法，其中前述抑制Notch信號途徑的物質是Y分泌酶活性抑制物質。
[0032][11]前述[9]或[10]的方法，其中前述抑制Notch信號途徑的物質是N-[N-(3, 5- 二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(下文中，有時也稱作“DAPT”)。
[0033][12]前述[9]至[11]中任一項的方法，其中前述靈長類是人。[0034][13]前述[9]至[12]中任一項的方法，其中所述視網膜層特異性神經細胞是光感受器。
[0035][14]前述[9]至[12]中任一項的方法，其中所述視網膜層特異性神經細胞是神經節(jié)細胞。
[0036][15]前述[9]至[14]中任一項的方法，其中所述包含在來源于靈長類多能干細胞的視網膜組織中的視網膜先祖細胞是包含在通過以下步驟制備的視網膜組織中的視網膜先祖細胞:
[0037](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將靈長類多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成靈長類多能干細胞的聚集體，
[0038](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，
[0039](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，
[0040](4)第四步,在各自含有作用于Sonic hedgehog(下文中，有時也稱作“Shh”)信號途徑的物質和作用于fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中將第三步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，以形成視杯樣結構，和
[0041](5)將第四步中形成的視杯樣結構進行漂浮培養(yǎng)的步驟。 [0042][16]用于評估毒性或藥物效力的試劑，所述試劑包含通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮或視網膜層特異性神經細胞。
[0043][17]用于評估測試物質的毒性或藥物效力的方法，所述方法包括使通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮或視網膜層特異性神經細胞接觸所述測試物質，并且檢查所述物質對所述組織、結構或細胞的影響。
[0044][18]用于由視網膜組織的紊亂所致的疾病的治療劑，所述治療劑包含通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮或視網膜層特異性神經細胞。
[0045][19]用于治療由視網膜組織的紊亂所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮或視網膜層特異性神經細胞至需要所述移植的靶標。
[0046][20]通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮或視網膜層特異性神經細胞，其用于治療由視網膜組織的紊亂所致的疾病。
[0047]發(fā)明效果
[0048]根據本發(fā)明，可以高效地制備視網膜組織、視杯樣結構、視網膜層特異性神經細胞或視網膜色素上皮。因此，考慮到有效提供視網膜組織、視杯樣結構、視網膜層特異性神經細胞或視網膜色素上皮以用于化學物質等的毒性或藥物效力評估、移植治療等，本發(fā)明是高度有用的。
[0049]附圖簡述
[0050]圖1是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第25天，通過僅添加Matrigel (下文中，有時也稱作Matrigel)和不添加抑制Wnt信號途徑的物質制備的人多能干細胞來源的聚集體的明視場圖像(A)和熒光圖像(B)，在自開始漂浮培養(yǎng)起第25天，通過添加抑制Nodal信號途徑的物質和Matrigel制備的人多能干細胞來源的聚集體的明視場圖像(C)和熒光圖像(D)，以及在自開始漂浮培養(yǎng)起第25天，通過添加抑制Wnt信號途徑的物質和Matrigel制備的人多能干細胞來源的聚集體的明視場圖像(E)和熒光圖像(F)。
[0051]圖2是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過添加抑制Wnt信號途徑的物質漂浮培養(yǎng)人多能干細胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞以及在不存在胎牛血清的情況下另外漂浮培養(yǎng)人多能干細胞制備的聚集體的明視場圖像(A)和熒光圖像(B)，在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過添加抑制Wnt信號途徑的物質漂浮培養(yǎng)人多能干細胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞以及在胎牛血清存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞制備的聚集體的明視場圖像(C)和熒光圖像(D)，以及在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過添加抑制fct信號途徑的物質漂浮培養(yǎng)人多能干細胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞以及另外在胎牛血清和作用于Sonic hedgehog(下文中，有時也稱作“Shh”)信號途徑的物質存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞制備的聚集體的明視場圖像(E)和熒光圖像(F)。
[0052]圖3顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天構成聚集體的表達GFP的細胞的FACS直方圖(A)，所述聚集體是通過添加抑制Wnt信號途徑的物質漂浮培養(yǎng)人多能干細胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞以及另外在不存在胎牛血清的情況下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞制備的；在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天構成聚集體的表達GFP的細胞的FACS直方圖(B)，所述聚集體是通過添加抑制fct信號途徑的物質漂浮培養(yǎng)人多能干細胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞以及另外在胎牛血清存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞制備的；在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天構成聚集體的表達GFP的細胞的FACS直方圖(C)，所述聚集體是通過添加抑制Wnt信號途徑的物質漂浮培養(yǎng)人多能干細胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞以及在胎牛血清和抑制Shh信號途徑的物質存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細胞制備的；并且圖(D)顯示GFP強陽性細胞的比例，所述GFP強陽性細胞是視網膜先祖細胞。
[0053]圖4是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第60天免疫染色視網膜組織(A，B，C)和在自開始漂浮培養(yǎng)起第126天免疫染色視網膜組織(D，E，F(xiàn)，G，H，I)的結果，所述視網膜組織是通過本發(fā)明的視網膜組織的制備方法制備的。
[0054]圖5是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第14天(A)，第15天(B)，第16天(C)，第17天(D)通過本發(fā)明的視杯樣結構的制備方法獲得的聚集體的同一部分的明視場和熒光圖像的重疊的圖像。
[0055]圖6是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第24至26天通過本發(fā)明的視杯樣結構的制備方法獲得的漂浮培養(yǎng)的聚集體的通過顯微鏡觀察的明視場圖像(A)和熒光圖像(B)，和雙光子顯微鏡觀察圖像(C)和獲得自雙光子顯微鏡觀察圖像的3D重構圖像Φ)。
[0056]圖7是這樣的視圖，其顯示利用抗-Mitf抗體和抗-ChxlO抗體，通過本發(fā)明的視杯樣結構的制備方法的漂浮培養(yǎng)制備的視杯樣結構的冷凍切片的免疫染色的結果。
[0057]圖8是這樣的視圖，其顯示在不添加10 μ M DAPT的條件下開始漂浮培養(yǎng)，漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第41天的情況中的熒光顯微鏡(A)，在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第41天的情況中的熒光顯微鏡(B)，在不添加10 μ M DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第43天的情況中的利用抗-恢復蛋白抗體(C)或抗-Brn3抗體(E)免疫染色的冷凍切片的照片，以及在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至分化誘導的第43天的情況中的利用抗-恢復蛋白抗體(D)或抗-Brn3抗體(F)免疫染色的冷凍切片的照片，其各自使用在自開始漂浮培養(yǎng)起第29天的Crx::GFP敲入人ES細胞來源的視網膜組織。
[0058]圖9是這樣的視圖，其顯示在不添加10 μ M DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的熒光顯微鏡(A)，在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的熒光顯微鏡(B)，在不添加10 μ M DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的利用抗-恢復蛋白抗體(C)或抗-Brn3抗體(E)免疫染色的冷凍切片的照片，以及在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)在自開始漂浮培養(yǎng)起第33天凍融視網膜組織后在自開始漂浮培養(yǎng)起第38天的Crx::GFP敲入人ES細胞來源的視網膜組織直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的利用抗-恢復蛋白抗體(D)或抗-Brn3抗體(F)免疫染色的冷凍切片的照片。
[0059]圖10是這樣的視圖，其顯示通過以下方式制備的聚集體的明視場:在含有抑制fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中進行漂浮培養(yǎng)以形成聚集體，在基膜制備物存在下在無血清培養(yǎng)基中漂浮培養(yǎng)形成的聚集體，在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體，并且在含有作用于fct信號途徑的物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體。
[0060]圖11是這樣的視圖，其顯示通過以下方式制備的聚集體的明視場:在含有抑制fct信號途徑的物質的無 血清培養(yǎng)基中進行漂浮培養(yǎng)以形成聚集體，在基膜制備物存在下在無血清培養(yǎng)基中漂浮培養(yǎng)形成的聚集體，在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體，并且在含有作用于fct信號途徑的物質和作用于激活蛋白A通路的物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體。
【具體實施方式】
[0061]以下詳細說明實施本發(fā)明的方式。
[0062]在本發(fā)明中，“轉化體”是指通過轉化產生的有生命的物質如細胞的全部或部分。轉化體的實例包括原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆蟲細胞等。根據靶標，轉化體有時也被稱為轉化細胞，轉化組織，轉化宿主等。用于本發(fā)明的細胞也可以是轉化體。
[0063]用于本發(fā)明中的遺傳改造技術的原核細胞的實例包括屬于埃希氏菌屬(genusEscherichia),沙雷氏菌屬(genus Serratia),芽抱桿菌屬(genus Bacillus),短桿菌屬(genus Brevibacterium)，棒桿菌屬(genus Corynebacterium),微桿菌屬(genusMicrobacterium),假單胞菌屬(genus Pseudomonas)等，如埃希氏菌 XLl-Blue,埃希氏菌XL2-Blue，和埃希氏菌DH1。這些細胞具體描述于，例如，Sambrook，J和Russell, D.W.的 “Molecular Cloning (分子克隆)(第 3 版)”,附錄 3 (卷 3), Vector and Bacterialstrains (載體和菌株).A3.2 (Cold Spring Harbor USA2001)。
[0064]本發(fā)明中的“載體”是指能夠將所需的多核苷酸序列轉移到目標細胞中的載體。這樣的載體的實例包括能夠在宿主細胞如原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆蟲細胞，動物個體和植物個體等中自主復制的那些，或能夠整合到染色體中并且在適于多核苷酸轉錄的位置處含有啟動子的那些。
[0065]在所述載體中，適于克隆的載體有時被稱為“克隆載體”。這樣的克隆載體通常具有含有多個限制酶位點的多個克隆位點。目前，有很多載體可用于相關領域中的基因克隆，并且它們被經銷商以不同的名稱銷售，因為它們稍有不同(例如，多克隆位點處的限制酶的種類和序列)。例如，代表的克隆載體描述于(經銷商也被描述)Sambix)0k，J和Russell, D.W.的 “Molecular Cloning (分子克隆)(第 3 版)”,附錄 3 (卷 3), Vector andBacterial strains (載體和菌株).A3.2 (Cold Spring Harbor USA2001),并且本領域普通技術人員可以根據目標適當地使用它們。
[0066]本發(fā)明中的“載體”還包括“表達載體”，“報告載體”，和“重組載體”。“表達載體”是指這樣的核酸序列，其中除了結構基因和啟動子以外的調節(jié)其表達的各種調節(jié)元件以這樣的方式連接以致它們在宿主中是可操作的?！罢{節(jié)元件”的實例包括終止子，選擇標記如藥物抗性基因，以及含有增強子的調節(jié)元件。本領域技術人員公知，使用的有生命的物質(例如，動物)的表達載體的類型和調節(jié)元件的類型可以根據宿主細胞而改變。
[0067]本發(fā)明中的“重組載體”的實例包括(a)用于基因組文庫篩選的λ FIX載體(噬菌體載體)，(b)用于cDNA篩選的λ ZAP載體(噬菌體載體)，和(c)用于克隆基因組DNA的pBluescript I I SK+/-, pGEM,和pCR2.1載體(質粒載體)。“表達載體”的實例包括pSV2/neo 載體,pcDNA 載體,pUC18 載體,pUC19 載體,pRc/RSV 載體,pLenti6/V5_Dest 載體,pAd/CMV/V5-DEST載體，pDON-A1-2/neo載體，和pME1-5/neo載體(質粒載體)等?！皥蟾孑d體”的實例包括pGL2載體，pGL3載體，pGL4.10載體，pGL4.11載體，pGL4.12載體，pGL4.70載體，pGL4.71 載體，pGL4.72 載體，pSLG 載體，pSLO 載體，pSLR 載體，pEGFP 載體，pAcGFP 載體,pDsRed載體等。根據前述Molecular Cloning (分子克隆)文獻可以適當地使用這些載體。
[0068]在本發(fā)明中，作為用于將核酸分子引入細胞中的技術，例如，可以提及轉化，轉導，轉染等。作為此種引入技術，可以具體提及例如，描述于AusubelF.A.等編輯(1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY ；SambrookJ.等(1987)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版和第 3 版；ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；特干丨J , ExperimentalMedicine “transgene&expression analysis experiment method，，Y0D0SHA C0., LTD., 1997等中的方法。作為用于確認基因的胞內引入的技術，可以提及RNA印跡分析，蛋白質印跡分析或其他公知的常規(guī)技術等。
[0069]在本發(fā)明中，“干細胞”是指甚至在細胞分化后仍保持相同分化能力的細胞，并且其組織可以在組織損傷時再生。此處，干細胞可以是胚胎干細胞(ES細胞)或組織干細胞(也被稱為組織的干細胞，組織特異性干細胞或體干細胞)，或人造的多能干細胞(iPS細胞:誘導的多能干細胞)，但不限于此。如從上述來源于干細胞的組織細胞可以再生組織的事實理解的，已知干細胞可以分化為與活體中的細胞接近的正常細胞。
[0070]干細胞可以獲得自給定的組織，或者也可以購買市售產品。例如，人胚胎干細胞，KhES-1, KhES-2 和 KhES-3 可獲得自 Kyoto University 的前沿醫(yī)學研究所(Institute forFrontier Medical Sciences)。小鼠胚胎干細胞EB5細胞可獲得自RIKEN，而D3細胞系可獲得自ATCC。
[0071]干細胞可以通過根據本身已知的方法培養(yǎng)來維持。例如，干細胞可以通過補充以胎牛血清(FCS)、敲除血清置換物(Knockout Serum Replacement, KSR)和LIF的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)來維持。
[0072]在本發(fā)明中，“多能干細胞”是指這樣的干細胞，其可以在體外培養(yǎng)并且有能力分化成構成除胎盤以外的活體的任何細胞(來源于三胚層(外胚層、中胚層、內胚層)的組織)(分化多能性)，其包括胚胎干細胞(ES細胞)?！岸嗄芨杉毎鲍@得自受精卵，克隆胚胎，再生干細胞，和組織中的干細胞。其還包括，在向體細胞中引入若干種基因后具有類似于胚胎干細胞的分化多能性的人工多能性的細胞(也被稱為人造多能干細胞)。多能干細胞可以通過本身已知的方法制備。制備方法的實例包括描述于Cell 131 (5)pp.861-872，Cell 126(4)pp.663-676 等中的方法。
[0073]在本發(fā)明中，“胚胎干細胞(ES細胞)”是指具有自身復制能力和多能性(即，“多能性”)的干細胞，其是源自早期胚胎的多能干細胞。胚胎干細胞首先建立于1981年，并且自1989年起已被應用于產生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干細胞，其也被用于再生醫(yī)學。
[0074]在本發(fā)明中，“人造多能干細胞”是指通過直接重編程分化的細胞如成纖維細胞等，通過表達若干種基因如0ct3/4、Sox2、Klf4和Myc被誘導而具有多能性的細胞，其在 2006 年由 Yamanaka 等在小鼠細胞中建立(Takahashi K, Yamanaka S.Cell.2006,126 (4)，p663-676)。在2007年，其也在人成纖維細胞中被建立，并且具有類似于胚胎干細胞的多倉泛性(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka
S.Cell.2007, 131 (5), p861_872.；Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-BourgetJ, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science.2007, 318(5858),pl917_1920.；Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, TakahashiK, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S.Nat Biotechnol., 2008，26(l)，pl01-106)。
[0075]遺傳修飾的多能干細胞可以例如使用同源重組技術制備。要被修飾以用于制備修飾的多能干細胞的染色體上的基因的實例包括組織相容性抗原基因，與由神經系統(tǒng)細胞的紊亂所致的疾病相關的基因等。染色體上的目標基因可以通過描述于Manipulatingthe Mouse Embryo, A Laboratory Manual (操縱小鼠胚胎，實驗室手冊)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1994) ；Gene Targeting,A Practical Approach (基因尋革巴，實用方法)，IRL Press, Oxford University Press (1993) ；Bio Manual 系列 8, genetargeting, Production of mutant mouse by using ES cells (基因尋革E，通過使用 ES細胞制備突變體小鼠)，Y0D0SHA C0.，LTD.(1995)等中的方法修飾。
[0076]具體地，例如，分離要修飾的靶基因的基因組基因(例如，組織相容性抗原基因、疾病相關基因等)，并且使用分離的基因組基因制備用于靶基因的同源重組的靶載體。將制備的靶載體引入干細胞中，并且選擇顯示靶基因和靶載體間的同源重組的細胞，由此可以制備在染色體上具有修飾的基因的干細胞。
[0077]作為用于分離靶基因的基因組基因的方法，可以提及描述于MolecularCloning, A Laboratory Manual (分子克隆，實驗室手冊)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學中的當前實驗方案)，John Wiley & Sons (1987-1997)等中的已知方法。此外，可以使用基因組DNA文庫篩選系統(tǒng)(由 Genome Systems 生產),Universal Genomeffalker Kits (由 CL0NTECH 生產)等分離靶基因的基因組基因。
[0078]根據描述于Gene Targeting, A Practical Approach (基因尋祀，實用方法)，IRLPress, Oxford University Press (1993) ；Bio Manual 系列 8, gene targeting, Productionof mutant mouse by using ES cells (基因尋革E，通過使用ES細胞制備突變體小鼠)，Y0D0SHA C0., LTD.(1995)等中的方法，可以制備用于靶基因的同源重組的靶載體，并且可以有效地選擇同源重組體。靶載體可以是任何置換類型和插入類型的，并且選擇方法可以是陽性選擇，啟動子選擇，陰性選擇，PolyA選擇等。
[0079]作為用于從選擇的細胞系中選擇目的同源重組體的方法，可以提及用于基因組DNA的Southern雜交法、PCR法等。
[0080]在本發(fā)明中，“組織”是指細胞群體的結構，其具有一定的構造，其中形狀和性質不同的超過一種類型的細胞在空間上被布置成特定的模式。
[0081]在本發(fā)明中，“視網膜組織”是指這樣的視網膜組織，其中構成活體視網膜中的相應的視網膜層的至少兩種以上類型的細胞如光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，視網膜神經節(jié)細胞，其前體細胞或其視網膜先祖細胞在空間上被布置成層。關于各細胞，哪種細胞構成哪個視網膜層可以通過已知方法確認，例如，細胞標記物的表達。
[0082]視網膜細胞標記物的實例包括，但不限于，Rax(視網膜的先祖細胞)，PAX6(先祖細胞)，巢蛋白(nestin)(其表達在下丘腦神經元的先祖細胞中而不表達在視網膜先祖細胞中)，Soxl (其表達在下丘腦神經上皮中但是不表達在視網膜中)，Crx(光感受器的前體細胞)等。特別 地，上述視網膜層特異性神經元的標記物的實例包括，但不限于，ChxlO (雙極細胞)，L7(雙極細胞)，Tujl (神經節(jié)細胞)，Brn3(神經節(jié)細胞)，鈣視網膜蛋白(Calretinin)(無長突細胞)，鈣結合蛋白(Calbindin)(水平細胞)，視紫紅質(Rhodopsin)(光感受器)，恢復蛋白(光感受器)，RPE65 (色素上皮)，Mitf (色素上皮)Nrl (視桿細胞)，Rxr- Y (視錐細胞)等。
[0083]在本發(fā)明中，“視杯樣結構”是指具有與胚胎發(fā)育過程中的視杯類似的形狀的結構。在胚胎發(fā)育過程中，視網膜的原基發(fā)育自間腦的側面，并且形成類似從間腦突出的囊。所述囊樣上皮結構被稱為視泡。視泡的最外部(未來將成為神經視網膜)逐漸向視泡內部凹入，并且形成視杯，視杯是由上皮的內外兩層構成的杯狀組織。視杯之后長大并且形成具有視網膜組織的視網膜。其是否是視杯樣結構可以由本領域普通技術人員通過利用顯微鏡、放大鏡等進行觀察來確認。
[0084]要在本發(fā)明中制備的視杯樣結構不僅顯示形態(tài)學上的視杯樣突起而且還顯示在構成視杯樣結構的細胞中的Rax的高頻表達，Rax是視網膜先祖細胞標記物。此外，視杯樣結構的外層還顯示表達Mitf的視網膜色素上皮的層，并且內層顯示構成視網膜組織的細胞，如表達ChxlO的視網膜先祖細胞。此種視杯樣結構非常類似活體發(fā)育中的視杯組織的結構。
[0085]本發(fā)明中的“視網膜層”是指構成視網膜的各層。其具體實例包括視網膜色素上皮層，光感受器層，外部限制膜，外部核層，外部叢狀層，內部核層，內部叢狀層，神經節(jié)細胞層，神經纖維層和內部限制膜。
[0086]本發(fā)明中的“視網膜層特異性神經細胞”是指構成視網膜層并且特異于視網膜層的神經細胞。[0087]本發(fā)明中的“視網膜先祖細胞”是指可以分化為光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，和視網膜神經節(jié)細胞中的任何成熟視網膜細胞的先祖細胞。
[0088]另一方面，光感受器前體，水平前體細胞，雙極前體細胞，無長突前體細胞和視網膜神經節(jié)前體細胞是被確定分別分化為光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞和視網膜神經節(jié)細胞的前體細胞。
[0089]本發(fā)明中的“視網膜色素上皮”是指存在于活體的視網膜中的神經視網膜組織的外側上的上皮細胞。是否是視網膜色素上皮可以由本領域普通技術人員通過例如細胞標記物(RPE65(色素上皮)，Mitf (色素上皮)等)的表達、黑素顆粒的存在、特征多角細胞形狀等容易地確認。
[0090]本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以制備自作為基礎培養(yǎng)基的用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基?；A培養(yǎng)基的實例包括BME培養(yǎng)基，BGJb培養(yǎng)基，CMRL1066培養(yǎng)基，Glasgow MEM培養(yǎng)基，改進的MEM Zinc Option培養(yǎng)基，MDM培養(yǎng)基，Mediuml99培養(yǎng)基，Eagle MEM培養(yǎng)基，a MEM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，火腿培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基，F(xiàn)ischer氏培養(yǎng)基，及它們的混合培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基不受特別的限制，只要其可以用于培養(yǎng)動物細胞。
[0091]本發(fā)明中的“無血清培養(yǎng)基”是指不含未調整的或未純化的血清的培養(yǎng)基。含有純化的來源于血液的組分和來源于動物組織的組分(例如，生長因子)的培養(yǎng)基被認為是無血清培養(yǎng)基，除非其中含有未調整的或未純化的血清。
[0092]培養(yǎng)基不受特別的限制，只要其如上所限定。然而，為了避免復雜的制備，添加有適當量(例如，1-20% )的市售KSR的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.lmM2_巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，ImM丙酮酸鈉)可以用作無血清培養(yǎng)基。
[0093]此外，無血清培養(yǎng)基可以含有血清置換物。血清置換物可以合適地含有，例如，清蛋白，轉鐵蛋白，脂肪酸，月父原蛋白如體，痕量兀素，2_疏基乙醇或3 ’硫醇甘油(3’ thiolglycerol),其等效物等。此種血清置換物可以通過例如W098/30679中所述的方法制備。此外，為了更方便地進行本發(fā)明的方法，血清置換物可以是市售產品。此種市售血清置換物的實例包括Chemically-defined Lipid concentrated(化學上限定的脂質濃縮物)(由Gibco生產)和Glutamax (由Gibco生產)。
[0094]用于漂浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基可以含有脂肪酸或脂質，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長因子，細胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，丙酮酸，緩沖劑，無機鹽等。
[0095]本發(fā)明中的“含血清的培養(yǎng)基”是指含有未調整的或未純化的血清的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基不受特別限制，只要其如上所限定。此外，含血清的培養(yǎng)基可以含有脂肪酸或脂質，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長因子，細胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，丙酮酸，緩沖劑，無機鹽等。
[0096]本發(fā)明中的“漂浮培養(yǎng)”是指在防止細胞或細胞質粘附到細胞培養(yǎng)容器材料等的條件下培養(yǎng)。
[0097]用于漂浮培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)容器不受特別限制，只要其使“漂浮培養(yǎng)”成為可能，并且本領域普通技術人員可以適當地對其進行確定。此種細胞培養(yǎng)容器的實例包括燒瓶，組織培養(yǎng)燒瓶，盤，培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)皿，多盤(multidish),微板,微孔板,微孔，多板(multiplate),多孔板,室載玻片(chamber slide),盤碟(schale),試管,碟,培養(yǎng)袋和滾瓶(roller bottle)。因為這些細胞培養(yǎng)容器用于漂浮培養(yǎng)，所以它們優(yōu)選是細胞非粘附性的。作為細胞非粘附性容器，可以使用其表面未被人工處理(例如，利用胞外基質的包被處理等)以提高細胞粘附性的容器等。
[0098]本發(fā)明中的“靈長類”是指屬于靈長類的哺乳動物。靈長類的實例包括卷鼻猴亞目(Strepsirrhini)如狐猴、懶猴和Tsubai,以及類人猿亞目(Haplorhini)如猴、類人猿和人。
[0099]<視網膜組織的制備方法>
[0100]本發(fā)明的第一方面是制備視網膜組織的方法，其包括以下步驟(1)至(3):
[0101](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體，
[0102](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，和
[0103](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
[0104](I)第一步
[0105]解釋第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體。
[0106]抑制Wnt信號途徑的物質不受特別限制，只要其可以抑制由Wnt介導的信號轉導。抑制Wnt信號途徑的物質的實例包括Dkkl, Cerberus蛋白,Wnt受體抑制劑,可溶型Wnt受體，fct抗體，酪蛋白激酶抑制劑，顯性陰性fct蛋白，CK1-7 (N-(2-氨基乙基)-5-氯-異喹啉-8-磺酰胺)，D4476 (4- {4- (2，3- 二氫苯并[1，4] 二嗯烯-6-基)~5~吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯酰胺)，IffR-1-內(IWR-1-endo) (IffRle)，IWP-2 等。
[0107]用于本發(fā)明的抑制Wnt信號途徑的物質的濃度僅需要是形成多能干細胞的聚集體的濃度。例如，常見的抑制fct信號途徑的物質如IWRle以約0.1 μ M至100 μ Μ，優(yōu)選地約I μ M至10 μ Μ，更優(yōu)選地約3 μ M的濃度添加。
[0108]抑制Wnt信號途徑的物質可以在開始漂浮培養(yǎng)前被添加至無血清培養(yǎng)基，或在自開始漂浮培養(yǎng)起的數天內(例如，5天內)添加到無血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，抑制Wnt信號途徑的物質在自開始漂浮培養(yǎng)起的5天內、更優(yōu)選地3天內、最優(yōu)選地與開始漂浮培養(yǎng)同時被添加至無血清培養(yǎng)基。此外，在添加抑制fct信號途徑的物質的情況下，漂浮培養(yǎng)進行至自開始漂浮培養(yǎng)起的第18天、更優(yōu)選地第12天。
[0109]培養(yǎng)條件如第一步中的培養(yǎng)溫度和CO2濃度可以被適當地確定。而培養(yǎng)溫度不受特別限制，其為，例如，約30至40°C，優(yōu)選地約370C。CO2濃度為，例如，約I至10%，優(yōu)選地約5%。
[0110]本發(fā)明中的“聚集體”是指分散在培養(yǎng)基中但聚集以形成聚集體的大量細胞。本發(fā)明中的“聚集體”包括由在漂浮培養(yǎng)開始時分散的細胞形成的聚集體和在漂浮培養(yǎng)開始時已經形成的聚集體。
[0111]當細胞聚集從而形成細胞聚集體并且對聚集體進行漂浮培養(yǎng)時，“形成聚集體”是指“快速地聚集給定數目的分散的干細胞”以形成在質量上均勻的細胞聚集體。
[0112]形成聚集體的實驗操作的實例包括涉及通過使用具有小孔的平板(96孔板)、微孔等將細胞保持在小空間中的方法，涉及通過使用小離心管短時間離心來聚集細胞的方法[0113]第一步中多能干細胞的濃度可以由本領域普通技術人員適當地確定，以更均勻和有效地形成多能干細胞的聚集體。形成聚集體時多能干細胞的濃度不受特別限制，只要其允許形成干細胞的均勻聚集體。例如，當使用96孔微孔板對人ES細胞進行漂浮培養(yǎng)時，加入制備成每孔約I X IO3至約5 X IO4個細胞、優(yōu)選地約3 X IO3至約3 X IO4個細胞、更優(yōu)選地約5X IO3至約2X IO4個細胞、最優(yōu)選地約9X IO3個細胞的液體，并且靜置平板以形成聚集體。
[0114]形成聚集體所需的漂浮培養(yǎng)的時間可以根據所用的多能干細胞適當地確定，只要細胞可以快速聚集。為了形成均勻的聚集體，其理想地是盡可能的短。例如，在人ES細胞的情況中，聚集體理想地 優(yōu)選地在24小時內、更優(yōu)選地在12小時內形成。聚集體形成所需的時間可以由本領域普通技術人員通過控制用于聚集細胞的工具、離心條件等適當地調整。
[0115]本領域普通技術人員可以基于聚集體的尺寸和細胞數目，宏觀形態(tài)，微觀形態(tài)，通過組織染色分析及其均勻性，分化和未分化標記物的表達及其均勻性，控制分化標記物的表達及其同步，聚集體間分化效率的再現(xiàn)性等來確定是否已經形成多能干細胞的聚集體。
[0116](2)第二步
[0117]解釋第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中對第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
[0118]“基膜制備物”是指含有基膜構成組分的制備物，當能夠形成基膜的目的細胞被鋪板于其上并培養(yǎng)時，其具有與上皮細胞類似的控制細胞形成，分化，生長，活動性，功能表達等的功能。此處，“基膜構成組分”是指存在于動物組織中的上皮細胞層和間隙細胞層等之間的薄膜形式的細胞外基質分子?；ぶ苽湮锟梢酝ㄟ^例如以下方式制備:利用能夠溶解細胞脂質的溶液、堿溶液等移除經由基膜粘附在載體上的能夠形成基膜的細胞。優(yōu)選的基膜制備物的實例包括可作為基膜組分商購的產品(例如，MatrigeU下文中，有時也稱作Matrigel))和已知作為基膜組分的細胞外基質分子(例如，層粘連蛋白，IV型膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白等)。
[0119]Matrigel是制備自來源于Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基膜的產品。Matrigel的主要成分是IV型膠原蛋白，層粘連蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。除了這些以外，還含有由EHS腫瘤天然產生的TGF-β，成纖維細胞生長因子(FGF)，組織纖溶酶原激活物和生長因子。Matrigel的“生長因子減少的產品”具有比通常Matrigel低的生長因子濃度，并且其標準濃度為〈0.5ng/ml (對于EGF)，〈0.2ng/ml (對于NGF)，<5pg/ml (對于PDGF)，5ng/ml (對于IGF-1)，以及1.7ng/ml (對于TGF- β )。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用“生長因子減少的產品”。
[0120]雖然在第二步中添加到用于漂浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的基膜制備物的濃度不受特別限制，只要神經組織的上皮結構(例如，視網膜組織)被穩(wěn)定地保持，但是例如，當使用Martigel時，其優(yōu)選為培養(yǎng)基的1/20至1/200體積，更優(yōu)選為約1/100體積。雖然當開始培養(yǎng)干細胞時基膜制備物可以已經被添加到培養(yǎng)基，但是優(yōu)選地，其在自開始漂浮培養(yǎng)起5天內、更優(yōu)選地在2天內被添加至無血清培養(yǎng)基。
[0121]作為第二步中使用的無血清培養(yǎng)基，可以直接使用第一步中使用的無血清培養(yǎng)基，或者可以用新鮮無血清培養(yǎng)基替換。
[0122]當將第一步中使用的無血清培養(yǎng)基直接用于該步時，“基膜制備物”可以被添加到培養(yǎng)基。
[0123]用于第一步和第二步中的漂浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基不受特別限制，只要其如上所限定。然而，為了避免復雜的制備，優(yōu)選地使用添加有適當量的市售KSR(敲除血清置換物)的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.lmM2_巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，ImM丙酮酸鈉)作為無血清培養(yǎng)基。添加到無血清培養(yǎng)基的KSR的量不受特別限制并且，例如，在人ES細胞的情況中，其通常為I至20%、優(yōu)選為2至20%。
[0124]第二步中的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度和CO2濃度可以被適當地確定。雖然培養(yǎng)溫度不受特別限制，但是其為，例如約30至40°C，優(yōu)選為約37°C。CO2濃度為例如約I至10%、優(yōu)選為約5%。
[0125](3)第三步
[0126]解釋第三步，在含血清的培養(yǎng)基中對第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
[0127]作為用于第三步的含血清的培養(yǎng)基，可以使用直接添加血清的用于第二步的培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，或者用新鮮的含血清的培養(yǎng)基替換用于第二步的培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。
[0128]作為添加到第三步中的 培養(yǎng)基的血清，例如，可以使用哺乳動物血清如牛血清，小牛血清，胎牛血清，馬血清，小馬血清,胎馬血清,兔血清,小兔血清，胎兔血清和人血清等。
[0129]自開始漂浮培養(yǎng)起，在第7天或之后，更優(yōu)選地在第9天或之后，最優(yōu)選地在第12天或之后添加血清。添加的血清的濃度為約I至30%，優(yōu)選為約3至20%，更優(yōu)選為約10%。
[0130]第三步中使用的含血清的培養(yǎng)基不受特別限制，只要其如上所限定。優(yōu)選使用上述添加血清的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.lmM2_巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，ImM丙酮酸鈉)。
[0131]作為此種含血清的培養(yǎng)基，也可以使用添加有適當量的市售KSR(敲除血清置換物)的培養(yǎng)基。
[0132]在第三步中，視網膜組織的制備效率可以通過除了血清外添加作用于Shh信號途徑的物質來提高。
[0133]作用于Shh信號途徑的物質不受特別限制，只要其可以增強由Shh介導的信號轉導。作用于Shh信號途徑的物質的實例包括屬于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh), Shh受體，Shh受體激動劑，Purmorphamine, SAG等。
[0134]該步中使用的作用于Shh信號途徑的物質的濃度為，例如，在常見的作用于Shh信號途徑的物質如SAG的情況中，約0.1nM至10 μ M，優(yōu)選地約IOnM至I μ Μ，更優(yōu)選地約ΙΟΟηΜ。
[0135]因此制備的視網膜組織存在以覆蓋聚集體的表面。通過本發(fā)明的制備方法制備的是否是視網膜組織可以通過如以下(4)中所述的免疫染色方法來確認。
[0136]還可能的是，用鑷子等物理切除存在于聚集體表面上的視網膜組織。在這種情況中，因為除視網膜組織以外的神經組織可以形成在各聚集體的表面上，從聚集體切除的部分神經組織被切斷并通過如(4)中所述的免疫染色方法確認，由此組織被確認為視網膜組織。
[0137](4)視網膜組織的確認方法
[0138]視網膜組織可以通過上述第一步至第三步制備。此外，提供第一步至第三步制備的視網膜組織可以通過以下方法確認。
[0139]在含血清的培養(yǎng)基中對第三步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。用于漂浮培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)容器的實例包括上述那些。漂浮培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度和O2濃度可以被適當地確認。雖然培養(yǎng)溫度不受特別限制，但其為，例如，約30至40°C，優(yōu)選為約37°C。CO2濃度為，例如，約I至10%，優(yōu)選為約5%。O2濃度為，例如，20至70%，優(yōu)選為20至60%，更優(yōu)選為30至50%。
[0140]雖然該步中的培養(yǎng)時間不受特別限制，但其通常不少于48小時，優(yōu)選地不少于7天。
[0141]視網膜組織可以通過以下方式確認:在完成漂浮培養(yǎng)后，用固定劑如多聚甲醛溶液固定聚集體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色方法等確認層結構的形成。因為視網膜組織的各層由不同的視網膜先祖細胞(光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，視網膜神經節(jié)細胞)組成，所以層結構的形成可以通過免疫染色方法使用針對前述在這些細胞中表達的標記物的抗體來確認。
[0142]〈視杯樣結構的制備方法〉
[0143]本發(fā)明的第二方面是視杯樣結構的制備方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Shh信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中對通過上述〈視網膜組織的制備方法 > 獲得的視網膜組織進行漂浮培養(yǎng)。作為在上述〈視網膜組織的制備方法 > 中獲得的視網膜組織，可以使用包含在上述〈視網膜組織的制備方法〉的第三步中培養(yǎng)的視網膜組織的聚集體。作為第二個發(fā)明的實施方案，可以提及包括以下步驟(1) 至(4)的制備視杯樣結構的方法:
[0144](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體，
[0145](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中對第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，
[0146](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中對第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，和
[0147](4)第四步，在各自含有作用于Shh信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中對第三步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
[0148]此處，作用于Shh信號途徑的物質不受特別限制，只要其可以增強由Shh介導的信號轉導。作用于Shh信號途徑的物質的實例包括屬于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh),Shh 受體，Shh 受體激動劑，Purmorphamine, SAG 等。
[0149]用于本發(fā)明的第二方面的作用于Shh信號途徑的物質的濃度為，例如，在常見的作用于Shh信號途徑的物質如SAG的情況中，約0.1nM至10 μ M，優(yōu)選為約IOnM至I μ Μ，更優(yōu)選為約ΙΟΟηΜ。
[0150]作用于Wnt信號途徑的物質的實例包括屬于Wnt家族的蛋白，Wnt受體，Wnt受體激動劑，GSK3 β抑制劑(例如，6-溴靛玉紅-3，-月虧(BIO)，CHIR99021, Kenpaullone)等。[0151 ] 用于本發(fā)明的第二方面的作用于Wnt信號途徑的物質的濃度為，例如，在常見的作用于fct信號途徑的物質如CHIR99021的情況中，約0.1 μ M至100 μ M，優(yōu)選為約I μ M至30 μ Μ，更優(yōu)選為約3 μ Μ。
[0152]自開始漂浮培養(yǎng)起，在第12天或之后并且在第25天或之前，優(yōu)選地在第15或之后并且在第18天或之前添加作用于Shh信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質。在此情況中，優(yōu)選使用不含在聚集體形成步驟中添加的抑制fct信號途徑的物質的培養(yǎng)基。
[0153]自開始漂浮培養(yǎng)起，在第18天或之后，產生視杯樣結構，其形式為自聚集體的突起。其是否是視杯樣結構可以由本領域普通技術人員通過利用顯微鏡、放大鏡等觀察來確認。
[0154]因此制備的視杯樣結構形成外層和內層的兩層結構。因為視網膜色素上皮存在于外層中而視網膜先祖細胞存在于內層中，所以視網膜先祖細胞和視網膜色素上皮可以通過例如制備視杯樣結構的冷凍切片并進行免疫染色來觀察。
[0155]此外，因為通過本發(fā)明的方法制備的視杯樣結構形成為自聚集體的突起的形式，還可能的是，通過以下方式獲得高純 度的視網膜先祖細胞:物理和形態(tài)學上切去自聚集體的突起，之后對所得的視杯樣結構進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)和FACS分選。用于切去視杯樣結構的方法不受特別限制，并且可以使用精細的鑷子等容易地將其從干細胞的聚集體切去。
[0156]<視網膜層特異性神經細胞的制備方法>
[0157]本發(fā)明的第三方面是制備視網膜層特異性神經細胞的方法，所述方法包括使包含在來源于靈長類多能干細胞的視網膜組織中的視網膜先祖細胞接觸抑制Notch信號途徑的物質。根據本發(fā)明的方法，視網膜層特異性神經細胞可以制備自視網膜先祖細胞。
[0158](靈長類多能干細胞來源的視網膜組織的制備方法)
[0159]說明用于視網膜層特異性神經細胞的制備方法中的“靈長類多能干細胞來源的視網膜組織”。
[0160]作為靈長類多能干細胞來源的視網膜組織，例如可以使用通過上述〈視網膜組織的制備方法 > 獲得的視網膜組織，或制備自通過上述〈視杯樣結構的制備方法 > 獲得的視杯樣結構的視網膜組織。
[0161]在后一種情況中，視網膜組織可以通過以下方式制備:對上述〈視杯樣結構的制備方法 > 的第四步中形成的視杯樣結構進行進一步漂浮培養(yǎng)。
[0162]因為如上所述，視杯樣結構形成為自聚集體的突起的形式，所以可以通過以下方式獲得高純度的視網膜組織:物理和形態(tài)學上切去自聚集體的突起，之后進行分離和培養(yǎng)。用于切去視杯樣結構的方法不受特別限制，并且可以使用精細鑷子等將其容易地自干細胞的聚集體切去。
[0163]如上所述制備的視網膜組織和視杯樣結構含有視網膜先祖細胞，并且視網膜層特異性神經細胞可以通過使前述視網膜先祖細胞接觸抑制Notch信號途徑的物質而制備自視網膜先祖細胞。
[0164]<抑制Notch信號途徑的物質>
[0165]接下來，說明用于視網膜層特異性神經細胞的制備方法中的抑制Notch信號途徑的物質。
[0166]抑制Notch信號途徑的物質不受特別限制，只要其可以抑制由Notch介導的信號轉導。抑制Notch信號途徑的物質的實例包括Notch抗體，Notch受體拮抗劑，ADAM抑制劑，Y分泌酶抑制劑等。
[0167]Y分泌酶抑制劑的實例包括N-[N-(3，5- 二氟苯乙?；?_L_丙氨酰基]_S_苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)。
[0168]y分泌酶抑制劑的濃度不受特別限制，只要其可以增強視網膜先祖細胞向光感受器前體細胞或光感受器的分化。所述濃度為，例如，在常見的Y分泌酶抑制劑的情況中，約0.1至1000 μ Μ，優(yōu)選為約I至100 μ Μ，更優(yōu)選為約10 μ Mo
[0169]對于制備自靈長類多能干細胞的視網膜組織，自開始漂浮培養(yǎng)靈長類多能干細胞起，在第15天或之后并且在第200天或之前，添加Y分泌酶抑制劑。優(yōu)選地，在第20天或之后并且在第150天或之前，更優(yōu)選地在第25天或之后并且在第100天或之前，向分化誘導的培養(yǎng)基添加Y分泌酶抑制劑。
[0170]在Υ分泌酶抑制劑存在下粘附培養(yǎng)的時間可以是這樣的長度，其允許更有效地制備光感受器前體細胞或光感受器。這樣的時間的長度可以為，例如，約3天以上，優(yōu)選為約5至100天,更優(yōu)選為約7至30天。
[0171](視網膜層特異性神經細胞的確認方法)
[0172]通過參照視網膜層特異性神經細胞是光感受器、光感受器前體或神經節(jié)細胞的情況來說明確認如上所述制備的視網膜層特異性神經細胞的方法。
[0173]制備的視網膜層特異性神經細胞是否是光感受器前體細胞可以通過已知方法確認,例如,通過光感受器前體細胞標記物的表達。光感受器前體細胞標記物的實例包括Crx。
[0174]光感受器包含視 桿細胞和視錐細胞。制備的細胞是否是光感受器可以通過本身已知的方法確認，例如，通過光感受器標記物的表達。光感受器標記物的實例包括視紫紅質(視桿細胞)，紅/綠視蛋白(視錐細胞)，藍視蛋白(視錐細胞)，恢復蛋白(視桿細胞，視維細胞)等。
[0175]此外，制備的視網膜層特異性神經細胞是否是神經節(jié)細胞可以通過已知方法確認，例如，通過神經節(jié)細胞標記物的表達。神經節(jié)細胞標記物的實例包括Brn3。
[0176]在完成粘附培養(yǎng)后，光感受器前體細胞或光感受器可以分離自視網膜組織。此種分離可以通過本身已知的方法(細胞分選儀等)并且使用針對光感受器前體細胞或光感受器的表面標記物的抗體等進行。此外，在完成培養(yǎng)后，神經節(jié)細胞可以分離自視網膜組織。此種分離可以通過本身已知的方法(細胞分選儀等)并且使用針對神經節(jié)細胞的表面標記物的抗體等進行。備選地，通過使用，作為多能干細胞，其中標記的基因(例如，熒光蛋白如GFP)已經被敲入編碼光感受器前體細胞的標記物(例如，Crx)或光感受器的標記物(例如，恢復蛋白)或神經節(jié)細胞的標記物(Brn3)的基因的讀框中的細胞，各細胞可以通過本身已知的方法(細胞分選儀等)使用標記基因的表達作為指示物來分離。
[0177]〈視網膜色素上皮的制備方法〉
[0178]本發(fā)明的第四方面是視網膜色素上皮的制備方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質(但是不含有作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，對通過上述〈視網膜組織的制備方法 > 獲得的視網膜組織進行漂浮培養(yǎng)。作為在上述〈視網膜組織的制備方法 > 中獲得的視網膜組織，可以使用包含上述〈視網膜組織的制備方法 > 的第三步中培養(yǎng)的視網膜組織的聚集體。作為第四發(fā)明的實施方案，可以提及包括以下步驟(1)至(4)的制備視網膜色素上皮的方法:
[0179](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體，[0180](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中對第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，
[0181](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中對第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，和
[0182](4)第四步，在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中前述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質)對第三步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
[0183]此處，作用于Wnt信號途徑的物質的實例包括屬于Wnt家族的蛋白，Wnt受體，Wnt受體激動劑，GSK3 3抑制劑(例如，6-溴靛玉紅-3’ -月虧(BIO), CHIR99021, Kenpaullone)
坐寸ο
[0184]用于本發(fā)明的第四方面的作用于Wnt信號途徑的物質的濃度為，例如，在常見的作用于fct信號途徑的物質如CHIR99021的情況中，約0.1 μ M至100 μ M，優(yōu)選為約I μ M至30 μ Μ，更優(yōu)選為約3 μ Μ。
[0185]當例如使用人ES細胞時，在第12天或之后、最優(yōu)選地在第15天添加作用于Wnt信號途徑的物質。在此情況中，優(yōu)選使用的是不含第一步中添加的抑制fct信號途徑的物質和第三步中添加的作用于Shh信號途徑的物質的培養(yǎng)基。
[0186]在本發(fā)明 的第四方面中，通過上述〈視網膜組織的制備方法 > 獲得的視網膜組織或含有視網膜組織的聚集體優(yōu)選地在各自含有作用于fct信號途徑的物質和作用于激活蛋白信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0187]作用于激活蛋白信號途徑的物質不受特別限制，只要其可以增強由激活蛋白介導的信號轉導。作用于激活蛋白信號途徑的物質的實例包括屬于激活蛋白家族的蛋白(例如，激活蛋白A，激活蛋白B，激活蛋白C，和激活蛋白AB等)，激活蛋白受體，激活蛋白受體激動劑等。
[0188]用于該步中的作用于激活蛋白信號途徑的物質的濃度為，例如，在常見的作用于激活蛋白信號途徑的物質如重組人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems#338-AC)的情況中，lng/ml 至 10ug/ml,優(yōu)選為約 10ng/ml 至 lug/ml,更優(yōu)選為約 100ng/ml。
[0189]因為因此制備的視網膜色素上皮存在于聚集體的表面，所以其可以通過顯微鏡觀察等容易地觀察到。還可能的是，通過以下方式獲得高純度的視網膜色素上皮:對包含視網膜色素上皮的聚集體進行例如分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)之后FACS分選。還可能的是，利用鑷子等自聚集體物理地切去視網膜色素上皮，之后培養(yǎng)。在分散或切去后，視網膜色素上皮可以在粘附條件下培養(yǎng)。在粘附培養(yǎng)的情況中，優(yōu)選使用細胞粘附培養(yǎng)容器，例如，在用細胞外基質等(例如，聚-D-賴氨酸，層粘連蛋白，纖連蛋白)包被處理后的培養(yǎng)容器。粘附培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度和O2濃度可以由本領域普通技術人員容易地確定。在此情況中，所述培養(yǎng)可以在血清、已知的生長因子、促進生長的添加劑和化學物質的存在下進行。已知的生長因子的實例包括EGF，F(xiàn)GF等。促進生長的添加劑的實例包括 N2 添加物(Invitrogen), B27 添加物(Invitrogen)等。
[0190]<使用視網膜組織作為用于評估毒性或藥物效力的試劑>
[0191]通過本發(fā)明的第一至第四方面制備的視網膜組織，視杯樣結構，視網膜層特異性神經細胞和視網膜色素上皮也可以用于篩選用于由視網膜組織或視網膜相關細胞的紊亂所致的疾病的治療藥物，或用于細胞治療的移植材料，用于研究疾病的材料或用于由其他病因所致的細胞損傷的治療藥物的藥物開發(fā)材料。此外，它們在化學物質等的毒性和藥物效力評估中可以用于毒性如光毒性的研究、測試等。
[0192]由視網膜組織或視網膜相關細胞的紊亂所致的疾病的實例包括有機汞中毒，氯喹視網膜病(chloroquine retinopathy),色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa),年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration),青光眼(glaucoma),糖尿病視網膜病(diabetic retinopathy)，新生兒視網膜病(neonatal retinopathy)等。
[0193]〈使用視網膜組織，視杯樣結構，視網膜層特異性神經細胞和視網膜色素上皮作為用于移植的生物材料〉
[0194]通過本發(fā)明的第一至第四方面制備的視網膜組織，視杯樣結構，視網膜層特異性神經細胞和視網膜色素上皮可以用作用于補充受損細胞或自身處于細胞損傷狀態(tài)的患病組織的移植(例如，用于移植操作)等的生物材料。移植方法的實例包括，但不限于，下述實施例中描述的方法。
[0195]以下通過參照比較例和實施例更詳細地說明本發(fā)明的制備方法。實施例僅顯示本發(fā)明的范例并且絕不限制本發(fā)明的范圍。
[0196]實施例
[0197](建立RAX敲入人ES細胞)
[0198]制備具有在 RAX基因座(其是視網膜先祖細胞的標記物基因之一)處敲入的GFP的人ES細胞系。
[0199]特異性切割人ES細胞系(KhES-1:由Kyoto University建立的人ES細胞系)的基因組DNA上的RAX基因的鋅指核酸酶(ZFN)購買自Sigma-Aldrich C0.LLC0使用解離成單個細胞的人ES細胞并且根據電穿孔方法，共轉染編碼ZFN的mRNA和搭載GFP和新霉素-抗性基因(其是藥物選擇基因)的敲入載體，并且將其鋪平板于用絲裂霉素C處理的新霉素抗性小鼠成纖維細胞上。從鋪平板的第二天起，將G418加入到培養(yǎng)基中并且進行藥物選擇。挑取獲得的抗性克隆的菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，并且通過PCR法和DNA印跡法選擇敲入細胞，由此建立RAX::GFP敲入的人ES細胞系。
[0200]比較例1:通過使用人ES細胞制備視網膜組織(Matrigel添加條件)
[0201]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen)。通過使用 0.25 %胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將 ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9X 10~3個細胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITEC0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20 % KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸和20 μ M Υ27632獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。其后，定期地進行熒光顯微鏡觀察，同時繼續(xù)漂浮培養(yǎng)。
[0202]作為直至自開始漂浮培養(yǎng)起第25天的熒光顯微鏡觀察的結果，稍微發(fā)現(xiàn)表達GFP的細胞，其顯示視網膜先祖細胞的誘導(圖1Α，B)。
[0203]比較例2:通過使用人ES細胞制備視網膜組織(Nodal信號途徑抑制劑和Matrigel添加條件)
[0204]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20 % KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Y27632和抑制Nodal信號途徑的物質(10yMSB431542)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起， 以每體積1/100的量加入Matrigel。其后，繼續(xù)漂浮培養(yǎng)并且在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS進行表達GFP的細胞的比例的熒光顯微鏡觀察和確認。
[0205]結果，稍微發(fā)現(xiàn)表達GFP的細胞(圖1C，D)。
[0206]比較例3:通過使用人ES細胞制備視網膜組織(Wnt信號途徑抑制劑和Matrigel添加條件)
[0207]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3μΜ IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。其后，繼續(xù)漂浮培養(yǎng)并且在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS進行表達GFP的細胞的比例的熒光顯微鏡觀察和確認。
[0208]結果，與比較例I和2相比，表達GFP的細胞明顯增加(圖1Ε，F(xiàn))。
[0209]實施例1:通過使用人ES細胞制備視網膜組織(Wnt信號途徑抑制劑和Matrigel、血清添加條件)
[0210]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3μΜ IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。此外,在自開始漂浮培養(yǎng)起第12天，以每體積1/10的量加入胎牛血清。其后，繼續(xù)漂浮培養(yǎng)并且在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS進行表達GFP的細胞的比例的熒光顯微鏡觀察和確認。同時，還在不添加血清的比較例3的條件下進行實驗。
[0211]雖然在比較例3的條件下表達GFP的細胞的比例為3.2% (圖2A，B，圖3A)，但是在添加血清的條件下出現(xiàn)了很多表達GFP的細胞(圖2C，D)。在通過FACS的分析中，GFP陽性細胞的比例超過30% (圖3B)。
[0212]實施例2:通過使用人ES細胞制備視網膜組織(添加Wnt信號途徑抑制劑和Matrigel、血清和作用于Shh信號的物質的條件)
[0213]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3μΜ IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。在自開始漂浮培養(yǎng)起第12天,加入胎牛血清(以每體積1/10的量)和作用于Shh信號途徑的物質(IOOnM SAG)。在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS測量表達GFP的細胞的比例。
[0214]當作用于Shh信號 途徑的物質與血清同時添加時，出現(xiàn)非常多數目的表達GFP的細胞(圖2E，F(xiàn))。由使用FACS的分析，發(fā)現(xiàn)表達GFP的細胞的比例達到不少于70%。
[0215]發(fā)現(xiàn)，與比較例3相比，在添加血清的實施例1的條件下表達GFP的細胞的比例增加至約10倍，并且進一步，在同時添加血清和作用于Shh信號途徑的物質的實施例2的條件下，表達GFP的細胞的比例增加至約24倍(圖3D)。
[0216]實施例3:確認視網膜組織形成
[0217](方法)
[0218]利用實施例2和3中制備的具有表達GFP的細胞的聚集體來確認視網膜組織的形成。使用通過向DMEM/F12培養(yǎng)基添加N2添加物，10% (v/v)胎牛血清和0.5 μ M視黃酸獲得的含血清的培養(yǎng)基，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第18天起在40% O2的條件下進行漂浮培養(yǎng)。其后，利用4%多聚甲醛溶液固定聚集體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色方法確認組織結構。
[0219]結果，在自開始漂浮培養(yǎng)起第60天，發(fā)現(xiàn)在最底層中的Brn3和TuJl陽性的神經節(jié)細胞，在最外層和中間層中的Crx和恢復蛋白陽性的光感受器-前體細胞，以及在最外層中的Brn3陽性細胞和在最內層中的Brn3陽性細胞之間的中間神經元先祖細胞如ChxlO陽性的雙極細胞以有序的方式布置成層(圖4A，B, C)。此外，當繼續(xù)漂浮培養(yǎng)直至第126天時，Crx和恢復蛋白陽性的光感受器-前體細胞積累在最外層中，并且觀察到表達在視桿細胞中特異表達的Nrl的細胞和表達在視錐細胞中特異表達的Rxr-Y的細胞。此外，在中間層中觀察到表達水平細胞和無長突細胞的前體細胞標記物Ptfla的細胞(圖4D，E，F(xiàn)，G，H，I)。由這些結果，證明可以由人ES細胞高效地制備視網膜組織。
[0220]實施例4:將由人ES細胞制備的視網膜組織移植到眼中
[0221]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內壓。利用細胞移植針將眼內灌注液從鞏膜切口注射到視網膜下空間，以人工地形成淺的視網膜脫離狀態(tài)。利用細胞移植針或細胞片移植設備將視網膜組織移植到形成的空間中。
[0222]實施例5:使用人ES細胞高效地制備視杯樣結構
[0223](方法)
[0224]使用RAX::GFP敲入人ES細胞，制備視杯樣結構。
[0225]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)形成聚集體，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (InvitiOgen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其懸浮在無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMILON球形板，SUMITOMOBAKELITE C0.，LTD.)，以允許快速形成聚集體，并且進行漂浮培養(yǎng)，37°C ,5% C02。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始 漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。在自開始漂浮培養(yǎng)起第12天，將漂浮的聚集體轉移到不含抑制fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中，以每體積1/10的量加入胎牛血清并且培養(yǎng)聚集體。此外，從第15天起，在含有作用于Wnt信號途徑的物質(3yMCHIR99021)和作用于Shh信號途徑的物質(IOOnMSAG)的含血清的培養(yǎng)基中進行漂浮培養(yǎng)。
[0226](結果)
[0227]當通過上述方法制備時，在自開始漂浮培養(yǎng)起第14天左右在部分的聚集體中出現(xiàn)顯示RAX表達的GFP陽性的細胞群體(圖5A)，其之后向聚集體的外側凸起(圖5B，C)。當繼續(xù)漂浮培養(yǎng)時，形成明顯的突起(圖OT)。此外，當繼續(xù)漂浮培養(yǎng)時，在由GFP陽性細胞(視網膜先祖細胞)組成的聚集體上形成明顯的視杯樣結構(圖6)。簡單地通過顯微鏡觀察聚集體可以清楚地識別此視杯樣結構(圖6A)。當通過雙光子顯微鏡深入地觀察形成在聚集體上的視杯樣結構時，發(fā)現(xiàn)其具有外部和內部的兩層結構(圖6C，D)。制備視杯樣結構的冷凍切片并進行免疫染色。結果，表達Mitf的視網膜色素上皮的層存在于外部，而ChxlO陽性的神經視網膜先祖細胞存在于其內部(圖7)。
[0228]實施例6:將由人ES細胞制備的視杯樣結構移植到眼中
[0229]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內壓。利用細胞移植針將眼內灌注液從鞏膜切口注射到視網膜下空間，以人工地形成淺的視網膜脫離狀態(tài)。利用細胞移植針或細胞片移植設備將培養(yǎng)的視杯樣結構移植到形成的空間中。
[0230]實施例7:利用作用于Notch信號的物質處理人ES細胞來源的視網膜組織
[0231]根據“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)CrX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen)。通過使用 0.25 %胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將 ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(100μ I)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9X 10~3個細胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITEC0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20 % KSR、
0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。從漂浮培養(yǎng)的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel并且進行漂浮培養(yǎng)。在漂浮培養(yǎng)的第12天，加入胎牛血清(以每體積1/10的量)和作用于Shh信號途徑的物質(IOOnMSAG)并進行漂浮培養(yǎng)以制備視網膜組織。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第29天向視網膜組織加入作用于Notch信號的物質(10 μ M DAPT( Y分泌酶活性抑制劑))，在自開始漂浮培養(yǎng)起的第41天(添加后的第12天)利用熒光顯微鏡進行觀察，并且在自開始漂浮培養(yǎng)起的第43天(添加后的第14天)利用4%多聚甲醛固定，并且制備冷凍切片。對制備的冷凍切片進行針對恢復蛋白(其是光感受器的標記物基因之一)和Brn3(其是神經節(jié)細胞的標記物基因之一)的免疫染色，并且比較添加和不添加DAPT的情況之間的結果。
[0232]結果，與不添加DAPT時(圖8A)相比，在添加DAPT時(圖8B)，表達GFP的細胞顯著增加。此外，由冷凍切片的免疫染色的結果，發(fā)現(xiàn)，當添加DAPT時，恢復蛋白陽性的細胞增加3至5倍(圖8C，D)。
[0233]這些結果顯示光感受器的顯著增加。此外，由Brn3的免疫染色的結果發(fā)現(xiàn)，通過添加DAPT，神經節(jié)細胞也增加(圖8E，F(xiàn))。
[0234]實施例8:在凍融后用作用于Notch信號的物質處理人ES細胞來源的視網膜組織
[0235]根據“Ueno，M.等PNAS 2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech 2007” 中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3 μ M IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起使用添加有Matrigel (以每體積1/100的量)的無血清培養(yǎng)基。自漂浮培養(yǎng)的第2天起以每體積1/100的量添加Matrigel并且進行漂浮培養(yǎng)。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第12天添加胎牛血清(以每體積1/10的量)和作用于Shh信號途徑的物質(IOOnM SAG)并且進行漂浮培養(yǎng)以制備視網膜組織。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第33天凍融制備的視網膜組織，并且在自開始漂浮培養(yǎng)起的第38天向視網膜組織添加Notch信號作用抑制物質(10 μ M DAPT)。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第49天(添加后的第11天)利用熒光顯微鏡觀察所述組織，并且利用4%多聚甲醛固定，并且制備冷凍切片。對制備的冷凍切片進行針對恢復蛋白(其是光感受器的標記物基因之一)和Brn3(其是神經節(jié)細胞的標記物基因之一)的免疫染色，并且比較添加和不添加DAPT的情況之間的結果。
[0236]結果，與不添加DAPT時(圖9A)相比，在添加DAPT時(圖9B)，顯著地產生表達GFP的細胞。此外，由冷凍切片的免疫染色的結果發(fā)現(xiàn)，當添加DAPT時，產生約5倍的恢復蛋白陽性的細胞(圖9C，D)。這些結果顯示光感受器的明顯產生。此外，由Brn3的免疫染色的結果發(fā)現(xiàn)，通過添加DAPT，還產生神經節(jié)細胞(圖9E，F(xiàn))。
[0237]實施例9:將由人ES細胞制備的視網膜層特異性神經細胞移植到眼中
[0238]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內壓。利用細胞移植針將眼內灌注液從鞏膜切口注射到視網膜下空間，以人工地形成淺的視網膜脫離狀態(tài)。利用細胞移植針或細胞片移植設備將視網膜層特異性神經細胞移植到形成的空間中。
[0239]實施例10:使用人ES細胞高效地制備視網膜色素上皮
[0240](方法)
[0241]根據“Ueno，M.等 PNAS 2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech 2007” 中所述的方法培養(yǎng)人ES細胞(KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20% KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2-疏基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(InvitiOgen)。為了通過漂浮培養(yǎng)形成視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (InvitiOgen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其懸浮在無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMILON球形板，SUMITOMOBAKELITE C0.，LTD.)，以允許快速形成聚集體，并且進行漂浮培養(yǎng)，37°C ,5% CO20在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。從漂浮培養(yǎng)的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel并進行漂浮培養(yǎng)。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第12天， 將聚集體轉移到不含抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中，以每體積1/10的量加入胎牛血清并培養(yǎng)。從第15天起，在含有作用于Wnt信號途徑的物質(3 μ MCHIR99021)的培養(yǎng)基中進行漂浮培養(yǎng)。
[0242](結果)
[0243]當通過上述方法制備時，視網膜色素上皮群體出現(xiàn)在聚集體的幾乎全部表面上(圖 10)。
[0244]實施例11:使用人ES細胞制備視網膜色素上皮
[0245](方法)
[0246]根據“Ueno, Μ.等 PNAS 2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech 2007” 中所述的方法培養(yǎng)人ES細胞(KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20% KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2-疏基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(InvitiOgen)。為了通過漂浮培養(yǎng)形成視網膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (InvitiOgen)將ES細胞分散為單個細胞，并且將其懸浮在無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中直至每個非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細胞(SUMILON球形板，SUMIT0M0BAKELITE C0.，LTD.)，以允許快速形成聚集體，并且進行漂浮培養(yǎng)，37°C ,5% CO20在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第12天，將聚集體轉移到不含抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中，以每體積1/10的量加入胎牛血清并培養(yǎng)。從第15天起，在含有作用于Wnt信號途徑的物質(3yMCHIR99021)和作用于激活蛋白信號途徑的物質(重組人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems#338-AC) 100ng/ml)的培養(yǎng)基中進行漂浮培養(yǎng)。
[0247](結果)
[0248]當通過上述方法制備時，呈現(xiàn)黑色的視網膜色素上皮出現(xiàn)在幾乎所有聚集體的表面上。此外，幾乎所有聚集體的表面覆蓋有視網膜色素上皮(圖11)，并且以驚人地高的效率產生視網膜色素上皮。
[0249]實施例12:將由人ES細胞制備的視網膜色素上皮移植到眼中
[0250]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內壓。利用細胞移植針將眼內灌注液從鞏膜切口注射到視網膜下空間，以人工地形成淺的視網膜脫離狀態(tài)。利用細胞移植針或細胞片移植設備將視網膜色素上皮移植到形成的空間中。
[0251]工業(yè)實用性
[0252]根據本發(fā)明，可以高效地制備視網膜組織、視杯樣結構、視網膜層特異性神經細胞或視網膜色素上皮。本發(fā)明的制備方法非常有用，因為其有效地制備構成視網膜組織的細胞群(如光感受器和視神經)，以用于化學物質等的毒性或藥物效力評估、細胞治療等，并且有效地制備作為“組織材料”的視網膜組織，其用于以下應用目的的測試和處理:使用具有一定組織結構的視網膜組織的毒性或藥物效力評估，和用于視網膜組織移植治療的移植材料。 [0253]本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?011-258209,2011-258210，2011-258211，2011-258212，2012-043080，2012-043081，2012-043082 和 2012-043083，這
些申請的內容完整地結合于此。
【權利要求】
1.制備視網膜組織的方法，所述方法包括以下步驟(1)至(3): (1)第一步，在含有抑制fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的聚集體， (2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將所述第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，和 (3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將所述第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)。
2.制備視杯樣結構的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Sonichedgehog信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，將通過根據權利要求1所述的方法獲得的視網膜組織進行漂浮培養(yǎng)。
3.制備視網膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中所述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質)，將通過根據權利要求1所述的方法獲得的視網膜組織進行漂浮培養(yǎng)。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述含有作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基還包含作用于激活蛋白信號途徑的物質。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是靈長類多能干細胞。
6.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是人多能干細胞。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述基膜制備物是至少一種選自由以下組成的組的細胞外基質分子:層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述第一步至所述第三步在敲除血清置換物存在下進行。
9.制備視網膜層特異性神經細胞的方法，所述方法包括:使包含在來源于靈長類多能干細胞的視網膜組織中的視網膜先祖細胞接觸抑制Notch信號途徑的物質。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述抑制Notch信號途徑的物質是Y分泌酶活性抑制物質。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其中所述抑制Notch信號途徑的物質是N-[N-(3, 5- 二氟苯乙?；?-L_丙氨?；鵠-S_苯基甘氨酸叔丁酯。
12.根據權利要求9至11中任一項所述的方法，其中所述靈長類是人。
13.根據權利要求9至12中任一項所述的方法，其中所述視網膜層特異性神經細胞是光感受器。
14.根據權利要求9至12中任一項所述的方法，其中所述視網膜層特異性神經細胞是神經節(jié)細胞。
15.根據權利要求9至14中任一項所述的方法，其中所述包含在來源于靈長類多能干細胞的視網膜組織中的視網膜先祖細胞是包含在通過以下步驟制備的視網膜組織中的視網膜先祖細胞: (I)第一步，在含有抑制fct信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基中將靈長類多能干細胞進行漂浮培養(yǎng)以形成靈長類多能干細胞的聚集體，(2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將在所述第一步中形成的聚集體進行漂浮培養(yǎng)， (3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將在所述第二步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)， (4)第四步，在各自含有作用于Sonichedgehog信號途徑的物質和作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，將所述第三步中培養(yǎng)的聚集體進行漂浮培養(yǎng)，以形成視杯樣結構，和 (5)對第四步中形成的視杯樣結構進行漂浮培養(yǎng)的步驟。
16.用于評估毒性或藥物效力的試劑，所述試劑包含通過根據權利要求1至15中任一項所述的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮、或視網膜層特異性神經細胞。
17.用于評估測試物質的毒性或藥物效力的方法，所述方法包括:使通過根據權利要求I至15中任一項所述的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮、或視網膜層特異性神經細胞接觸所述測試物質，并且檢查所述物質對所述組織、結構或細胞的影響。
18.用于由視網膜組織的紊亂所致的疾病的治療劑，所述治療劑包含通過根據權利要求I至15中任一項所述的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮、或視網膜層特異性神經細胞。
19.用于治療由 視網膜組織的紊亂所致的疾病的方法，所述方法包括:移植有效量的通過根據權利要求1至15中任一項所述的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮、或視網膜層特異性神經細胞至需要所述移植的靶標。
20.通過根據權利要求1至15中任一項所述的方法制備的視網膜組織、視杯樣結構、視網膜色素上皮、或視網膜層特異性神經細胞，其用于治療由視網膜組織的紊亂所致的疾病。
【文檔編號】G01N33/50GK103998599SQ201280060865
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權日:2011年11月25日
【發(fā)明者】中野德重, 安藤覺, 笹井芳樹, 永樂元次 申請人:住友化學株式會社, 獨立行政法人理化學研究所